CN112098657A - 一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用及用于鉴别的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI中的一种及以上组合；通过iTRAQ技术检测血清中是否存在所述血清差异蛋白，并结合MRM技术检测验证所述差异蛋白的浓度变化量。本发明还公开了一种用于鉴别猪感染弓形虫的检测试剂盒，包括检测上述血清差异蛋白的抗体、磷酸盐缓冲液、ELISA 96孔板。利用本发明可快速、准确鉴别猪是否感染弓形虫，采用本发明提供的血清差异蛋白作为弓形虫病检测标志物具有客观性、特异性和准确性特点，且具有极大的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于猪感染弓形虫诊断蛋白标志物领域，具体涉及一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用及用于鉴别的检测试剂盒。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可在多种动物如牛、羊、猪、鸡、猫等传播，目前防控该病主要以控制传染源与加强疾病诊断为主，尚无理想的药物和疫苗。该病在家畜如猪的发病率和病死率均很高，其常规诊断以实验室检查为主，包括病原体和血清学检查，病原学检查主要以动物内脏组织做涂片或动物接种后查腹腔液虫体，发现病原体后确诊，此法稳定可靠，但费时费力，检出率低；血清学方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IHA)以及间接免疫荧光抗体试验(IFA)，PCR检测等，操作简便，快捷，但特异性和敏感性不高，且易产生假阳性。该病的早期诊断对于畜牧生产具有重要的经济与社会意义。因此，在动物活体上建立快速、准确的弓形虫感染检测方法，是目前亟待解决的重要课题。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用及用于鉴别的检测试剂盒，与现有方法相比，能够快速、准确鉴别猪是否感染弓形虫，且具有客观性、特异性和准确性特点。
为达到上述目的，本发明公开一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI中的一种及以上组合；通过iTRAQ技术检测血清中是否存在所述血清差异蛋白，并结合MRM技术检测验证所述差异蛋白的浓度变化量。
优选地，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段。
优选地，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI五种组合。
本发明还公开了一种用于鉴别猪感染弓形虫的检测试剂盒，包括检测上述血清差异蛋白的抗体、磷酸盐缓冲液、ELISA 96孔板。
进一步地，所述抗体通过表达和纯化所述血清差异蛋白并免疫动物获得免疫血清，再通过纯化所述免疫血清中的抗体而获得。
本发明有益效果如下：通过本发明提供的血清差异蛋白作为弓形虫病检测标志物，基于iTRAQ技术标记蛋白质组结合MRM技术检测血清差异蛋白的浓度变化量，能够快速、准确鉴别猪是否感染弓形虫，结果具有客观性、特异性和准确性特点，且具有极大的市场前景。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
本发明公开一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI中的一种及以上组合；通过iTRAQ技术检测血清中是否存在所述血清差异蛋白，并结合MRM技术检测验证所述差异蛋白的浓度变化量。
优选地，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段。
优选地，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI五种组合。
通过iTRAQ技术检测猪感染弓形虫与健康对照差异蛋白，检测结果发现猪感染弓形虫例组与健康对照组蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达上调的蛋白质点5个：弓形虫表面膜蛋白，HF蛋白，液泡蛋白，凝溶胶蛋白，载脂蛋白CI。
本发明还公开了一种用于鉴别猪感染弓形虫的检测试剂盒，包括检测所述血清差异蛋白的抗体、磷酸盐缓冲液、ELISA 96孔板。
进一步地，所述抗体通过表达和纯化所述血清差异蛋白并免疫动物获得免疫血清，再通过纯化所述免疫血清中的抗体而获得。
这里，所述抗体还可通过商业途径获得，也可通过常规抗体制备方法获得。
使用本发明检测试剂盒来鉴别猪是否感染弓形虫，采集血清样本，按照ELISA方法，将血清样本加入96孔板，并通过显色计算OD值，按照OD值＝(样本OD-空白对照OD)/阴性对照OD)>2.1为阳性。
若检测样本中抗体阳性，则结果可判为该病例为猪感染弓形虫。
血液由于采样方便且能较好反映机体病理生理过程而成为疾病标志物的最好来源。但是要寻找特异性和准确性高，能用于临床检测的血液蛋白标志物有一定难度，通过本发明提供的血清差异蛋白作为弓形虫病检测标志物，基于iTRAQ技术标记蛋白质组结合MRM技术检测血清差异蛋白的浓度变化量，可快速、准确鉴别猪是否感染弓形虫，结果具有客观性、特异性和准确性特点，且具有极大的市场前景。
实施例
一、iTRAQ技术检测猪感染弓形虫与健康对照差异表达蛋白
1、检测样本
来自于江苏某地弓形虫感染猪血清、健康猪血清各20例。清晨空腹采集2mL全血，4℃静置1～2h待血液凝固析出血清，3000g离心10min，收集上清液，冰上分装后存至-80℃备用。
2、检测方法
(1)使用Proteominer试剂盒去除血清中的高丰度蛋白：向富集好的蛋白样品加入终浓度10mM的DTT(二硫苏糖醇)，56℃水浴1h；冷却至室温后，加入终浓度55mM的IAM(碘代乙酰胺)，暗室放置45min；加1mL冷丙酮沉淀过夜，25000rpm 4℃离心15min弃上清液；简单风干沉淀残余丙酮，加适量Lysis Buffer 3(裂解缓冲液)，冰浴超声5min，25000rpm4℃离心15min取上清液，定量，电泳。Bradford法定量，用酶标仪测量OD595，依据OD595与蛋白浓度制作线性标准曲线。稀释待测蛋白质溶液若干倍，在20μl蛋白溶液中加入180μl定量磷酸盐缓冲液，读取OD595。依据标准曲线以及样品OD595计算样品蛋白浓度。
(2)蛋白酶解：取200μg蛋白溶液(已烷基化处理)加入到10KDa的超滤管中，20℃12000rpm离心20min，直至蛋白液全部离心至收集管底部，去底部溶液，超滤管中再加入0.5M TEAB 100μl，同上离心操作。重复此步骤3次，更换新的收集管。在超滤管中加入50μl0.5M的TEAB，按照蛋白：酶＝40:1的比例加入Trypsin酶，使用Parafilm(封口膜)将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜；12000rpm离心15min后，再加入100μl 0.5M的TEAB，12000rpm离心20min，收集管中溶液即酶解后肽段溶液。转出收集管底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。
(3)肽段标记：取出一定量iTRAQ标签试剂，待试剂恢复至室温后，每管试剂加入50μl异丙醇，涡旋震荡后低速离心，用0.5M TEAB溶解肽段样品，并加入到对应iTRAQ标签试剂中，iTRAQ试剂113、118标记为病例组，119、121标记健康对照组，室温静止2小时。
(4)采用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为5um 4.6×250mm Gemini C18柱对样品进行液相分离。用2mL流动相A(5％ACN pH9.8)复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/min的流速梯度洗脱：5％流动相B(95％CAN，pH9.8)10min，5％至35％流动相B 40min，35％至95％流动相B1min，流动相B持续3min，5％流动相B平衡10min。在214nm波长下检测洗脱峰并每分钟收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到10个组分，然后冷冻抽干。
(5)经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific,an Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1600m/z；分辨率设置为70000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率17500。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为15s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。
(6)质谱数据采用通过Mascot和PD软件对实验中所得到的质谱数据与生物信息数据库在人类Uniprot数据库进行检索并定量分析进行比对，得到可信的蛋白质定量以及定性结果。
3、检测结果
2个上机重复合并分析，质谱共鉴定到631个蛋白，利用113，114，118，119，120，121进行标记时，其中≥2个unique肽段蛋白607个蛋白，鉴定过滤标准：PSM和Protein水平FDR≤1％。根据鉴定的蛋白质丰度比分布达到严格定量标准(log2比值≥0.6)的蛋白数：猪感染弓形虫例组与正常对照组蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达上调的蛋白质点5个。
表1弓形虫感染猪与健康对照的血清差异蛋白
| 蛋白质名 | 蛋白质序列号 | 表达变化 | 变化倍数 |
| HF蛋白 | Q14006 | 上调 | 30.85249 |
| 液泡蛋白 | Q96RL7 | 上调 | 25.35906 |
| 凝溶胶蛋白 | B7Z2X4 | 上调 | 14.3146 |
| 载脂蛋白CI | A0A024R0T8 | 上调 | 11.11544 |
二、质谱MRM在猪感染弓形虫病中的验证
1、检测样本
来自于江苏某猪场感染弓形虫血清、健康猪血清各20例。清晨禁饲采集2mL全血，4℃静置1～2h待血液凝固析出血清，3000g离心10min，收集上清液，冰上分装后存至-80℃备用。
2、检测方法
实验方法的建立：
(1)挑选适合于进行MRM检测分析的相关靶蛋白；
(2)对所提取的蛋白进行质量评估；
(3)挑选适合于MRM检测的母子离子对；
(4)基于分析软件Skyline对质谱仪扫描参数—碰撞能量进行优化；
(5)对所得到的检测数据进行质量评估和分析。
样本分析：
(1)血清蛋白酶解：每个样品取12.5μg，合并为两管病例组和健康对照组，每管中加入0.1μg/μl的BSA作为内参。用超滤管，取蛋白液，离心20min，去底部溶液，加入100μlTEAB，同上离心操作，重复步骤3次，更换新的收集管，在超滤管中加入50μl 0.5M的TEAB，按照40:1的比例加入胰蛋白酶，用parafilm将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜。12000rpm离心15min。加入50μl二次蒸馏水(两次)12000rpm离心20min收集，再加入100μl TEAB，12000rpm离心20min，收集管中即酶解后肽段溶液，转出收集管中底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。
(2)MRM实验方法：将制备好的样品按照以下色谱质谱的参数设置进入液相系统SHIMADU Prominence HPLC和AB SCIEX5500质谱仪进行分析。仪器参数的设置如下：离子喷射电压：2300，进样体积：4μl，碰撞能量：软件依据母子离子对信息自动计算。时间：60.028min，单个循环时间：3.7518sec，液相设置：流速：0.3μl/min，流动相A液：98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；流动相B液：2％水，98％乙腈，0.1％甲酸。
(3)Skyline软件中肽段选择的参数设置：蛋白质组背景库：uniprot human；酶：Trypsin；最大漏切数：0；氨基酸数目：8～25；排除N末端氨基酸的个数：25；排除含有如下氨基酸的肽段：Cys Met；排除潜在的漏切末端：KK KR RK RR；结构修饰：Carbamidomethyl(C)；最大可变修饰数：3；最大中性丢失数目：1；母离子电荷数：2，3；子离子电荷数：1；离子类型：b，y；离子相符耐受度：0.5Th；质荷比范围：50Th～1200Th；每针最大离子数目：300；驻留时间：8ms。
(4)数据分析：用BSA(HLVDEPQNLIK)肽段的积分峰面积进行样品测定的标准化，通过比较不同组之间某蛋白的积分峰面积差异，从而确定某蛋白在不同情况下表达量的相对变化。
3、结果
MRM技术对样品进行验证：综合iTRAQ筛选结果，MRM候选标志物的验证主要集中在iTRAQ差异表达蛋白的5个蛋白，并对这5个蛋白进行靶标验证，在挑选适合用于代表蛋白的高质量跃迁，且首要满足的条件就是能在质谱中响应出足够的信号强度，信噪比相对较高，能够呈现出峰形一致的峰簇。按照这一标准进行过滤，在对样本进行MRM实验以后，删掉了一些信噪比相对不好，质谱信号不稳定的子离子，最后得到含有对应5个蛋白的45个唯一肽段的母子离子对列表，并对5种蛋白在两组间样本中进行相对定量得到的MRM丰度(峰面积)进行差异倍数的比较。对MRM显著差异蛋白的标准，进行设定，要求差异倍数大于等于2倍，且p-value值小于0.05。
结果发现猪感染弓形虫组与健康猪群组比较的差异蛋白有5种，弓形虫表面膜蛋白；HF蛋白，蛋白序列号为Q14006；液泡蛋白，蛋白序列号为Q96RL7；凝溶胶蛋白，蛋白序列号为B7Z2X4；载脂蛋白CI，蛋白序列号为A0A024R0T8。
综上所述，本发明通过对来自于猪感染弓形虫血清、健康猪血清进行比较验证，寻找到了各组血清蛋白中差异表达的蛋白质，从而确定了所建立的蛋白标志物组的准确性与意义。
三、血清蛋白标志物组制备的检测试剂盒
试剂盒的组成：
试剂A：检测任意一种血清差异蛋白的抗体；
试剂B：磷酸盐缓冲液；
C：ELISA 96孔板。
在具体实施方案中，可采用以下步骤使用此试剂盒鉴别弓形虫感染猪：
(1)血清样本新鲜获取并保存于-80℃冰箱；
(2)血清样本按照原液、磷酸盐缓冲液5倍稀释、磷酸盐缓冲液10倍稀释分为三管；
(3)将抗体滴加1μl至96孔板中进行包被；
(4)按照ELISA方法，将血清样本加入96孔板，并通过显色计算OD值，按照OD值＝(样本OD-空白对照OD)/阴性对照OD)>2.1为阳性。
若检测样本中抗体阳性，则结果可判为该病例为猪感染弓形虫。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。
Claims (5)
1.一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，其特征在于，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI中的一种及以上组合；通过iTRAQ技术检测血清中是否存在所述血清差异蛋白，并结合MRM技术检测验证所述差异蛋白的浓度变化量。
2.根据权利要求1所述的一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，其特征在于，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段。
3.根据权利要求1所述的一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用，其特征在于，所述血清差异蛋白为弓形虫表面膜蛋白的片段、HF蛋白、液泡蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白CI五种组合。
4.一种用于鉴别猪感染弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述血清差异蛋白的抗体、磷酸盐缓冲液、ELISA 96孔板。
5.根据权利要求2所述的一种用于鉴别猪感染弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体通过表达和纯化所述血清差异蛋白并免疫动物获得免疫血清，再通过纯化所述免疫血清中的抗体而获得。
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| CN202010970966.3A CN112098657A (zh) | 2020-09-16 | 2020-09-16 | 一组血清差异蛋白在制备用于检测猪感染弓形虫的试剂中的应用及用于鉴别的检测试剂盒 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 易岚 主编: "《医学生物学》", 31 August 2018, 华中科技大学出版社 * |
| 郝福星等: "猪弓形虫感染的血清肽谱诊断法建立及初步应用", 《江苏农业科学》 * |
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