CN112029754A - 一种印迹脂肪酶及其合成蔗糖-6-乙酯的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种印迹脂肪酶及其合成蔗糖‑6‑乙酯的应用，所述印迹脂肪酶按如下方法制备：向脂肪酶酶液中，加入脂肪酸、糖醇，搅拌使其混合均匀，调节混合酶液pH为6.5‑8.5，在20‑30℃恒温下，以120‑160转/分钟的速度搅拌10‑25分钟后，立刻加入大孔树脂，在25‑35℃恒温、60‑100转/分钟下搅拌吸附3‑6h，过滤，获得滤液和滤饼；滤饼用蒸馏水洗涤后，真空干燥，获得印迹脂肪酶；本发明以糖醇辅助，10‑18碳链脂肪酸为印迹分子在水相中印迹脂肪酶，明显提高了印迹酶在有机溶剂中催化酯化的性能，蔗糖酯化率可以提高10％左右，蔗糖酯的六位酯化率可以提高近10％。

Description

一种印迹脂肪酶及其合成蔗糖-6-乙酯的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种印迹脂肪酶及其合成蔗糖-6-乙酯的应用。
(二)背景技术
脂肪酶具有良好的催化酯化性能，在医药、食品产业有广泛的用途。以底物或底物类似物印迹脂肪酶，提高酶的催化酯化效果，是当前脂肪酶研究的热点技术，并取得了一定的进展。根据已公开报道的印迹技术，采用有机酸或酯类化合物作为印迹分子开展脂肪酶印迹，在水配制的缓冲液中采用乙醇为印迹物的助溶剂，以表面活性剂乳化，完成脂肪酶印迹，可以一定程度改变脂肪酶空间构型，从而提高脂肪酶催化性能。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种印迹效果明显提高的脂肪酶印迹方法，在水配制的缓冲液中以脂肪酸作为印迹化合物，加入糖醇辅助，可明显提高对脂肪酶的印迹效果，较现有国内外脂肪酶的印迹技术均有优势。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种印迹脂肪酶，所述印迹脂肪酶按如下方法制备：将脂肪酶溶解在pH为6.5-8.5缓冲液中，超声助溶(优选300W功率超声5分钟)，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到脂肪酶酶液；向脂肪酶酶液中，加入脂肪酸、糖醇，搅拌使其混合均匀，调节混合酶液pH为6.5-8.5(优选用0.01M的NaOH水溶液或0.05M的磷酸水溶液调节)，在20-30℃恒温下，以120-160转/分钟的速度搅拌10-25分钟后，立刻加入大孔树脂，在25-35℃恒温、60-100转/分钟下搅拌吸附3-6h，过滤，获得滤液和滤饼；滤饼用蒸馏水洗涤后，真空干燥，获得印迹脂肪酶；所述脂肪酸为C10-C18脂肪酸，优选为下列之一：油酸、葵酸、棕榈酸、硬脂酸、月桂酸；所述糖醇为下列之一：山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇。
所述缓冲液优选为0.05mol/L、pH7.5的磷酸钠缓冲液，所述缓冲液体积用量以脂肪酶重量计为40-100ml/g，优选45-85ml/g；所述脂肪酶酶液中脂肪酶与脂肪酸重量比为1：2-4.5(优选1:3-3.5)；所述脂肪酶酶液中脂肪酶与糖醇重量比为1：8-23(优选1:13-17)。
所述大孔树脂的型号为下列之一：D4006、D3520、D1300；所述大孔树脂添加量与脂肪酶酶液中脂肪酶重量比为20～55：1。所述大孔树脂在加入前先进行预处理，所述预处理方法为：将大孔树脂置于烧杯中，加入体积浓度95％乙醇水溶液，于室温(25-30℃)、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换体积浓度95％乙醇水溶液，震荡结束后，每次用300ml蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤液蒸馏回收乙醇，滤饼即为预处理后的大孔树脂；所述体积浓度95％乙醇水溶液体积用量以大孔树脂重量计为10ml/g。
本发明还提供一种所述印迹脂肪酶在催化蔗糖合成蔗糖-6-乙酯中的应用，所述的应用方法为：将蔗糖、印迹脂肪酶、4A分子筛加入叔戊醇与二甲基亚砜复配的溶剂中，再加入乙酸乙烯酯，混匀，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min离心10min，取上层清液在真空度0.1个标准大气压下80℃回收溶剂，获得蔗糖-6-乙酯。
所述蔗糖与乙酸乙烯酯的质量之比为1:2.5；所述蔗糖与印迹脂肪酶重量比为1：9.7；所述蔗糖与4A分子筛重量比为1：9.7；所述叔戊醇、二甲基亚砜体积用量以蔗糖重量计分别为77.7ml/g和19.4ml/g。所述4A分子筛使用1前先在180℃干燥6小时。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明以糖醇辅助，10-18碳链脂肪酸为印迹分子在水相中印迹脂肪酶，与有机酸和酯类化合物为印迹分子的方法比较，对脂肪酶的印迹效果更突出，明显提高了印迹酶在有机溶剂中催化酯化的性能。将印迹脂肪酶应用于有机溶剂中合成蔗糖-6-乙酯，蔗糖酯化率可以提高10％左右，蔗糖酯的六位酯化率可以提高近10％，表明脂肪酶的催化酯化能力与选择性均提高，效果明显优于国内外已公开的印迹脂肪酶。
(四)附图说明
图1为牛血清蛋白的标准曲线。
图2为实施例1液相色谱图。
图3为实施例1蔗糖-6-乙酯碳谱图。
图4为实施例1蔗糖-6-乙酯氢谱图。
图5为实施例1蔗糖-6-乙酯二维核磁谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1、试剂
大孔树脂预处理：将D4006型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司生产)150g置于2500mL的烧杯中，加入1500ml体积浓度95％乙醇水溶液，于室温、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换体积浓度95％乙醇水溶液。震荡结束后，每次用300ml蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤液蒸馏回收乙醇，滤饼即为预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、检测
(1)脂肪酶含量的测定
采用考马斯亮兰分光光度法，以考马斯亮兰试剂与酶蛋白溶液或脂肪酶酶液显色，在595nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，以标准曲线法得到酶蛋白或脂肪酶含量，具体方法如下：
准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL体积浓度95％乙醇水溶液中，加入100mL体积浓度85％磷酸水溶液，用蒸馏水稀释至1000mL，配制得到考马斯亮蓝试剂。用去离子水配制100μg/mL牛血清蛋白(BSA)标准溶液，按表1混和，各试管配制完毕，摇匀，室温下显色2min，在595nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，蛋白含量为横坐标作图，并制作标准曲线，见图1。由图1可知，其标准曲线方程为Y＝6.3014X-0.0062，R2＝0.9948。
表1牛血清蛋白标准曲线制作
Figure BDA0002630559060000031
(2)固定化率的计算：
测定初始酶液和树脂吸附后酶液的吸光值A1和A2，根据图1标准曲线分别计算蛋白含量X1和X2，继而算出总蛋白含量b1和b2。
b(mg)＝蛋白含量(X)/取样体积(ml)×酶液体积(mL)
固定化率计算公式如下：固定化率％＝(b1-b2)/b1×100％
(3)蔗糖-6-乙酯液相色谱分析检测方法
安捷伦1200液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，色谱条件：ZORBAX SB-Aq色谱柱(5μm 4.6*250mm，美国Agilent)，流动相：去离子水，流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量5μL。蒸发光检测器(美国Alltech 3300)，检测条件：温度85℃，氮气流速1.5L/min。记录色谱图，计算酯化率与蔗糖6位酯化选择率。酯化率％＝生成产物蔗糖-6-乙酯的量/初始蔗糖的量×100％。蔗糖-6-乙酯的选择性％＝蔗糖-6-乙酸酯的量/蔗糖总酯的量×100％。
3、印迹脂肪酶的制备
(1)将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.5克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L pH7.5)中，300W功率超声5分钟助溶，使脂肪酶充分溶解，若有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶酶液(即初始酶液)，pH为7.5，采用考马斯亮兰分光光度法检测脂肪酶含量为2.8mg/ml。
(2)称取4.0克油酸(济南润昌化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)的356ml初始酶液中，再加入山梨糖醇20克(石家庄华旭药业有限责任公司生产，化学纯)，搅拌使各成分充分混合均匀，pH为7.5，在25℃恒温、150转/分钟条件下搅拌20分钟，然后加入步骤1预处理后的D4006型大孔树脂30克，在30℃、80转/分钟条件下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液(即树脂吸附后酶液)和滤饼。采用考马斯亮兰分光光度法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为94.3％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤，在0.1个标准大气压、40℃的真空干燥箱中干燥8h，即得印迹脂肪酶11.7克。
4、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
蔗糖-6-乙酯的制备：称取0.3mmol(0.103g)蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃恒温和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml后，进液相色谱分析(图2)，每组实验三个平行样，计算酯化率与蔗糖6位酯化选择率。印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率93.6％，蔗糖6位酯化选择率91.3％。
剩余上清液在真空度0.1个标准大气压下、80℃回收溶剂后，获得蔗糖-6-乙酯产品0.115g。
蔗糖-6-乙酯产品的纯化：用乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公生产，分析纯)，甲醇(国药集团化学试剂有限公生产，分析纯)及去离子水配制溶液，溶解蔗糖-6-乙酯产品，具体为：用200-300目硅胶(青岛圣浦林环保科技有限公司，层析级)装填玻璃柱，柱高35cm，柱直径2.5cm，乙酸乙酯:甲醇:水＝30:4:1(v/v/v)配制洗脱剂，以15ml洗脱剂溶解0.1g蔗糖-6-乙酯产品，然后上柱，用洗脱剂以流速1.5mL/min淋洗层析柱，收集淋洗出柱的第350-550ml淋洗液，在真空度0.1个标准大气压下80℃回收溶剂，得到纯度98.1％的蔗糖-6-乙酯0.016g。
蔗糖-6-乙酯的检测：0.015g上述方法制备的蔗糖-6-乙酯用1ml氘代甲醇(国药集团化学试剂有限公生产，分析纯)溶解后，以核磁共振波谱仪AVANCEⅢ500MHz(瑞士Bruker公司)进行氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、远程偶合谱(HMBC)分析，结果见图3-图5所示。以上图谱与欧洲专利(Sebek O.K.Notes on the historical development of microbialtransformation.In:Rosazza JP,ed.Microbial transformation bioactive compounds(Vol.I).Folrida:CRC press.1982:1-8.)的蔗糖-6-乙酸酯核磁数据相符，可以确定为蔗糖-6-乙酯。
实施例2：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂型号替换为D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)150克，其他同实施例1，获得预处理后的D3520型大孔树脂143克。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)6.3克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L pH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶酶液，经实施例1方法检测酶蛋白浓度3.9mg/ml。
(2)称取3.1克葵酸(江苏豪隆化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)354ml初始酶液中，再加入甘露糖醇19克(河北科隆多生物科技有限公司生产，化学纯)，搅拌使各成分充分混合均匀，以0.05M的磷酸水溶液调节溶液的pH为6.5，在30℃恒温、160转/分钟条件下搅拌25分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D3520型大孔树脂63克，在25℃恒温、100转/分钟下搅拌吸附6h，过滤，获得滤液和滤饼。采用实施例1方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为93.7％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得印迹脂肪酶28.3克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol(0.103g)蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml后，进液相色谱分析(检测方法同实施例1)，每组实验三个平行样。
印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率92.6％，蔗糖6位酯化选择率91.2％。
实施例3：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为D1300型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司生产)150g，其他同实施例1，获得预处理后的D1300型大孔树脂141g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase，北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产，13万单位/克)8.0克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L pH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的酶液358ml，经实施例1方法检测酶蛋白浓度2.1mg/ml。
(2)称取1.9克棕榈酸(广州市佐治利化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)352ml初始酶液中，再加入木糖醇6.0克(南京绿意生物科技有限公司生产，化学纯)，搅拌使各成分充分混合均匀，以0.01M的NaOH水溶液调节酶液的pH为8.5，在20℃、120转/分钟条件下搅拌下15分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D1300型大孔树脂40克，在35℃、60转/分钟条件下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为95.4％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得印迹脂肪酶15.2克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol(0.103g)蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后进液相色谱分析(方法同实施例1)，每组实验三个平行样。
印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率90.7％，蔗糖6位酯化选择率88.2％。
实施例4：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1大孔树脂替换为南开大学化工厂生产的D3520型大孔树脂150g，其他操作同实施例1，获得预处理后的D3520型大孔树脂143g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)5.2克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L pH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经实施例1方法检测酶蛋白浓度3.1mg/ml。
(2)称取3.6克硬脂酸(河南誉恒化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)355ml初始酶液中，再加入山梨糖醇25克(石家庄华旭药业有限责任公司生产，化学纯)，搅拌使各成分充分混合均匀，以0.05M的磷酸水溶液调节酶液的pH为7.0，在25℃恒温、140转/分钟下搅拌10分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D3520型大孔树脂26克，在30℃恒温、90转/分钟下搅拌吸附5h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为92.5％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得印迹脂肪酶9.3克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后同实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率91.8％，蔗糖6位酯化选择率90.3％。
实施例5：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为天津浩聚树脂科技有限公司生产的D4006型大孔树脂150g，其他同实施例1，获得预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.2克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/LpH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经实施例1方法检测酶蛋白浓度2.6mg/ml。
(2)称取2.9克月桂酸(济南汇丰达化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)356ml初始酶液中，再加入赤藓糖醇17.4克(南京通盈生物科技公司生产，化学纯)，搅拌使各成分充分混合均匀，以0.01M的NaOH水溶液调节酶液的pH为8.0，在30℃、130转/分钟下搅拌印迹15分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D4006型大孔树脂40克，在25℃、70转/分钟下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为94.8％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得印迹脂肪酶14.9克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后采用实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率91.7％，蔗糖6位酯化选择率90.3％。
对比例1：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为天津浩聚树脂科技有限公司生产的D4006型大孔树脂150g，其他同实施例1，获得预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.5克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/LpH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经检测酶蛋白浓度2.8mg/ml。
(2)称取4.0克油酸(济南润昌化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)355ml初始酶液中，再加入30ml体积浓度95％乙醇水溶液和3.0g吐温20，搅拌使各成分充分混合均匀，保持pH为7.5，在25℃、150转/分钟下搅拌印迹20分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D4006型大孔树脂30克，在30℃、80转/分钟下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为94.9％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得脂肪酸印迹脂肪酶11.5克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后采用实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
脂肪酸印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率77.8％，蔗糖6位酯化选择率81.3％。
对比例2：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为天津浩聚树脂科技有限公司生产的D4006型大孔树脂150g，其他同实施例1，获得预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.5克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/LpH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经检测酶蛋白浓度2.8mg/ml。
(2)称取2.0克辛酸(上海泛笛油脂科技有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)355ml初始酶液中，再加入30ml体积浓度95％乙醇水溶液和3.0g吐温20，搅拌使各成分充分混合均匀，保持pH为7.5，在25℃、150转/分钟下搅拌印迹20分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D4006型大孔树脂30克，在30℃、80转/分钟下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为94.7％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得脂肪酸印迹脂肪酶11.8克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后采用实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
脂肪酸印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率36.8％，蔗糖6位酯化选择率74.7％。
对比例3：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为天津浩聚树脂科技有限公司生产的D4006型大孔树脂150g，其他同实施例1，获得预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、印迹脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.5克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/LpH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经检测酶蛋白浓度2.8mg/ml。
(2)称取山梨糖醇20克(石家庄华旭药业有限责任公司生产，化学纯)，加入步骤(1)355ml初始酶液中，搅拌使各成分充分混合均匀，保持pH为7.5，在25℃、150转/分钟下搅拌印迹20分钟。印迹完毕立刻加入预处理后的D4006型大孔树脂30克，在30℃、80转/分钟下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为94.5％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得脂肪酸印迹脂肪酶11.3克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后采用实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
脂肪酸印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率31.2％，蔗糖6位酯化选择率71.9％。
对比例4：
1、试剂
大孔树脂预处理：将实施例1中大孔树脂替换为天津浩聚树脂科技有限公司生产的D4006型大孔树脂150g，其他同实施例1，获得预处理后的D4006型大孔树脂142g。
2、固定化脂肪酶
(1)初始酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)4.5克溶解在360ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/LpH7.5)中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的初始酶液359ml，经检测酶蛋白浓度2.8mg/ml。
(2)355ml酶液保持pH为7.5，加入预处理后的D4006型大孔树脂30克，在30℃、80转/分钟下搅拌吸附4h，过滤，获得滤液和滤饼。按实施例1的方法检测滤液中残余的酶量，计算固定化率为95.1％。滤饼用树脂质量三倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度40℃的真空干燥箱中干燥8h，干燥完毕即得脂肪酸印迹脂肪酶11.2克。
3、印迹脂肪酶应用于催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol蔗糖(0.103g)(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol乙酸乙烯酯(0.258g)(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，移取8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)，2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100ul用叔戊醇稀释至1.1ml，之后采用实施例1方法进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
脂肪酸印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率31.7％，蔗糖6位酯化选择率70.3％。

Claims (10)

1.一种印迹脂肪酶，其特征在于所述印迹脂肪酶按如下方法制备：将脂肪酶溶解在pH为6.5-8.5缓冲液中，超声助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到脂肪酶酶液；向脂肪酶酶液中，加入脂肪酸、糖醇，搅拌使其混合均匀，调节混合酶液pH为6.5-8.5，在20-30℃恒温下，以120-160转/分钟的速度搅拌10-25分钟后，立刻加入大孔树脂，在25-35℃恒温、60-100转/分钟下搅拌吸附3-6h，过滤，获得滤液和滤饼；滤饼用蒸馏水洗涤后，真空干燥，获得印迹脂肪酶；所述脂肪酸为C10-C18脂肪酸，所述糖醇为下列之一：山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇。
2.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述超声助溶条件为：300W功率超声5分钟。
3.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述脂肪酸为下列之一：油酸、葵酸、棕榈酸、硬脂酸、月桂酸。
4.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述缓冲液为0.05mol/L、pH7.5的磷酸钠缓冲液。
5.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述缓冲液体积用量以脂肪酶重量计为40-100ml/g；所述脂肪酶酶液中脂肪酶与脂肪酸重量比为1：2-4.5；所述脂肪酶酶液中脂肪酶与糖醇重量比为1：8-23。
6.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述大孔树脂的型号为下列之一：D4006、D3520、D1300；所述大孔树脂添加量与脂肪酶酶液中脂肪酶重量比为20～55：1。
7.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述大孔树脂在加入前先进行预处理，所述预处理方法为：将大孔树脂置于烧杯中，加入体积浓度95％乙醇水溶液，于室温、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换体积浓度95％乙醇水溶液，震荡结束后，每次用300ml蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤液蒸馏回收乙醇，滤饼即为预处理后的大孔树脂；所述体积浓度95％乙醇水溶液体积用量以大孔树脂重量计为10ml/g。
8.一种权利要求1所述印迹脂肪酶在催化蔗糖合成蔗糖-6-乙酯中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将蔗糖、印迹脂肪酶、4A分子筛加入叔戊醇与二甲基亚砜复配的溶剂中，再加入乙酸乙烯酯，混匀，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液在4000r/min离心10min，取上层清液在真空度0.1个标准大气压下80℃回收溶剂，获得蔗糖-6-乙酯。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述蔗糖与乙酸乙烯酯的质量之比为1:2.5；所述蔗糖与印迹脂肪酶重量比为1：9.7；所述蔗糖与4A分子筛重量比为1：9.7；所述叔戊醇、二甲基亚砜体积用量以蔗糖重量计分别为77.7ml/g和19.4ml/g。
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