CN112105617B - 一种三唑并嘧啶类化合物的晶型、盐型及其制备方法 - Google Patents

一种三唑并嘧啶类化合物的晶型、盐型及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶类化合物晶型及其制备方法，还包括所述晶型在制备治疗与A2A受体相关疾病药物中的应用。

Description

一种三唑并嘧啶类化合物的晶型、盐型及其制备方法
相关申请的引用
本申请主张如下优先权：
CN201810399876.6，申请日2018-04-28；
技术领域
本发明涉及一种[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶类化合物晶型及其制备方法，还包括所述晶型在制备治疗与A2A受体相关疾病药物中的应用。
背景技术
腺苷A2A受体在人体组织中有广泛的分布，这个受体在脾脏，胸腺，白血球，血小板，GABA型神经元和嗅球等组织器官中有高表达。同时在心脏，肺部，血管，和脑等其他部位中也有表达。腺苷A2A受体一般和其他GPCR共同存在并结合在一起成为异质二聚体，比如A2A受体可以和多巴胺D2，大麻素CB1，谷氨酸mGluR5等形成异质二聚体。腺苷A2A受体在调节血管舒张，支持新血管的形成，保护身体组织免受由炎症引起的伤害等生命活动中有着重要的作用；腺苷A2A受体也影响基底神经节间接通路的活性程度。
在实体瘤中，细胞组织的分解和缺氧的环境造成了ATP大量分解，因此导致细胞外腺苷富集，浓度异常地高，为正常值的10-20倍。高浓度的腺苷和A2A受体的结合会激活腺苷信号通路。这个信号通路是一种在机体组织损伤时通过免疫抑制来保护了机体组织的机制。腺苷信号通路的激活导致了对先天性免疫应答的长期抑制，这种长期抑制会产生免疫耐受性，进而导致恶性肿瘤失去控制的生长腺苷和A2A受体在白血球里(譬如淋巴细胞，T淋巴细胞，自然杀手细胞，树突状细胞等)的结合抑制了这些白血球在免疫系统中应有的效应子功能。腺苷与A2A受体的结合使CD39,CD73和CTLA4(T细胞检查点)的表达增加，从而产生更多的具有更强免疫抑制性的Treg细胞。阻断A2A受体的腺苷信号通路可以减少对免疫系统的抑制作用，增强T细胞的免疫功能，因而被认为是很有希望的能抑制肿瘤生长的负面反馈机制。
发明内容
本发明提供了化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.30±0.2°、16.90±0.2°、22.52±0.2°。
Figure GDA0002706629190000021
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.08±0.2°、11.30±0.2°、14.00±0.2°、16.90±0.2°、18.30±0.2°、22.52±0.2°、23.15±0.2°、25.26±0.2°。
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其XRPD图谱解析数据如表1所示。
表1：化合物1的A晶型XRPD图谱解析数据
Figure GDA0002706629190000022
Figure GDA0002706629190000031
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其差示扫描量热曲线在198.61℃±2℃处具有吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其DSC图谱如图2所示。
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，热重分析曲线在199.80℃±3℃失重达0.4423％。
本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图3所示。
本发明还提供了上述化合物1的A晶型在制备治疗A2A受体相关病症的药物上的应用。
技术效果
化合物1的A晶型性质稳定，吸湿性小，成药前景良好。本发明化合物1的A晶型稳定性好，易于成药；其对肿瘤微环境中高浓度的腺苷和A2A受体结合激活腺苷信号通路起到明显的抑制作用，并通过CT-26小鼠结直肠癌模型发现，化合物1的A晶型对肿瘤的抑制作用显著。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
本发明采用下述缩略词：DMF代表二甲基甲酰胺；Pd(PPh3)4代表四(三苯基膦)钯；EtOH代表乙醇；NaOH代表氢氧化钠；MTBE代表甲基叔丁基醚。
化合物经手工或者
Figure GDA0002706629190000041
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法
大约10～20mg样品用于XRPD检测。
详细的XRPD参数如下：
光管：Cu,kα,
Figure GDA0002706629190000042
光管电压：40kV，光管电流：40mA
发散狭缝：0.60mm
探测器狭缝：10.50mm
防散射狭缝：7.10mm
扫描范围：3或4-40deg
步径：0.02deg
步长：0.12秒
样品盘转速：15rpm
本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法
取样品(0.5～1mg)置于DSC铝锅内进行测试，方法为：25℃–300或350℃，10℃/min。
本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法
取样品(2～5mg)置于TGA铂金锅内进行测试，在25mL/min N2条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从室温到300度或失重20％。
附图说明
图1为化合物1的A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；
图2为化合物1的A晶型的DSC谱图；
图3为化合物1的A晶型的TGA谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
实施例1：化合物c的制备
Figure GDA0002706629190000051
步骤1：
将无水四氢呋喃(24L)加入到50L的高低温夹套反应釜中，称取化合物a(2464.84g,13.58mol,1当量)分批次加入反应釜。通氮气流保护，开启制冷，将反应体系温度降至0℃。用真空减压，将甲基氯化镁的四氢呋喃溶液(6.79L,20.37mol，3.0M,1.50当量)加入到1L的恒压滴液漏斗中，在氮气保护下缓慢滴入反应釜中，控制反应液内温在0-5℃。称取Pd(PPh3)4(315.25g,271.54mmol,0.02当量)，分批次加入到反应釜中。通氮气保护，开启制热，将反应液温度升温至70±5℃搅拌反应16小时。HPLC和LCMS监测反应完全。将反应液冷却至室温，缓慢倒入1500mL冰水中，再往冰水中加入200g氯化铵，搅拌30分钟后过滤，滤液减压浓缩除去大部分溶剂。使用水泵减压，对产品进行减压蒸馏(110℃)，得到黄色液体状的化合物b(1832.91克,收率69.48％)。
LCMS(5-95AB):m/z:162.1[M+1].
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.73(t,J＝7.6Hz,1H),7.48-7.46(d,J＝8.0Hz,1H),7.33-7.31(d,J＝8.0Hz,1H),2.62(s,3H)
步骤2：
将MTBE(4000mL)加入到5L的反应瓶中，称取双联频哪醇硼酸酯(385.81g,1.52mol,0.6当量)加入到反应瓶中，称取4-4’-二叔丁基-2,2’-二联吡啶(6.73g,25.07mmol,0.01当量)和二(1，5-环辛二烯)二-μ-甲氧基二铱(I)(6.73g,10.15mmol,0.004当量)加入到反应瓶中，用氮气置换反应瓶中的空气，反应液在70±5℃下搅拌0.5小时。将化合物b(408.00g,2.53mol,1当量)通过1L恒压滴液漏斗缓慢加入到反应釜中，加料完成后再次用氮气置换反应瓶中的空气。反应液在70±5℃下搅拌反应16小时。HPLC和LCMS监测反应完全。将反应液冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，剩余物用正庚烷：乙酸乙酯＝10:1(3L)溶解。倒入铺有硅胶(100-200目，2.5Kg)的层析柱中，减压抽滤。用乙酸乙酯洗涤硅胶滤饼，减压浓缩滤液得到白色固体状化合物c(567.11克，收率78.01％)。
LCMS(5-95AB):m/z:288.2[M+1].
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83(s,1H),7.70(s,1H),2.65(s,3H),1.37(s,12H).
实施例2：化合物1及其A晶型的制备
Figure GDA0002706629190000061
步骤1：
将甲醇(30L)加入到50L反应釜内，然后在35℃下加入化合物d(3300.08g，20.12mol，1.0当量)，再用甲醇(3L)润洗反应釜周壁上的固体，然后加入98％纯度水合肼(2.99L,60.37mol,3.0当量)，反应体系在35℃并搅拌22.55小时，LCMS和HPLC显示反应完成,将反应液过滤，滤饼收集并干燥，得到化合物e(3402.84g，粗品)为黄色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:160.1[M+1].
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.13(br s,1H),6.35(br s,2H),5.96(s,1H),4.24(brs,2H)
步骤2：
将化合物苄氧乙酸(1.97L,13.74mol,1.02当量)加入50L反应釜内，然后加入四氢呋喃(6L),然后分批缓慢加入N,N-羰基二咪唑(2230.00g,13.74mol,1.02当量)，此时有气泡产生，保持反应瓶口与大气相通，补加四氢呋喃(3L)，在19℃下搅拌了3.17小时，然后分批缓慢在保持30℃下加入e(2150.00g,13.47mol,1当量)，最后反应体系用四氢呋喃(1.75L)润洗周壁化合物，反应在15-16℃下搅拌19.78小时。LCMS和HPLC显示反应基本完成。将反应液浓缩干后，加入已配好的柠檬酸水溶液(300g柠檬酸溶于8L水)，在16℃下搅拌，将混合物过滤，滤饼用甲醇(10L)打浆过滤。收集滤饼并干燥，得到化合物f(2876.00g，收率69.37％)为黄色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:308.2[M+1].
1H NMR(400MHz,d4-MeOH):δ7.47-7.27(m,5H),5.96(s,1H),4.67(s,2H),4.12(s,2H)
步骤3：
在20℃下将化合物六甲基二硅胺烷(18.9L,90.09mol，13.21当量)，N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(16.8L,67.93mol,9.96当量)加入50L反应釜内，然后加入化合物f(2100.00g，6.82mol，1当量)，反应在120℃下搅拌22.77小时，LCMS和HPLC显示反应完成。将反应液降温到20℃，然后关闭搅拌放出反应液，在保持内温15-25℃内将放出的反应液分批缓慢加入反应釜内水(16.8L)和甲醇(16.8L)的混合溶液，随着淬灭进行，有黄色固体生成，过滤，收集滤饼，干燥。得到化合物g(1480.72g，收率为74.90％)为黄色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:290.0[M+1].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.38(br s,2H),7.43-7.23(m,5H),7.03(s,1H),4.68(s,2H),4.61(s,2H).
步骤4：
将化合物g(1080.00g,3.73mol,1.0当量)加入1,4-二氧六环(10.8L)和水(2.16L)然后加入苯硼酸(350.78g，2.88mol，1.05当量)和碳酸钾(757.34g，5.48mol，2.0当量)，在氮气保护下加入催化剂Pd(dppf)Cl2(30.07g,0.04mol,0.015当量)，在氮气保护下外温设定为110℃搅拌16.72小时。LCMS和HPLC显示反应完成，浓缩除去溶剂，然后加入乙酸乙酯：正庚烷：水(600ml：600ml：600ml)在搅拌下打浆过滤，滤饼用500ml水洗涤一次，干燥滤饼。得到化合物h(1501.41g，粗品)为黑棕色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:332.2[M+1].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12-8.15(m,2H),8.00(br s,2H),7.58-7.43(m,4H),7.42-7.27(m,5H),4.73(s,2H),4.66(s,2H)
步骤5：
盐酸(10.5L)加入到化合物h(1500.00g,4.53mol,1.0当量)中，在40℃下搅拌29.13小时，LCMS和HPLC显示反应基本完成。反应液过滤，干燥滤饼，母液用氢氧化钠固体在冰水下调节pH到7-8，在搅拌下有固体析出，过滤，干燥滤饼。滤饼合并，得到化合物i(1160.00g，粗品)为黄色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:242.2[M+1].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.10-8.14(m,2H),7.94(br s,2H),7.54-7.39(m,4H),5.60(br s,1H),4.66(s,2H)
步骤6:
将化合物i(400.90g,1.66mol,1.0当量)加入N,N-二甲基甲酰胺(2L)然后加入N-碘琥珀酰亚胺(560.00g，2.49mol，1.5当量)到3L三口瓶中，在10℃下搅拌44.47小时，LCMS和HPLC显示反应完成。将反应液加入到水(6L)中有大量固体中搅拌过滤，滤饼用水(1L)洗涤一下。干燥滤饼，得到化合物j(652.22g，粗品)为黄棕色固体化合物。
LCMS(5-95AB):m/z:368.1[M+1].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(br s,2H),7.61-7.56(m,2H),7.51-7.43(m,3H),5.63(brs,1H)，4.66(s,2H)。
步骤7:
将j(250.00g,680.94mmol,1.0当量)溶于1,4-二氧六环(2.5L)和水(0.5L)中，然后再依次加入c(254.98g,888.15mmol,1.2当量)和磷酸钾(289.08g，1.36mol，2当量)，在氮气的保护下加入1,1-双(二叔丁基膦)二茂铁二氯化钯(13.31g,20.42mmol,0.03当量)，升温至110℃，反应16小时。取样送LCMS和HPLC显示反应完成。反应液减压浓缩干，固体用乙酸乙酯(2.0L)和水(3.0L)萃取，每次用乙酸乙酯萃取(2.0L)萃取四次，合并有机相，然后加5.0L正庚烷搅拌均匀，化合物溶液用硅胶(3Kg 200～300目)过滤，再配20L洗涤剂(乙酸乙酯：15L,正庚烷5L)洗涤滤饼，合并滤液旋干。将旋干后固体加入到1.0L乙酸乙酯中，加热到75℃使其完全溶解，保持温度不变，慢慢滴加正庚烷(3.0L)有白色固体析出，冷却到20℃过滤。将固体加入到0.5L乙醇中，加热到75℃使其完全溶解，保持温度不变，慢慢滴加水(3.6L)有白色固体析出，冷却到30℃过滤，固体加入到0.9L乙醇中，加热到75℃使其完全溶解，保持温度不变，慢慢滴加水(2.0L)有白色固体析出，冷却到30℃过滤，将固体烘干得到化合物1的A晶型(150.09g，收率：55％)。
LCMS(10-80AB):m/z:401.2[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(br s,2H),7.56(s,1H)，7.24-7.44(m,6H)，5.56(t,J＝6.0Hz,1H)，4.66(d,J＝6.0Hz,2H),2.48(3H,s)
实验例1：化合物1的A晶型溶解度测定
平行称量多份大约2.0mg的化合物1的A晶型放入玻璃小瓶，逐步少量加入表2中所列的各种单一溶剂或混合溶剂，不断振摇，观察化合物的溶解情况。根据所称称量化合物的重量和加入的对应溶剂体积来计算化合物的溶解度。详细结果见表2。
表2化合物1的A晶型溶解度结果
Figure GDA0002706629190000091
Figure GDA0002706629190000101
注：S代表溶解度
结论：化合物1的A晶型在上述溶剂中有良好的溶解度。
实验例2：体外活性测试实验
人类腺苷A2a受体钙流检测实验
细胞来源：
A2a稳定细胞株由上海药明康德构建，宿主细胞CHO。
检测试剂盒：
Fluo-4 Direct试剂盒,(Invitrogen,货号F10471)。在试剂盒中的荧光检测试剂(与钙离子特异性结合并引起荧光信号的增加)与细胞孵育适当时间后，加入化合物刺激细胞引起胞内钙流发生变化，从而引起荧光信号的变化，可以反映出化合物的激动或抑制活性的强弱。
细胞培养基：
F12+10％胎牛血清+遗传霉素300ug/ml+杀稻瘟菌素2ug/ml
化合物稀释缓冲液：
Hanks平衡盐缓冲液(Invitrogen)+20mM HEPES，每次使用前配置
激动剂：
NECA(Sigma-E2387)
参考化合物(拮抗剂)：
CGS-15943(Sigma-C199)
化合物稀释：
待测化合物用DMSO溶解配制成10mM母液。待测化合物用DMSO稀释成0.2mM，参考化合物CGS-15943用DMSO稀释成0.015mM。接着用ECHO进行10个点3倍连续稀释，转移900nl到化合物板(Greiner-781280)中，加入30ul化合物稀释缓冲液。待测化合物最终起始浓度为1uM，CGS-15943为0.075μM。
测定方法：
细胞准备：
取冻存的A2A细胞，复苏之后用培养基重悬至1x106个/ml，20μl/孔种入384孔多聚赖氨酸包被细胞板(Greiner-781946)，5％CO2，37℃培养箱孵育过夜。
将前一天准备好的细胞板从培养箱中取出，每孔加入20ul 2X Fluo-4DirectTM缓冲液，5％CO2，37℃培养箱孵育50分钟，室温放置10分钟。
激动剂NECA的EC80测定：
激动剂NECA稀释：将起始浓度为0.15mM的NECA用Echo进行10个点3倍连续稀释，接着转移900nL至相应化合物板；然后加30μl化合物稀释缓冲液至相应的化合物板。最终起始浓度为750nM。
运行FLIPR仪器软件，按照设定程序，添加10μl化合物稀释缓冲液到细胞板中，读取荧光信号。再添加10μl既定浓度的激动剂参考化合物到细胞板中，读取荧光信号。读数后，通过软件中“Max-Min”，“Read 90to Maximum allowed”方法导出数据，计算A2A细胞系的EC80，准备6X EC80浓度的激动剂。用缓冲盐溶液配制相应细胞6X EC80浓度的参考化合物激动剂，30ul/孔添加至相应的化合物板，备用。
待测化合物的IC50测定：
运行FLIPR仪器软件，按照设定程序，添加10μl既定浓度的检测化合物及参考化合物到细胞板中，读取荧光信号。再添加10μl 6X EC80浓度的参考化合物激动剂到细胞板中，读取荧光信号。对于化合物的激动剂检测，通过软件中“Max-Min”，“Read 1to 90”方法导出数据。对于化合物的拮抗剂检测，通过软件中“Max-Min”，“Read 90to Maximum allowed”方法导出数据。数据用GraphPad Prism 5.0进行数据分析，计算待测化合物的IC50值。
表3化合物1体外筛选实验结果
化合物编号 IC<sub>50</sub>值(nm)
化合物1 0.65
结论：如表3中所示，化合物1表现出优异的腺苷A2a受体拮抗活性。
实验例3：化合物药代动力学评价
实验目的：测试化合物在雌性Balb/c小鼠体内药代动力学
实验材料：
Balb/c小鼠(雌性,15-30g,7～9周龄，上海灵畅)
实验操作：
以标准方案测试化合物静脉注射及口服给药后的啮齿类动物药代特征，实验中候选化合物配成澄清溶液给予小鼠单次静脉注射及均一混悬液给予小鼠单次口服给药。静注溶媒5％DMSO/95％10％Cremophor EL，口服溶媒为1％吐温80,9％PEG400,90％水。收集24小时内的全血样品，在4度下3000g离心15分钟，分离上清得血浆样品，加入20倍体积含内标的乙腈溶液沉淀蛋白，离心取上清液加入等倍体积的水再离心取上清进样，以LC-MS/MS分析方法定量分析血药浓度，并计算药代参数，如达峰浓度，达峰时间，清除率，半衰期，药时曲线下面积，生物利用度等。
实验结果：
表4药代动力学测试结果
Figure GDA0002706629190000121
结论：化合物1表现出优异小鼠药代动力学指标。
实验例4：化合物1晶型A在CT-26模型的体内药效研究
实验材料：
BALB/c裸鼠，雌性，7周，体重约16-20克，将小鼠保持在SPF级动物房饲养的环境中，且在单个通风笼中(5只小鼠每笼)。所有的笼子，铺垫和水在使用前进行消毒。所有的动物都可以自由获取标准认证的商业实验室饮食。共有80只购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。抗PD-1抗体购买于BioXcell，克隆为RMP-14，货号为BP0146。将0.1mL 3×105个CT26细胞皮下接种于每只小鼠的右后背，随机分组给药。
实验方法：
皮下接种CT26细胞于每只小鼠的右后背BALB/c裸小鼠上进行体内药效。实验将受试化合物每日口服给药，连续给药22天，anti-PD-1抗体每周给药一次，连续三周。肿瘤体积一周两次用二维卡尺测量，体积以立方毫米计量，通过以下公式计算：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。抗肿瘤药效是通过用化合物处理过的动物的平均肿瘤增加体积除以未处理过动物的平均肿瘤增加体积来确定。(BID表示每日两次)
实验结果：见表5。
表5
Figure GDA0002706629190000131
实验结论：
化合物1的A晶型(50mg/Kg,BID)单药具有抑瘤效果；化合物1的A晶型(50mg/Kg,BID)与anti-PD-1(5mg/Kg,QW)联用有比较显著联合抑瘤效果。

Claims (10)

1.化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.30±0.2°、16.90±0.2°、22.52±0.2°，
Figure FDA0002706629180000011
2.根据权利要求1所述化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.08±0.2°、11.30±0.2°、14.00±0.2°、16.90±0.2°、18.30±0.2°、22.52±0.2°、23.15±0.2°、25.26±0.2°。
3.根据权利要求2所述化合物1的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述化合物1的A晶型，其差示扫描量热曲线在198.61℃±2℃处具有吸热峰的起始点。
5.根据权利要求4所述化合物1的A晶型，其DSC图谱如图2所示。
6.根据权利要求1～3任意一项所述化合物1的A晶型，热重分析曲线在199.80℃±3℃失重达0.4423％。
7.根据权利要求6所述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图3所示。
8.根据权利要求4所述化合物1的A晶型，热重分析曲线在199.80℃±3℃失重达0.4423％。
9.根据权利要求8所述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图3所示。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的化合物1的A晶型在制备治疗A2A受体相关病症的药物上的应用。
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