CN112098531A - 一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法 - Google Patents

一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明关于苦乐果成分含量测定技术领域，尤其涉及一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法。该含量测定方法为高效液相色谱法，通过对供试品溶液制备方法及色谱条件的优化，建立了检测苦乐果双黄酮类成分的定量分析方法，其准确性好、灵敏度高、稳定性好、操作简便，可应用于后续苦乐果中双黄酮类化合物含量测定研究。

Description

一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法
技术领域
本发明关于苦乐果成分含量测定技术领域，尤其涉及一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法。
背景技术
苦乐果是藤黄属苦乐果树(Garcinia kola Heckel)干燥成熟的种子，在非洲传统医学中具有重要作用，主要用于治疗高血压、腹泻、咳嗽、支气管炎、胃炎、性病以及疟疾等疾病。化学研究表明，苦乐果中主要含有黄酮类、树脂类、单宁类、皂苷类、生物碱类、强心苷类成分，其中双黄酮成分是苦乐果中主要成分具有抗肝毒性、放射性保护、血管扩张、降糖、降脂、胃保护等作用。
苦乐果应用广泛，但目前仅对苦乐果原料药、相关制剂指纹图谱的建立等有相关报道，对其主要成分研究较少，而现有技术无法对苦乐果中双黄酮类成分进行定量分析，因此无法为苦乐果中双黄酮类化合物的后续相关研究提供参考。
发明内容
针对现有技术无法定量分析苦乐果中双黄酮类成分的问题，本发明提供一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，用甲醇水溶液对苦乐果进行提取，用高效液相色谱法进行含量测定，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：C18键合硅胶色谱柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相B为乙腈，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述洗脱梯度如下：
Figure BDA0002621119550000021
检测波长为290～294nm；
柱温为38～42℃；
流速为0.8～1.2mL/min。
本发明所提供的含量检测方法能简单、快速、准确地测定苦乐果中双黄酮类成分的含量，且该方法准确性好、灵敏度高、稳定性好，可用于苦乐果中双黄酮类化合物后续含量测定等相关研究。
其中梯度洗脱具体是表示：0min～14min，流动相A的体积百分比由77％匀速降至68％，14min～17min流动相A的体积百分比由68％匀速降至63％。
优选地，所述双黄酮类成分包括GB-2、GB-1、kolaflavanone和GB-1a，其中所述GB-2的化学结构式如式(I)所示，所述GB-1的化学结构式如式(Ⅱ)所示，所述GB-1a的化学结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure BDA0002621119550000022
Figure BDA0002621119550000031
优选地，所述检测波长为292nm；
柱温为40℃
优选地，用甲醇水溶液对苦乐果进行提取的具体操作为：用50～70％甲醇水溶液(v/v)对苦乐果粉末超声提取。进一步优选用50％甲醇水溶液(v/v)对苦乐果粉末超声提取。
优选地，所述超声提取的功率为460～500W，频率为33～37kHz；所述超声提取的时间为10～30min。
可选地，所述超声提取的功率为480W，频率为35kHz；所述超声提取的时间为20min。
优选地，所述苦乐果粉末与所述甲醇水溶液的质量体积比为0.3:25～50(g:mL)，进一步优选为0.3:25(g:mL)。
优选地，所述含量测定方法包括以下步骤：
步骤a、用甲醇水溶液对苦乐果粉末进行提取，得到供试品溶液；
步骤b、配制双黄酮类成分的对照品溶液；
步骤c、用所述高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行测定，用外标法计算所述供试品溶液中所述双黄酮类成分的含量。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1中对照品溶液的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，包括如下步骤：
步骤a、供试品溶液的制备
取待测苦乐果粉末约0.3g，精密称定，置25mL容量瓶中，加适量50％甲醇水溶液(v/v)，超声处理(功率480W，频率35kHz)20min，取出，放冷至室温，用50％甲醇水溶液(v/v)定容至刻度线，摇匀，取适量提取液14000rpm离心10min，采用移液管精密移取2mL上清液置于25mL容量瓶中，加入50％甲醇水溶液(v/v)定容至刻度线，摇匀，得供试品溶液。
步骤b、对照品溶液的制备
分别取GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度为154.4μg/mL GB-2、211.8μg/mL GB-1、59.20μg/mL Kolaflavanone、23.69μg/mL GB-1a的混合对照品溶液。
步骤c、用Waters e2695高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法对上述对照品溶液和供试品溶液进行测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6×100mm，5μm)；
柱温：40℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：292nm；
流动相：0.1％甲酸水溶液(v/v)(A)–乙腈(B)；
梯度洗脱条件为：
Figure BDA0002621119550000051
对照品溶液的高效液相色谱图如图1所示；
供试品溶液的高效液相色谱图如图2所示。
采用外标法计算样品中双黄酮类成分的含量，公式如下：
Figure BDA0002621119550000052
其中，w为待测苦乐果粉末中双黄酮类成分的含量，单位为mg/g；
Cs为双黄酮类成分对照品溶液的浓度，单位为mg/mL；
An为供试品中双黄酮类成分的峰面积；
As为双黄酮类成分对照品溶液的峰面积；
Wn为待测苦乐果粉末的实际称样量。
检验例
本发明实施例提供了实施例1中苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法的方法学考察：
(1)线性关系和检测限研究
按照实施例1中步骤b的方法制备苦乐果混合对照品溶液，逐级稀释成系列不同浓度混合对照品溶液，采用高相液相色谱法进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。平行进样2次，以各化合物对照品浓度为横坐标x(μg/mL)，相应的对照品峰面积为纵坐标y，绘制回归方程；以信噪比S/N 3为检测限(LOD)、S/N 10为定量限(LOQ)测定GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的检测限和定量限，结果见表1。
表1苦乐果中双黄酮类成分的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限
Figure BDA0002621119550000061
由表1可知，4个双黄酮类成分在各自的浓度范围内线性关系良好(r2≥0.9999)，且LOD均小于0.0308μg/mL，LOQ均小于0.0925μg/mL，表明本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法灵敏度高。
(2)精密度试验
(a)日内精密度试验
按照实施例1中步骤a的方法制备苦乐果供试品溶液，精密吸取同一份上述供试品溶液，重复进样6次，采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。以双黄酮类成分GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的峰面积计算RSD值，结果见表2。
表2苦乐果双黄酮类成分峰面积的日内精密度试验结果(n＝6)
Figure BDA0002621119550000062
由表2可知，本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法的日内精密度RSD值为0.3～0.4％。
(b)日间精密度试验
按照实施例1中步骤a的方法制备苦乐果供试品溶液，连续3天，每天精密吸取同一份上述供试品溶液，重复进样6次，采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。以外标法计算双黄酮类成分GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的含量并计算RSD值，结果见表3。
表3苦乐果双黄酮类成分含量测定的日间精密度试验结果(n＝3)
Figure BDA0002621119550000071
由表3可知，本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法的日间精密度RSD值为0.7～0.8％。
由表2和表3可知，本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法精密度良好。
(3)重复性试验
按照实施例1中步骤a的方法平行制备6份苦乐果供试品溶液，采用高效液相色谱法对上述供试品溶液进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。以外标法计算双黄酮类成分GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的含量并计算RSD值，结果见表4。
表4苦乐果双黄酮类成分含量测定研究重复性试验结果(n＝6)
Figure BDA0002621119550000072
Figure BDA0002621119550000081
由表4可知，在该实施例中GB-2含量为20.92mg/g、GB-1含量为28.90mg/g、kolaflavanone含量为7.886mg/g、GB-1a含量为3.141mg/g；本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法的重复性试验RSD值为1.6～2.0％，说明该检测方法重现性良好。
(4)稳定性试验
按照实施例1中步骤a的方法制备苦乐果供试品溶液，在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、10、12h精密吸取同一份上述供试品溶液，通过高效液相色谱法对上述供试品溶液进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。以双黄酮类成分GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的峰面积计算RSD值，结果见表5。
表5苦乐果双黄酮类成分的稳定性试验结果(n＝7)
Figure BDA0002621119550000082
由表5可知，本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法的稳定性试验RSD值为0.7％，说明该供试品溶液在常温条件下12h内稳定性良好。
(5)加样回收率试验
取苦乐果粉末约0.15g，精密称定，准确加入与样品中各成分质量相当的双黄酮类成分的对照品溶液，按照实施例1中步骤a的方法制备6份苦乐果供试品溶液，每份样品平行测定2次，采用高效液相色谱法对上述供试品溶液进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤c。根据加样回收率公式计算双黄酮类成分GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a的加样回收率及RSD值，考察该方法的准确性。
加样回收率公式如下：
Figure BDA0002621119550000091
结果见表6。
表6苦乐果双黄酮类成分的加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0002621119550000092
Figure BDA0002621119550000101
由表6可知，本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法的加样回收率在98.31～99.89％范围内，且RSD均小于等于2.4％，说明各化合物加样回收率良好，该方法准确可行。
由表1～6可知通过本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法符合含量测定方法学研究要求，可以用于苦乐果样品的定量分析。
实施例2
本发明实施例提供了一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法在测定不同批次苦乐果中双黄酮类成分含量中的应用。
(1)对照品溶液的制备
同实施例1中的“对照品溶液的制备”方法。
(2)供试品溶液的制备
取10批次(B1～B10)苦乐果样品，按照实施例1中的“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液。
(3)采用高效液相色谱法对上述对照品溶液和供试品溶液进行测定，并利用外标法计算供试品中双黄酮类成分的含量，色谱条件同实施例1中的高效液相色谱条件。
不同批次苦乐果样品中双黄酮类成分含量测定结果如表7所示。
表7 10批苦乐果双黄酮类成分含量
Figure BDA0002621119550000111
由表7可知，通过本发明提供的苦乐果中双黄酮类成分的定量分析方法研究不同批次苦乐果样品中GB-2、GB-1、kolaflavanone、GB-1a化学成分的含量，其中10批次苦乐果样品中，GB-2含量为19.75～25.34mg/g，平均值为21.82mg/g；GB-1含量为23.46～33.11mg/g，平均值为28.63mg/g，kolaflavanone含量为7.635～10.90mg/g，平均值为9.092mg/g；GB-1a含量为2.307～3.389mg/g，平均值为2.961mg/g，不同批次苦乐果中4个成分含量平均值在2.961～28.63mg/g之间，表明苦乐果各双黄酮类成分间含量差异较大。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，用甲醇水溶液对苦乐果进行提取，用高效液相色谱法进行含量测定，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：C18键合硅胶色谱柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相B为乙腈，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述洗脱梯度如下：
Figure FDA0002621119540000011
检测波长为290～294nm；
柱温为38～42℃；
流速为0.8～1.2mL/min。
2.根据权利要求1所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述双黄酮类成分包括GB-2、GB-1、kolaflavanone和GB-1a，其中所述GB-2的化学结构式如式(I)所示，所述GB-1的化学结构式如式(Ⅱ)所示，所述GB-1a的化学结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure FDA0002621119540000012
Figure FDA0002621119540000021
3.根据权利要求1所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述检测波长为292nm；和/或
柱温为40℃。
4.根据权利要求1所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，用甲醇水溶液对苦乐果进行提取的具体操作为：用50～70％甲醇水溶液(v/v)对苦乐果粉末超声提取。
5.根据权利要求4所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，用50％甲醇水溶液(v/v)对苦乐果粉末超声提取。
6.根据权利要求4所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述超声提取的功率为460～500W，频率为33～37kHz；所述超声提取的时间为10～30min。
7.根据权利要求6所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述超声提取的功率为480W，频率为35kHz；和/或
所述超声提取的时间为20min。
8.根据权利要求4所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述苦乐果粉末与所述甲醇水溶液的质量体积比为0.3:25～50(g:mL)。
9.根据权利要求8所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述苦乐果粉末与所述甲醇水溶液的质量体积比为0.3:25(g:mL)。
10.根据权利要求1～9任一项所述的苦乐果中双黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
步骤a、用甲醇水溶液对苦乐果粉末进行提取，得到供试品溶液；
步骤b、配制双黄酮类成分的对照品溶液；
步骤c、用所述高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行测定，用外标法计算所述供试品溶液中所述双黄酮类成分的含量。
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