CN112057450A - 核输出蛋白抑制剂kpt-335及其组合物在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及核输出蛋白抑制剂KPT‑335及其组合物在抗肿瘤的应用，本发明核输出蛋白抑制剂KPT‑335及其IRE1抑制剂组合物对食管癌、肺癌、胃癌及肝癌细胞具有显著的治疗作用，同时对正常细胞毒性较小，本发明核输出蛋白抑制剂KPT‑335单用对食管癌细胞增殖和迁移具有显著抑制作用，同时能够显著升高Cleaved‑PARP的表达，并显著降低XPO1的表达，促进凋亡效果。本发明含有的KPT‑335和IRE1抑制剂的组合物使药物的生物利用度提高，同时能够使药效产生协同增效的作用，明显优于单药使用。

Description

核输出蛋白抑制剂KPT-335及其组合物在抗肿瘤药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及核输出蛋白抑制剂及其组合物在抗肿瘤药物的应用。

背景技术

癌症是全球第二大死亡原因，它的特征在于不受控制的细胞增殖，还会产生异常的细胞团或肿瘤。原发性肿瘤由于新的血管形成而生长，并且随着时间的推移会扩散到其他身体部位，从而导致转移并最终死亡。癌症是由于环境或遗传因素导致细胞遗传物质的损坏或突变而引起的。外科手术和放射疗法是用于局部和非转移性癌症的主要治疗方法，而抗癌药物化学疗法是目前用于转移性癌症的选择。传统化疗药物具有选择性低、不良反应多和易产生耐药等缺点，已难以满足治疗的临床需要。寻找和发现新的癌症治疗分子靶点，研发新的分子靶向药物已成为当前癌症治疗的迫切需要。

肿瘤抑制蛋白的表达水平和抗肿瘤药物的分子靶标对于癌细胞的药物敏感性至关重要。KPT-335(Verdinexor)是一种新型的口服可生物利用的核输出蛋白选择性抑制剂(SINE)，它可以减少流感病毒在体外和体内的复制，可作为抗病毒药，有研究表明，KPT-335可以抑制针对犬肿瘤细胞系的核输出蛋白Exportin 1(XPO1/CRM1)，经KPT-335处理癌细胞后可上调抑癌蛋白p53和p21的蛋白和mRNA表达，并促进其核定位。目前，并无KPT-335用于人类肿瘤的治疗的报道。

肌醇需求激酶1(IRE1)是一种定位于内质网膜的跨膜蛋白，参于未折叠蛋白反应(UPR)信号通路中信息的传递。其中，IRE1α/Xbp1通路是UPR的重要传感通路，IRE1α通过感知内质网压力，使激酶区域自磷酸化进而激活核酸酶活性。STF-083010是一种特异性IRE1核酸内切酶抑制剂，具有剂量和时间依赖性的细胞抑制能力和细胞毒性，STF-083010可抑制XBP1剪接，抑制IRE1α的核酸内切酶活性，但不影响IRE1α的激酶活性。目前，关于IRE1α/Xbp1通路的研究多与脂肪代谢调控有关，很少涉及到肿瘤的防治。

大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用的，因此联合用药针对多靶点进行治疗将不仅旨在减少或延缓耐药性的出现、降低毒性，而且通过多种药物对癌细胞杀伤的协同作用取得更好的疗效。目前，没有关于核输出抑制剂和IRE1抑制剂联合用药用于抗肿瘤的相关研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，提供了KPT-335在抗肿瘤药物中的应用，本发明单用KPT-335显示出对食管癌、肺癌、乳腺癌及结直肠癌细胞具有显著的治疗作用，同时对正常细胞毒性较小。本发明单用KPT-335对食管癌细胞增殖、迁移和对食管癌细胞克隆形成具有显著抑制作用，同时显著升高Cleaved-PARP的表达，并显著降低XPO1的表达，促进凋亡效果。本发明含有KPT-335和IRE1抑制剂的组合物使药物的生物利用度提高，同时，KPT-335和STF-083010联用能够使药效产生协同增效的作用，扩大抗肿瘤范围，对食管癌、肺癌、肝癌及胃癌细胞具有显著的治疗作用，且对正常细胞毒性较小，治疗效果明显优于单药使用。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

本发明提供了KPT-335在抗肿瘤药物中的应用，所述的KPT-335，CAS号为1392136-43-4，其结构式如下：

优选的，所述肿瘤为食管癌、肺癌、乳腺癌及结直肠癌的至少一种。更优选的，所述肿瘤选自食管癌。

本发明还提供了一种含有核输出蛋白抑制剂KPT-335的药物组合物，所述组合物包括有效量的核输出蛋白抑制剂KPT-335、有效量的IRE1抑制剂和药物上可接受的载体。

优选的，所述的IRE1抑制剂为STF-083010。

优选的，所述核输出蛋白抑制剂KPT-335和IRE1抑制剂的摩尔浓度比为1.5：40。

优选地，可将本发明中所述药物组合物按照本领域常规技术制备成注射制剂或口服制剂，本发明优选将本发明中所述药物组合物制备成口服制剂，所述口服制剂优选为口服胶囊。根据制剂形式，本发明所述药物组合物在制剂中的含量以质量分数计，可以为1～99％，优选为5～90％；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不影响本发明药物的疗效或不和本发明药物组合物发生反应为前提；制剂的制备方法可以采用本领域常规的制备方法进行制备。

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明另外一个目的是提供上述药物组合物在抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤选自食管癌、肺癌、胃癌和肝癌的至少一种，优选的所述肿瘤选自食管癌。

与现有技术相比，本发明药物组合物具有以下优势：

本发明核输出蛋白抑制剂KPT-335及其药物组合物在治疗食管癌、肺癌、胃癌和肝癌方面具有显著的积极效果，尤其是在治疗食管癌方面，本发明KPT-335及其组合物与现有抗肿瘤药物相比，疗效有提升，且毒性明显偏低，减少了副作用的发生，取得了预料不到的技术效果，为临床治疗癌症提供了更多的选择。特别地，以KPT-335药物与STF-083010的摩尔浓度比为1.5：40，协同作用最好，并且药物对正常细胞的毒副作用最小。此外，本方面核输出蛋白抑制剂KPT-335及其药物组合物对人正常的血管内皮细胞具有较低的毒性，同时对肿瘤细胞具备良好的抑制作用，有望最终提高治疗癌症的效果，可应用于制备抗肿瘤的药物领域。

附图说明

图1为KPT-335单用对肿瘤细胞及正常细胞增殖的影响，A为KPT-335单用对食管癌细胞株KYSE30、Eca-109、KYSE450、KYSE510及正常血管内皮细胞HUVEC增殖的影响；B为KPT-335单用对乳腺癌细胞株BT549、肺癌细胞株PC-9、结直肠癌细胞株HCT8、HCT116增殖的影响。

图2为KPT-335单用对食管癌细胞迁移的影响。

图3为KPT-335单用对食管癌细胞凋亡蛋白的影响。

图4为KPT-335和STF-083010联合作用对肿瘤细胞及正常细胞的影响。

图5为KPT-335和STF-083010联合用药对食管癌细胞克隆形成的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、KPT-335单用对肿瘤细胞及正常细胞增殖的影响

将食管癌细胞株KYSE30、Eca-109、KYSE450、KYSE510、乳腺癌细胞株BT549、肺癌细胞株PC-9、结直肠癌细胞株HCT8、HCT116和正常血管内皮细胞HUVEC，以每孔3000-6000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，加入空白对照组和不同剂量的KPT-335实验组(0-10μM)；培养48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1h，在酶标仪上读取OD值(波长450nm)，读取每孔的吸光值，计算细胞存活率。按照细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100％的公式，计算得到细胞存活率，结果详见图1和表1。

表1各细胞IC₅₀测定结果

细胞类别	IC<sub>50</sub>(μM)
		KYSE30	4.899
Eca-109	0.8556
		KYSE450	4.833
KYSE510	3.001
		BT549	0.3079
PC-9	0.3336
		HCT8	2.816
HCT116	3.068
		HUVEC	＞11505

由上表1可知，KPT-335对食管癌、肺癌、乳腺癌和结直肠癌均具有显著的积极效果，同时对正常细胞毒性较小。

实施例2、KPT-335单用对食管癌细胞迁移的影响

将食管癌细胞株KYSE30、KYSE450以每孔12000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，同步化12h，用划痕仪进行划痕，PBS洗两遍后，换含2％胎牛血清培养基，进行拍照，此时为0h，然后加入空白对照组和剂量分别为0、5、2.5、1.25、0.625、0.31125μM的KPT-335实验组，培养24h后进行拍照，量取宽度，计算迁移率。按照细胞迁移比率＝宽度(实验组0h-实验组24h)/宽度(空白组0h-空白组24h)×100％，结果详见表2和图2。

表2各细胞迁移率测定结果

由表2和图2可知，5μM KPT-335可以显著性抑制食管癌细胞株KYSE30和KYSE450的迁移，2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM KPT-335能显著抑制KYSE30细胞的迁移而对KYSE450细胞迁移没有显著性差别。这表明，KPT-335具有一定抑制食管癌细胞迁移的能力。

实施例3、KPT-335单用对食管癌细胞凋亡蛋白的影响

先将食管癌细胞KYSE30和KYSE450分别以每孔3.5×10⁵个细胞的密度接种至6孔板。待细胞贴壁后，不同浓度处理24h后，分别收取各组细胞全蛋白。先经SDS电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，孵育所需检测的蛋白相对应的一抗，4℃孵育过夜。24h回收一抗，用TBST清洗3次，每次5min，之后孵育二抗，室温孵育1h。然后用TBST清洗3次，每次5min，之后ECL显影，检测经KPT-335处理后食管癌细胞KYSE30和KYSE450细胞内凋亡通路相关蛋白PARP、Cleaved-PARP和XPO1蛋白的表达情况。结果见图4。

从图4可以看出，在KYSE30和KYSE450细胞中，当用KPT-335处理后，Cleaved-PARP的表达显著升高，XPO1的表达显著降低，说明KPT-335抑制XPO1的表达，促进凋亡效果。

实施例4 KPT-335和STF-083010联合作用对肿瘤细胞及正常细胞的影响

将食管癌细胞株ECA-109、KYSE30、肺癌细胞株A549、肝癌细胞HepG2、胃癌细胞株BGC-823和正常乳腺上皮细胞MCF-10A和人胚肺成纤维细胞HDF以每孔3000-6000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，加入对照组、1.5μM的KPT-335、40μM的STF-083010和联合用药组药物；培养48h后，培养48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1h，在酶标仪上读取OD值(波长450nm)，读取每孔的吸光值，计算细胞存活率。按照细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100％的公式，计算得到细胞存活率，结果见图4。

如图4所示，KPT-335和STF-083010在肿瘤细胞中组合使用具有很好的联合效果，而对正常细胞的毒性较小。

实施例5 KPT-335和STF-083010联合用药对食管癌细胞克隆形成的影响

将食管癌细胞株ECA-109、KYSE30、胃癌细胞株BGC-823接种到6孔板，待细胞贴壁过夜后，将细胞分为对照组、KPT-335单药组、STF-083010单药组及KPT-335和STF-083010药物联合用药组，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育7天，检测细胞平板克隆形成情况。结果如图5所示，与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞克隆形成具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞克隆数量最少，同时体积也最小。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.核输出蛋白抑制剂KPT-335在抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌的至少一种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌。

4.一种含有核输出蛋白抑制剂KPT-335的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括有效量的核输出蛋白抑制剂KPT-335、有效量的IRE1抑制剂和药物上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的IRE1抑制剂为STF-083010。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述核输出蛋白抑制剂KPT-335和IRE1抑制剂STF-083010的摩尔浓度比为1.5：40。

7.根据权利要求4～6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物被制成注射制剂或口服制剂。

8.根据权利要求4～6任一项所述的药物组合物在抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌、肺癌、胃癌及肝癌的至少一种。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自食管癌。

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