CN112048003A - 一种光控荧光蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光控荧光蛋白。本发明公开的光控荧光蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基不变且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的光控荧光蛋白可以用于光电联合成像，也可独立地用于蛋白标记与荧光成像的领域中，具有广泛的应用前景。

Description

一种光控荧光蛋白

技术领域

本发明涉及生物光学成像与分子影像学技术领域中，一种光控荧光蛋白。

背景技术

光电联合成像技术结合了荧光成像的高特异性和电子显微成像的高分辨率，提供了互补的生物学信息。普通光学成像的分辨率(侧向分辨率约为250nm)与电镜分辨率(侧向分辨率约为2nm)的尺度相差较大，相比之下，超高分辨率荧光显微成像(最高侧向分辨率约为10nm)与电子显微成像的结合很大程度上提高了信息的匹配性和准确度。对样品的同一层切片进行电镜和光镜成像是最理想的状态，通常采取先电镜制样，再光镜成像，最后电镜成像的顺序，但电镜制样的过程往往会破坏荧光蛋白探针的生色团，给荧光成像带来困难。2014年，有人报道了在锇酸固定后仍能保留部分荧光并进行光电联合超分辨成像的光转化荧光蛋白mEos4b。其问题在于，mEos4b标记的样品仅能使用GMA树脂包埋，而GMA不能有效固定膜结构，不能对同层切片成像，连续切片时容易丢片，并且由于包埋在酸性环境下进行，在荧光成像时需用含抗光漂白成分的碱性缓冲液处理样品以恢复荧光，而这种缓冲液通常会改变GMA树脂包埋样品的超微结构。

使用Epon树脂包埋能很好的解决上述问题，包括更好地保存样品的超微结构，切片时保护样品使其不易受损，连续切片时很少丢片，更适合连续切片和3D切片电镜重构，荧光成像缓冲液对其结构影响较小，在同层样品光电联合成像中更具优势等等。然而，目前并没有荧光蛋白能够在Epon树脂包埋后仍保留足够的荧光以满足超高分辨率荧光成像的要求。

目前光电联合超分辨成像技术中的光镜一般指单分子定位超高分辨率荧光显微成像技术(PALM)。在该技术中，通过使用光控发光的荧光蛋白并控制光照强度，使得在任一成像时间，发光分子的分布分散且稀疏，且对于每个发光分子，能够使用高斯数学函数拟合其形态并确定其中心位置，随后不断重复成像过程，通常几万到十几万次，直至足够多的发光分子出现并被定位，叠加所有正确定位的荧光分子，即可得到最后的重构图像。

可以用于单分子定位超高分辨率荧光显微成像的荧光蛋白有三类：光激活荧光蛋白，光照后发生从不亮到亮的不可逆转变；光转化荧光蛋白，光照后从一种颜色不可逆地转换为另一种颜色；光开光荧光蛋白，在亮和不亮两种状态间可逆变化的光开关荧光蛋白。光转换化荧光蛋白由于其转化前后的高荧光对比度，是PALM成像中应用最广，更新最快的荧光蛋白类别。其中，来自石珊瑚Lobophyllia hemprichii的绿转红荧光蛋白EosFP是最早被用于PALM成像的光转换荧光蛋白，其转换前后的发射峰值分别为516nm和581nm，但它是四聚体。通过随机点突变，两种不同形式的二聚体和单体mEosFP最后被改造出来。但mEosFP不能在37℃成熟，限制了其在哺乳动物细胞中的应用。为了解决这一问题，研究人员将两个二聚体形式的EosFP用一个含16个氨基酸的linker串联起来，发明了tdEosFP。tdEosFP亮度很高，但分子量大，成熟慢，会对某些蛋白(tubulin，histones，gap junctions)的定位产生影响。此后，McKinney等人报道了由mEosFP改良而来，能在37℃成熟的单体蛋白mEos2，但其融合特性受靶标蛋白局部浓度的影响。例如，标记局部分子浓度高的膜蛋白时，mEos2会影响膜蛋白的定位和功能。因此，在此基础上，发明人首先解析了mEos2的晶体结构，通过结构分析设计突变，得到了真正意义上的单体mEos3.2，在PALM成像中定位精度和标记密度均高于mEos2。

使用光控荧光蛋白进行光电联合超分辨成像时，通常采用先光镜成像，再电镜制样，再电镜成像的流程。这是因为荧光蛋白一般都无法在电镜制样后仍保留荧光，对荧光破坏较大的步骤主要是锇酸固定和树脂包埋。但上述操作的问题也是显而易见的，电镜制样前后的样品形变较大，给配准带来较大困难。mEos4b的出现部分解决了这一问题，其能在1％锇酸固定和GMA树脂包埋后保留足够荧光和光转后特性，先完成PALM成像，后进行电镜成像。但从对样品的保护和超微形态的保存来说，GMA并不是最佳选择，尤其在做连续切片或者对同一层切片样品联合成像时，Epon树脂包埋更具优势。但目前并未有报道称荧光蛋白可以抵抗Epon树脂包埋。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用光电联合成像方法定位目的蛋白。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质(名称为PCEM)，PCEM为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基中一个或多个或全部不变且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述标签可为下表所示标签。

表：标签的序列

上述A2)中的PCEM蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性(即75％-100％之间的同一性)且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的PCEM蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的PCEM蛋白质的编码基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列2所示的PCEM蛋白质。

本发明还提供了与PCEM相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码PCEM的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。

B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PCEM的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码PCEM的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PCEM蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PCEM蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PCEM蛋白质且具有PCEM蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

B2)所述的含有编码PCEM蛋白质的核酸分子的表达盒(PCEM基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PCEM蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PCEM基因转录的启动子，还可包括终止PCEM基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述PCEM基因表达盒的重组载体。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pRSET载体或pHyPer-dMito载体。

B3)所述重组载体具体可为pRSET-PCEM或pPCEM-dMito。所述pRSET-PCEM为将pRSET载体的BamHI和EcoRI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的PCEM编码基因，得到的重组载体。所述pRSET-PCEM能表达序列表中序列2所示的PCEM与6×his tag、T7tag以及Xpress tag的融合蛋白。所述pPCEM-dMito为将pHyPer-dMito载体的AgeI和NotI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的PCEM编码基因，得到的重组载体。所述pPCEM-dMito能表达序列表中序列2所示的PCEM与线粒体定位序列的融合蛋白。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21。

所述细胞可为植物细胞或动物细胞。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为CHO细胞。

所述转基因细胞系、转基因组织和转基因器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了PCEM在作为光控荧光蛋白中的应用。

本发明还提供了利用光电联合成像方法定位目的蛋白的方法，所述方法包括：将PCEM的编码基因与目的蛋白的编码基因连接后导入目的细胞、目的组织、目的器官或目的个体中，使所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体表达PCEM与所述目的蛋白形成的融合蛋白质，利用光电联合成像方法检测PCEM的位置，实现对所述目的蛋白的定位。

PCEM的编码基因与所述目的蛋白的编码基因可通过含有所述蛋白质的编码基因与所述目的蛋白的编码基因的表达载体导入所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体中。

所述光电联合成像方法中可采用锇酸固定方法固定所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体。

所述光电联合成像方法中可采用Epon树脂包埋方法包埋所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体。

所述Epon树脂包埋方法可采用Epon812包埋树脂包埋。

所述光电联合成像方法的光镜成像可采用PALM方法进行。

含有PCEM或所述生物材料的显色剂，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了PCEM或所述生物材料的下述任一应用：

X1)蛋白质标记；

X2)荧光成像；

X3)光电联合成像；

X4)追踪蛋白质、亚细胞器、细胞局部区域、细胞或小型动物胚胎的结构和/或形态；

X5)解析目标蛋白质的结构和/或定位

X6)制备蛋白质标记产品；

X7)制备荧光成像产品；

X8)制备光电联合成像产品；

X9)制备追踪蛋白质、亚细胞器、细胞局部区域、细胞或小型动物胚胎的结构和/或形态产品；

X10)制备解析目标蛋白质的结构和/或定位产品。

上述荧光成像包括传统荧光成像和超高分辨荧光成像。

上述的传统荧光成像包括但不限定于宽场荧光成像、共聚焦显微成像、全内反射荧光成像、活细胞荧光成像等。

上述的超高分辨荧光成像包括但不限定于单分子定位超高分辨成像(PALM/STORM等)、光学波动超高分辨成像(SOFI)、结构光照明成像(SIM、STED、RESOLFT、NL-SIM等)等。

上述光电联合成像可为光电联合超分辨显微成像。

上述光电联合超分辨显微成像中的超高分辨荧光成像包括但不限定于单分子定位超高分辨成像(PALM/STORM等)、光学波动超高分辨成像(SOFI)、结构光照明成像(SIM、STED、RESOLFT、NL-SIM等)等。

上述光电联合超分辨显微成像中的电镜成像包括但不限定于扫描电镜、透射电镜、冷冻电镜。电镜样品包埋方法包括疏水树脂和亲水树脂包埋方法。

上述的光控荧光蛋白在光电联合超分辨显微成像中的应用包括但不限定于二维光镜-电镜联合成像、三维光镜-电镜联合成像、三维连续切片光镜-电镜联合成像等。

本发明的光控荧光蛋白PCEM可以独立地用于蛋白标记与荧光成像的领域中，包括活细胞动态成像，用于追踪蛋白、亚细胞器、细胞局部区域、细胞、小型动物胚胎等样品的结构和形态变化；单分子追踪，在单分子水平对目标蛋白进行轨迹追踪，动力学分析；单分子定位超高分辨率成像，在纳米尺度解析目标分子的结构和定位信息。同时，可用于常温光电联合超分辨成像中目标分子和结构的标记和成像，尤其在同一层切片样片、连续切片样品和3D重构等应用中具有优势。本发明提供的光控荧光蛋白能够在锇酸固定和Epon树脂高温包埋后仍保持荧光和光控的特性，能够用于超高分辨率光电联合成像，并有利于电镜下样品的形态保存。本发明的光控荧光蛋白PCEM具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的光控荧光蛋白PCEM与荧光蛋白mEos3.2的氨基酸序列对比结果。

图2为本发明的光控荧光蛋白PCEM的吸收,激发和发射的光谱图。横坐标均为波长，a图纵坐标为吸光度，b和c图纵坐标均为归一化荧光强度，最高峰记为1。b和c图中，左右两峰分别为激发峰和发射峰。PCEM表示PCEM融合蛋白。

图3为本发明的光控荧光蛋白PCEM抵抗Epon包埋的特性展示。Bar＝10μm。

图4为本发明的光控荧光蛋白PCEM的光控性质保留检测。横坐标为图象数，单位为帧；纵坐标为归一化荧光强度，最高峰记为1。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pRSET载体(Zhang MS等，Rational design of true monomericand bright photoactivatable fluorescent proteins.Nature Methods.2012；9(7):727-9))公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pHyPer-dMito载体(Zhang MS等，Rational design of truemonomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins.NatureMethods.2012；9(7):727-9))公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明提供了一种光控荧光蛋白，其名称为PCEM，PCEM为将mEos3.2的氨基酸序列(序列1)的第28位天冬氨酸残基被突变为谷氨酸残基，第93位亮氨酸残基被突变为甲硫氨酸残基，第166位天冬酰胺残基被突变为甘氨酸残基，第9位的赖氨酸残基突变为精氨酸残基，第34位的苯丙氨酸残基突变为酪氨酸残基，第39位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基，第69位的丙氨酸残基突变为缬氨酸残基，第195位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基以及在初始密码子后加入缬氨酸残基得到的蛋白质。PCEM的氨基酸序列为序列表中序列2。通过上述关键氨基酸位点的突变，光控荧光蛋白PCEM能够在锇酸固定后保留更多荧光，并抵抗Epon高温包埋，有助于样品超微结构的保存，并对同一层样品、连续切片样品以及3D样品实现更为精准的光电联合超分辨成像。

mEos3.2和PCEM的氨基酸序列比对结果如图1所示。

实施例1、光控荧光蛋白PCEM的制备

1、重组载体的构建

将pRSET载体的BamHI和EcoRI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的PCEM编码基因，得到重组载体，记为pRSET-PCEM。pRSET-PCEM能表达序列表中序列2所示的PCEM与6×his tag、T7tag以及Xpress tag的融合蛋白(记为PCEM融合蛋白)。

将pRSET-PCEM导入出发菌株大肠杆菌BL21中，得到重组菌。

培养上述重组菌，得到培养液，所用培养基为LB培养基，培养条件为在37℃摇床中培养过夜。将所得培养液离心，收集菌体沉淀，纯化得到PCEM融合蛋白，纯化步骤如下：超声破菌，离心收集上清液，将上清液过亲和镍柱层析，收集纯化后样品过分子筛层析，收集单体蛋白，浓缩后得到纯化的PCEM融合蛋白。

按照上述方法，将pRSET载体出发菌株中进行培养，作为对照。

实施例2、光控荧光蛋白PCEM的光物理和光化学性质检测

检测实施例1得到的纯化的光控荧光蛋白PCEM的光物理和光化学性质检测，检测方法按照文献(Zhang MS,等Rational design of true monomeric and brightphotoactivatable fluorescent proteins.Nature Methods.2012；9(7):727-9)进行。

按照上述方法，将纯化的PCEM融合蛋白替换为纯化的mEos3.2融合蛋白作为对照。

纯化的mEos3.2融合蛋白的制备方法如下：按照实施例中的方法，将序列3所示的PCEM编码基因替换为序列表中序列4所示的mEos3.2编码基因，其他步骤均不变，得到纯化的mEos3.2融合蛋白(即mEos3.2与6×his tag、T7tag以及Xpress tag的融合蛋白)。

结果如表1和图2所示。

表1、光控荧光蛋白PCEM的光物理光化学性质

表1中，PCEM表示PCEM融合蛋白，mEos3.2表示mEos3.2融合蛋白。

由表1的结果可知，PCEM融合蛋白绿色荧光的亮度为112，是mEos3.2融合蛋白的2倍；PCEM融合蛋白的红色荧光亮度为112，是mEos3.2融合蛋白的6.2倍；且PCEM融合蛋白是单体，由此表明，本发的光控荧光蛋白PCEM的具有优良的光物理和光化学性质。

实施例3、光控荧光蛋白PCEM的抗锇酸测试

对光控荧光蛋白PCEM进行抗锇酸测试。测试方法如下：用PBS缓冲液将实施例1得到的纯化的PCEM融合蛋白稀释至1μM的终浓度，加入具有透明底部的96孔黑色荧光板(Greiner)。实验分为两组，一组不添加OsO4(即PCEM无OsO4组)，一组加入终浓度为1％(质量百分比浓度)的OsO4水溶液(即PCEM有OsO4组)，但组总体积一致。向各组中加入锇酸水溶液后立即用透明密封(Bio-Rad)将板从顶部密封。温育10分钟后，使用多功能微孔板读数仪(Thermo Fisher Scientific)从底部测量绿色荧光强度(Ex＝480nm/Em＝515nm；带宽5nm/5nm)。所有测量都具有相同的参数设置。所有样品具有五个重复组，PBS用作空白组以除去背景。

按照上述方法，将纯化的PCEM融合蛋白替换为纯化的mEos4b融合蛋白作为对照。

纯化的mEos4b融合蛋白的制备方法如下：按照实施例中的方法，将序列3所示的PCEM编码基因替换为序列表中序列5所示的mEos4b编码基因，其他步骤均不变，得到纯化的mEos4b融合蛋白(即mEos4b与6×his tag、T7tag以及Xpress tag的融合蛋白)。mEos4b的序列为序列表中序列6。

结果如表2所示。

表2、光控荧光蛋白PCEM的抗锇酸性质(绿色荧光强度)

由表2的结果可知，PCEM融合蛋白在锇酸处理前其平均荧光强度为mEos4b融合蛋白的2.42倍，二者具有显著差异；锇酸处理后，PCEM融合蛋白的平均荧光强度为mEos4b融合蛋白的2.47倍，二者具有显著差异。由此表明，本发明的光控荧光蛋白在1％锇酸处理前后均具有更高的荧光强强度。

实施例4、光控荧光蛋白PCEM的抗Epon树脂包埋

对光控荧光蛋白进行抗Epon树脂包埋的测试。测试方法如下：用脂质体将含有PCEM编码基因或mEos4b编码基因的质粒转染入CHO细胞，表达36小时后离心收获细胞，在4℃下固定12小时，固定液用PBS(pH7.2)配置，含终浓度为4％PFA和2.5％戊二醛。后用1％OsO4将细胞在冰上后固定1小时。在冰上用2％UA染色1小时。逐渐增加乙醇浓度(30％，50％，70％，80％，90％，100％)使细胞脱水，并用100％丙酮进一步脱水。脱水后，将细胞在Epon(50％的Epon812，30.5％的NMA，18％的DDSA，1.5％的DMP-30)和丙酮的混合物中于室温下渗透(25％Epon 1小时，50％Epon 2小时，75％Epon 1小时，100％Epon 12小时，100％Epon持续12小时)。最后，在60℃下将细胞包埋在Epon812树脂中12小时。包埋结束后检测荧光信号。

含有PCEM编码基因的质粒为pPCEM-dMito，制备方法如下：

将pHyPer-dMito载体的AgeI和NotI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的PCEM编码基因，得到重组载体，记为pPCEM-dMito。pPCEM-dMito能表达序列表中序列2所示的PCEM与线粒体定位序列的融合蛋白。

含有mEos4b编码基因的质粒pmEos4b-dMito，制备方法如下：

将pPCEM-dMito载体的AgeI和NotI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列5所示的mEos4b编码基因，得到重组载体，记为pmEos4b-dMito。

结果如图3所示。可见，Epon树脂包埋后PCEM仍可见明显的荧光信号和其标记的线粒体结构，同时阴性对照mEos4b在经过同样处理后，则看不到任何荧光信号。

实施例5、光控荧光蛋白PCEM的光控特性保留

对实施例4得到的光控荧光蛋白PCEM的电镜样品进行光控特性的测试。测试方法如下：用488nm蓝光持续记录电镜样品荧光信号并关闭PCEM(使其进入不发光状态)，并在适当间隔给与405nm光秒冲用于激活PCEM(使其进入发光状态)。电镜样品制备方法如下：用脂质体将含有PCEM编码基因的质粒(实施例4的pPCEM-dMito)转染入CHO细胞，表达36小时后离心收获细胞，在4℃下固定12小时，固定液用PBS(pH7.2)配置，含终浓度为4％PFA和2.5％戊二醛。后用1％OsO4将细胞在冰上后固定1小时。在冰上用2％UA染色1小时。逐渐增加乙醇浓度(30％，50％，70％，80％，90％，100％)使细胞脱水，并用100％丙酮进一步脱水。脱水后，将细胞在Epon(50％的Epon812，30.5％的NMA，18％的DDSA，1.5％的DMP-30)和丙酮的混合物中于室温下渗透(25％Epon 1小时，50％Epon 2小时，75％Epon 1小时，100％Epon 12小时，100％Epon持续12小时)。最后，在60℃下将细胞包埋在Epon812树脂中12小时。

结果如图4所示。可见，PCEM在电镜样品制备后，其绿色通道仍保留较好的光开关性质，可用于PALM成像。

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 一种光控荧光蛋白

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Met Ser Ala Ile Lys Pro Asp Met Lys Ile Lys Leu Arg Met Glu Gly

1 5 10 15

Asn Val Asn Gly His His Phe Val Ile Asp Gly Asp Gly Thr Gly Lys

20 25 30

Pro Phe Glu Gly Lys Gln Ser Met Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly Gly

35 40 45

Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr Gly

50 55 60

Asn Arg Val Phe Ala Lys Tyr Pro Asp Asn Ile Gln Asp Tyr Phe Lys

65 70 75 80

Gln Ser Phe Pro Lys Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Leu Thr Phe Glu

85 90 95

Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala Arg Asn Asp Ile Thr Met Glu Gly Asp

100 105 110

Thr Phe Tyr Asn Lys Val Arg Phe Tyr Gly Thr Asn Phe Pro Ala Asn

115 120 125

Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr Glu

130 135 140

Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Thr Gly Asp Ile Glu Met Ala

145 150 155 160

Leu Leu Leu Glu Gly Asn Ala His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr Thr

165 170 175

Tyr Lys Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Leu Pro Gly Ala His Phe Val

180 185 190

Asp His Cys Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val

195 200 205

Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala His Ser Gly Leu Pro Asp Asn Ala

210 215 220

Arg Arg

225

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Val Ser Ala Ile Lys Pro Asp Met Arg Ile Lys Leu Arg Met Glu

1 5 10 15

Gly Asn Val Asn Gly His His Phe Val Ile Asp Gly Glu Gly Thr Gly

20 25 30

Lys Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Met Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly

35 40 45

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr

50 55 60

Gly Asn Arg Val Phe Val Lys Tyr Pro Asp Asn Ile Gln Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Gln Ser Phe Pro Lys Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met Thr Phe

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala Arg Asn Asp Ile Thr Met Glu Gly

100 105 110

Asp Thr Phe Tyr Asn Lys Val Arg Phe Tyr Gly Thr Asn Phe Pro Ala

115 120 125

Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr

130 135 140

Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Thr Gly Asp Ile Glu Met

145 150 155 160

Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Ala His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr

165 170 175

Thr Tyr Lys Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Leu Pro Gly Ala His Phe

180 185 190

Val Asp His Ala Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys

195 200 205

Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala His Ser Gly Leu Pro Asp Asn

210 215 220

Ala Arg Arg

225

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atggtgagtg cgattaagcc agacatgagg atcaaactcc gtatggaagg caacgtaaac 60

gggcaccact ttgtgatcga cggagaaggt acaggcaagc cttatgaggg aaaacagacc 120

atggatcttg aagtcaaaga gggcggacct ctgccttttg cctttgatat cctgaccact 180

gcattccatt acggcaacag ggtattcgtg aaatatccag acaacataca agactatttt 240

aagcagtcgt ttcctaaggg gtattcgtgg gaacgaagca tgactttcga agacgggggc 300

atttgcaatg ccagaaacga cataacaatg gaaggggaca ctttctataa taaagttcga 360

ttttatggta ccaactttcc cgccaatggt ccagttatgc agaagaagac gctgaaatgg 420

gagccctcca ctgagaaaat gtatgtgcgt gatggagtgc tgacgggtga tattgagatg 480

gctttgttgc ttgaaggagg tgcccattac cgatgtgact tcagaactac ttacaaagct 540

aaggagaagg gtgtcaagtt accaggcgcc cactttgtgg accacgccat tgagatttta 600

agccatgaca aagattacaa caaggttaag ctgtatgagc atgctgttgc tcattctgga 660

ttgcctgaca atgccagacg ataa 684

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atgagtgcga ttaagccaga catgaagatc aaactccgta tggaaggcaa cgtaaacggg 60

caccactttg tgatcgacgg agatggtaca ggcaagcctt ttgagggaaa acagagtatg 120

gatcttgaag tcaaagaggg cggacctctg ccttttgcct ttgatatcct gaccactgca 180

ttccattacg gcaacagggt attcgccaaa tatccagaca acatacaaga ctattttaag 240

cagtcgtttc ctaaggggta ttcgtgggaa cgaagcttga ctttcgaaga cgggggcatt 300

tgcaacgcca gaaacgacat aacaatggaa ggggacactt tctataataa agttcgattt 360

tatggtacca actttcccgc caatggtcca gttatgcaga agaagacgct gaaatgggag 420

ccctccactg agaaaatgta tgtgcgtgat ggagtgctga cgggtgatat tgagatggct 480

ttgttgcttg aaggaaatgc ccattaccga tgtgacttca gaactactta caaagctaag 540

gagaagggtg tcaagttacc aggcgcccac tttgtggacc actgcattga gattttaagc 600

catgacaaag attacaacaa ggttaagctg tatgagcatg ctgttgctca ttctggattg 660

cctgacaatg ccagacga 678

<210> 5

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

atggtgagtg cgattaagcc agacatgagg atcaaactcc gtatggaagg caacgtaaac 60

gggcaccact ttgtgatcga cggagatggt acaggcaagc cttatgaggg aaaacagacc 120

atggatcttg aagtcaaaga gggcggacct ctgccttttg cctttgatat cctgaccact 180

gcattccatt acggcaacag ggtattcgtg aaatatccag acaacataca agactatttt 240

aagcagtcgt ttcctaaggg gtattcgtgg gaacgaagct tgactttcga agacgggggc 300

atttgcaatg ccagaaacga cataacaatg gaaggggaca ctttctataa taaagttcga 360

ttttatggta ccaactttcc cgccaatggt ccagttatgc agaagaagac gctgaaatgg 420

gagccctcca ctgagaaaat gtatgtgcgt gatggagtgc tgacgggtga tattgagatg 480

gctttgttgc ttgaaggaaa tgcccattac cgatgtgact tcagaactac ttacaaagct 540

aaggagaagg gtgtcaagtt accaggcgcc cactttgtgg accacgccat tgagatttta 600

agccatgaca aagattacaa caaggttaag ctgtatgagc atgctgttgc tcattctgga 660

ttgcctgaca atgccagacg ataa 684

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

Met Val Ser Ala Ile Lys Pro Asp Met Arg Ile Lys Leu Arg Met Glu

1 5 10 15

Gly Asn Val Asn Gly His His Phe Val Ile Asp Gly Asp Gly Thr Gly

20 25 30

Lys Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Met Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly

35 40 45

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr

50 55 60

Gly Asn Arg Val Phe Val Lys Tyr Pro Asp Asn Ile Gln Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Gln Ser Phe Pro Lys Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Leu Thr Phe

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala Arg Asn Asp Ile Thr Met Glu Gly

100 105 110

Asp Thr Phe Tyr Asn Lys Val Arg Phe Tyr Gly Thr Asn Phe Pro Ala

115 120 125

Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr

130 135 140

Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Thr Gly Asp Ile Glu Met

145 150 155 160

Ala Leu Leu Leu Glu Gly Asn Ala His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr

165 170 175

Thr Tyr Lys Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Leu Pro Gly Ala His Phe

180 185 190

Val Asp His Ala Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys

195 200 205

Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala His Ser Gly Leu Pro Asp Asn

210 215 220

Ala Arg Arg

225

Claims (10)

1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基中一个或多个或全部不变且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质在作为光控荧光蛋白中的应用。

5.利用光电联合成像方法定位目的蛋白的方法，包括：将权利要求1所述蛋白质的编码基因与目的蛋白的编码基因连接后导入目的细胞、目的组织、目的器官或目的个体中，使所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体表达权利要求1所述蛋白质与所述目的蛋白形成的融合蛋白质，利用光电联合成像方法检测权利要求1所述蛋白质的位置，实现对所述目的蛋白的定位。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因与所述目的蛋白的编码基因通过含有所述蛋白质的编码基因与所述目的蛋白的编码基因的表达载体导入所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体中。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述光电联合成像方法中采用锇酸固定方法固定所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述光电联合成像方法中采用Epon树脂包埋方法包埋所述目的细胞、所述目的组织、所述目的器官或所述目的个体；

和/或，所述光电联合成像方法的光镜成像采用PALM方法进行。

9.含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的显色剂。

10.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的下述任一应用：

X1)蛋白质标记；

X2)荧光成像；

X3)光电联合成像；

X4)追踪蛋白质、亚细胞器、细胞局部区域、细胞或小型动物胚胎的结构和/或形态；

X5)解析目标蛋白质的结构和/或定位

X6)制备蛋白质标记产品；

X7)制备荧光成像产品；

X8)制备光电联合成像产品；

X9)制备追踪蛋白质、亚细胞器、细胞局部区域、细胞或小型动物胚胎的结构和/或形态产品；

X10)制备解析目标蛋白质的结构和/或定位产品。

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