CN112076227A - 一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用。本发明所述的组合物包括石榴汁和酸石榴汁，其用于治疗缺铁性贫血时毒副作用小、安全有效。

Description

一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用。
背景技术
缺铁性贫血(IDA)是由于体内缺少铁而影响血红蛋白合成，而引起的一种贫血。在红细胞的产生受到限制之前，体内的铁贮存已耗尽，此时称为铁缺乏。这种贫血特点是血清铁和血清转铁蛋白饱和度均降低，骨髓铁染色中缺乏可染铁，血涂片中可见红细胞呈中心淡染的小红细胞。缺铁性贫血是我国普遍存在的营养缺乏性贫血，影响人口广泛，发病率高，严重影响人们健康及生活质量。其病因多为摄入不足、吸收障碍或消耗过多导致体内储存铁耗尽，若在这一时期不加以补充，进而会发展为缺铁性贫血。铁是合成血红蛋白的基本原料之一，铁缺乏导致骨髓中血红蛋白合成受阻，引起小细胞低色素贫血。缺铁性贫血是临床中常见疾病，也是营养性贫血的常见类型，孕妇和儿童发病率较高。WHO资料显示全球30％的人口患有缺铁性贫血，尤其是儿童和妊娠期妇女占总数的90％。
目前世界范围内治疗IDA的方法为口服补剂、静脉注射铁剂或联合营养干预。以上方法在临床上取得较为显著的效果，但在患者依从性、有效率和不良反应等方面还有较为明显的差异。
传统的补铁剂如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁等都是无机铁或植物铁，由于它们在体内的利用率低，吸收率一般为5％～8％，吸收过程复杂、困难、易受膳食中其它因素影响，而且副作用大，出现恶心、胃胀、消化器官障碍、腹泻、便秘等症状，市场上治疗缺铁性贫血的中药中毒副作用小、安全有效的品种较少。而静脉注射铁剂反应较多，副作用也比较明显。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术中存在口服铁剂不易耐受和肠胃道反应大，市场上治疗缺铁性贫血的中药中毒副作用小、安全有效的品种较少的缺陷，因而提供了一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用。本发明的组合物用于治疗缺铁性贫血时毒副作用小、安全有效。
本发明提供了一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用，所述的组合物包括石榴汁和酸石榴汁。
本发明中，优选地，所述的组合物还包括矫味剂和/或防腐剂。
本发明中，当所述的组合物还包括矫味剂时，所述的矫味剂可为本领域常规所用，优选为蔗糖；所述的矫味剂与所述的石榴汁的质量体积比可为本领域常规，优选为1:1～1:3g/mL，例如，1:2g/mL。
本发明中，当所述的组合物还包括防腐剂时，所述的防腐剂可为本领域常规所用，优选为羟苯乙酯和/或苯甲酸钠；所述的防腐剂与所述的石榴汁的质量体积比可为本领域常规，优选为1:80～1:240g/mL，例如，1:160g/mL。
本发明中，所述的石榴汁可为本领域常规所述，即由石榴榨汁所得，具体可为石榴科植物石榴(Punica granatum L.)成熟果实的种子榨汁所得；所述酸石榴汁可为本领域常规所述，即由酸石榴榨汁所得，具体可为石榴科植物石榴(Punica granatum L.)具酸味的成熟果实的种子榨汁所得。本领域技术人员均知，所述石榴成熟果实有具有酸味的和不具有酸味的，所述石榴成熟果实不具有酸味，所述石榴具酸味的成熟果实具有酸味，两者种属相同，但在口感上存在差异。所述石榴收载于中华人民共和国卫生部药品标准WS3-BW-0018-98(维吾尔药分册)18页，所述酸石榴收载于《新疆维吾尔自治区药材标准》2010年版192页。
本发明中，所述的石榴汁和所述的酸石榴汁的质量比可为本领域常规，优选为1:10～10:1，更优选为2:3～3:2，例如，1:1。
本发明中，当所述的石榴汁和所述的酸石榴汁的质量比为1:1时，所述的组合物优选包含石榴补血糖浆。所述石榴补血糖浆为常规所述的中药糖浆剂，具体可为新疆维吾尔药业有限责任公司生产。
本发明中，所述的组合物可根据施用方式配制成本领域常规所述的各种剂型，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、液体制剂(例如糖浆剂)。本发明所述的应用中，当所述的组合物的剂型为糖浆剂时，其可采用口服方式给药，具体可为一次20-30mL，一日3次。
本发明中，所述的组合物可采用本领域常规制备方法制得，具体可包括如下步骤：
(1)将所述石榴汁和所述酸石榴汁，过滤，得滤液A，当所述的组合物包括矫味剂时，在所述的滤液A中加入所述的矫味剂；
(2)将步骤(1)所述滤液A加热，静置，过滤，得滤液B，即可，当所述的组合物包括防腐剂时，在所述的滤液A加热后加入所述的防腐剂。
在所述步骤(1)中，所述石榴汁优选为将石榴去皮，剥取种子，榨汁得到；所述酸石榴汁优选为将酸石榴去皮，剥取种子，榨汁得到。
在所述步骤(2)中，所述的加热优选为加热至沸腾。
当所述的组合物的剂型为糖浆剂时，可采用本领域常规制备方法制得，具体可为在步骤(1)所述滤液A中加入矫味剂，将步骤(2)中所述滤液B与水混合即可。所述的水与所述的石榴汁的体积比优选为1:1～1:3，例如，1:2。
本发明中，所述的缺铁性贫血可为本领域常规所述的缺铁性贫血，例如通过低铁饮食和/或失血(放血)引起的缺铁性贫血。
本发明中，当所述的组合物所施用的受试者为小鼠时，其患有低铁性贫血的外形表现包括精神萎靡、蜷缩成团、反应降低；内部造血系统表现包括小鼠外周血液红细胞数目(RBC)，血红蛋白浓度(HGB)、红细胞比容(HCT)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)值下降、血清中促红细胞生成素(EPO)、造血干细胞因子(SCF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量降低。
本发明所述的应用中，所述的组合物在施用与受试者之后，可带来其体内的红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)和红细胞比容(HCT)中的一种或多种指标的提高；当受试者为人类时，所述组合物的施用剂量可为30mL/60kg/天～270mL/60kg/天，例如90mL/60kg/天。
本发明所述的应用中，所述的组合物在施用与受试者之后，可带来其体内血清中促红细胞生成素(EPO)和/或铁含量指标的提高；当受试者为人类时，所述组合物的施用剂量可为30mL/60kg/天～270mL/60kg/天，例如90mL/60kg/天。
本发明所述的应用中，所述的组合物在施用与受试者之后，可带来其体内骨髓有核细胞计数的增加；当受试者为人类时，所述组合物的施用剂量可为30mL/60kg/天～270mL/60kg/天，例如90mL/60kg/天。
本发明所述的应用中，所述的组合物在施用于受试者之后，可带来其体内骨髓间充质干细胞中造血干细胞因子(SCF)和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的蛋白表达的增强；当受试者为人类时，所述组合物的施用剂量可为30mL/60kg/天～270mL/60kg/天，例如90mL/60kg/天。
本发明进一步还提供了上述组合物在制备促红细胞生成素生成剂、促骨髓有核细胞生成剂、造血干细胞因子蛋白表达促进剂、或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子蛋白表达促进剂中的应用。
本发明所述的组合物还可进一步包含其他药物活性成分，联合使用用于制备治疗缺铁性贫血的药物，其中所述其他药物活性成分为本领域治疗缺铁性贫血的常规药物。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的组合物，能有效治疗缺铁性贫血；可增加造血细胞因子EPO、SCF、GM-CSF的表达、提高骨髓有核细胞数、改善造血功能系统、毒副作用小、安全有效。
附图说明
图1为效果实施例1中PCR检测SCF、GM-CSF的mRNA水平。
图2为效果实施例1中WB检测SCF、GM-CSF的蛋白表达水平。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
取石榴和酸石榴分别去皮，剥取种子，榨汁，过滤，取石榴汁400mL，酸石榴汁400mL，滤液中加入蔗糖200g，加热煮沸使溶解，加入羟苯乙酯0.5g和苯甲酸钠2g，搅匀，静置24小时，滤过，滤液加水至1000mL，混匀，滤过，即得组合物。
效果实施例1
1实验原理
本发明采用缺铁饮食联合放血进行缺铁性贫血模型小鼠构建，通过观察组合物对缺铁性贫血模型小鼠铁含量及造血细胞因子的影响，观察实施例1的组合物(以下简称组合物)对缺铁性贫血模型小鼠铁含量及造血功能的影响及其相关机制。
1.1实验材料：
Wistar大鼠，70只(20±2g，4周龄)，雄性，购自华中农业大学动物中心(SYXK(鄂)2015-0084)，
复方阿胶浆(山东东阿阿胶股份有限公司，国药准字Z20083345)，
重组人红细胞生成素注射液(EPO沈阳三生制药，批号：201709182V)，
SCF抗体(BosterBio，A01254-1)，
GM-CSF抗体(proteintech，17762-1-AP)，
EPO酶联免疫检测试剂盒(Bio-Swamp，MU30110)，
SYBR Green PCR试剂盒(KAPA Biosystems，KM4101)，
逆转录试剂盒(TAKARA，639505)，
荧光定量PCR仪(Bio-Rad，CFX-Connect 96)，
凝胶成像系统(北京君意，JY045-3C)，
微型涡旋混合仪(杭州奥盛，MTV-1),
全自动化学发光分析仪(上海天能，Tanon-5200)，
酶标仪(芬兰雷勃，MK3)。
2实验方法
2.1实验动物分组
将所有Wistar大鼠，SPF级，雄性，4周龄。于无特殊病原体(specific pathogenfree,SPF)条件下饲养。饲养环境为温度22～26℃，相对湿度50％～60％，人工光照明暗各12h，每笼10只，勤换垫料，给予标准饲料和纯净水喂养。实验过程中对实验鼠的处置符合中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的规定。实验鼠正常喂食，适应性饲养1周后，将大鼠中随机分为正常对照组、模型组、组合物低剂量组(大鼠用量3.125ml/kg，相当于人的30ml/60kg/天)、组合物中剂量组(大鼠用量9.375ml/kg，相当于人的90ml/60kg/天)、组合物高剂量组(大鼠用量28.125ml/kg，相当于人的270ml/60kg/天)、复方阿胶浆组(大鼠用量6.25ml/kg，相当于人的60ml/60kg/天)、硫酸亚铁组(0.27g/kg)，每组10只。正常对照组大鼠喂食普通饲料，实验组大鼠喂食低铁饲料，并辅以少量尾静脉放血制作缺铁性贫血模型，喂食4周。
3实验结果
3.1血虚特征体征分析
造模前期，观察实验鼠状态。除正常组外，其他组实验鼠开始出现精神萎靡不爱动，蜷缩成团，可视粘膜苍白症状。但在敲打鼠笼时，实验鼠的反应任然活跃，模型症状还不太明显。对实验鼠进行少量的尾静脉放血，辅助模型形成，在敲打鼠笼时可观察到实验鼠反应较之前迟钝，血虚症模型症状明显。
观察各组大鼠的体重、精神、饮食、皮毛、鼻唇颜色等生理体征变化，连续观察28天后，组合物各组、硫酸亚铁和复方阿胶浆组小鼠均出现不同程度的精神好转，毛色恢复光泽，团缩弓背大鼠数减少，血虚症状改善，于药物干预结束后第二天，以各组大鼠精神、皮毛、鼻唇颜色等恢复情况为指标，计算大鼠恢复情况见表1。
表1血虚模型大鼠恢复情况
Figure BDA0002093402430000071
3.2外周血象分析及EPO含量测定
在灌胃给药的第0天、10天、20天，每周减尾巴取血0.5mL-1mL，全血置于涂抹肝素的离心管中保存，取血后缓慢摇晃，使血液与管壁涂抹的肝素均匀混合，采用全自动血液分析仪测定血象指标：红细胞数目(RBC)、白细胞计数(WBC)，血小板计数(PLT)，血红蛋白浓度(HGB)以及红细胞比容(HCT)。另外一管静置离心后，取血清，用ELISA法进行促红细胞生成素(EPO)含量的检测，生化法检测血清中铁含量。
动物造模20天后，HGB、RBC、HCT均明显下降。外周血涂片可见红细胞大小不等，以小细胞为主，中央淡区扩大，符合缺铁性贫血特征。
表2血象分析RBC，WBC，PLT，HCT，HGB的含量变化(时间点:20天，以下为平均值±方差)
Figure BDA0002093402430000081
表2结果显示，在造模后第20天，组合物中、高剂量组对RBC、WBC、HGB、HCT和PLT有一定的提升，与模型组比较具有显著差异。
3.3血清中EPO和铁含量检测
表3 ELISA检测血清EPO含量变化
组别 EPO含量(pg/mL)
正常组 1736.867±66.86
模型组 568.007±41.85
组合物低剂量组 1135.260±9.88
组合物中剂量组 1253.444±10.05
组合物高剂量组 1456.228±7.28
硫酸亚铁组 1337.147±113.99
复方阿胶浆组 1235.941±111.663
表4生化法检测血清中铁含量变化
Figure BDA0002093402430000082
Figure BDA0002093402430000091
根据大鼠血虚体征特征以及血象分析结果(表1和表2)，当组合物达到中剂量(相当于人服用剂量90mL/60kg/d)时，就能得到较好的补血效果(与复方阿胶相当)，故选定该组进行后续相关检测。同时可以发现，对于促红细胞生成素EPO和红细胞数RBC这两个指标，组合物组的效果均好于复方阿胶或硫酸亚铁(表3)。根据补铁数据，可发现组合物的补铁效果也优于阿胶或硫酸亚铁(表4)。
3.4骨髓有核细胞计数
取各组小鼠双侧股骨，用剪刀剪开股骨骨头，露出骨髓腔，然后用消毒过的注射器,吸取2mL培养液，反复冲洗骨髓腔，收集全部骨髓细胞，充分混匀后镜下计数每毫升BMC总数。
表5骨髓有核细胞计数
Figure BDA0002093402430000092
与模型组相比，其余各组骨髓有核细胞数目显著上升。提示组合物、硫酸亚铁、复方阿胶浆干预后，血虚证模型小鼠的造血功能显著提升。
3.5 PCR和Western blot检测骨髓间充质干细胞中SCF、GM-CSF的蛋白表达水平
表6 PVR检测引物序列
Figure BDA0002093402430000101
反应程序：
95℃,3min；95℃,5sec；56℃,10sec；72℃,25sec；39cycles；65℃,5Sec；95℃,50Sec。
具体结果见附图1。
表7 Western blot检测骨髓间充质干细胞中SCF、GM-CSF的蛋白表达变化
Figure BDA0002093402430000102
与模型组相比，组合物组、硫酸亚铁组、复方阿胶浆组的SCF、GM-CSF的蛋白表达量升高，提示这三种处理都可以提高造血细胞因子SCF、GM-CSF蛋白表达的作用，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。
具体结果见附图2。
4实验结论
本发明的组合物，能明显增加缺铁性贫血大鼠体重，与低铁对照组比较有明显差异；还能增加缺铁性贫血大鼠血红蛋白含量，且血红蛋白升高值与低铁对照组有显著差异；还可以增加与造血功能相关的细胞因子，提高骨髓有核细胞数，组合物可通过提高造血细胞因子EPO，SCF，GM-CSF的表达来改善缺铁性贫血模型小鼠的造血功能，小鼠的体重、精神、饮食、皮毛、鼻唇颜色都恢复正常，血清中铁含量得到提升，血象指标RBC，WBC，PLT，HCT，HGB也恢复正常。
以上结果说明，本发明的组合物可明显改善缺铁性贫血，具有广泛的应用前景。

Claims (10)

1.一种组合物在制备治疗缺铁性贫血的药物中的应用，其特征在于，所述的组合物包括石榴汁和酸石榴汁。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物还包括矫味剂和/或防腐剂；所述的矫味剂优选为蔗糖；所述的矫味剂与所述的石榴汁的质量体积比优选为1:1～1:3g/mL；所述的防腐剂优选为羟苯乙酯和/或苯甲酸钠；所述的防腐剂与所述的石榴汁的质量体积比优选为1:80～1:240g/mL。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的石榴汁和所述的酸石榴汁的质量比为1:10～10:1，优选为2:3～3:2。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、液体制剂例如糖浆剂。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述石榴汁和所述酸石榴汁，过滤，得滤液A；当所述的组合物包括矫味剂时，在所述的滤液A中加入所述的矫味剂；
(2)将步骤(1)所述滤液A加热，静置，过滤，得滤液B，即可；当所述的组合物包括防腐剂时，在所述的滤液A加热后加入所述的防腐剂；
在所述步骤(1)中，所述石榴汁优选为将石榴去皮，剥取种子，榨汁得到；所述酸石榴汁为将酸石榴去皮，剥取种子，榨汁得到；
和/或，在所述步骤(2)中，所述的加热优选为加热至沸腾。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缺铁性贫血为通过低铁饮食和/或失血引起的缺铁性贫血。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物通过提高受试者体内的红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度和红细胞比容中的一种或多种指标起作用；
和/或，所述的组合物通过提高受试者体内的促红细胞生成素和/或铁含量的指标起作用；
和/或，所述的组合物通过提高受试者体内的骨髓有核细胞计数指标起作用；
和/或，所述的组合物通过提高受试者体内的骨髓间充质干细胞中造血干细胞因子和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的蛋白表达起作用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当受试者为人类时，所述组合物的施用剂量为30mL/60kg/天～270mL/60kg/天，例如90mL/60kg/天。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物进一步还包含其他治疗缺铁性贫血的药物活性成分。
10.一种组合物在制备促红细胞生成素生成剂、促骨髓有核细胞生成剂、造血干细胞因子蛋白表达促进剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子蛋白表达促进剂中的应用，其特征在于，所述的组合物包括石榴汁和酸石榴汁。
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