CN112022881B - 一种蜂花粉脂提物及其提取方法与应用 - Google Patents

一种蜂花粉脂提物及其提取方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然植物药制剂技术领域，具体涉及一种蜂花粉脂提物及其提取方法与应用。所述蜂花粉脂提物的提取方法，利用提取剂对蜂花粉水溶液进行提取；所述提取剂由甲醇和二氯甲烷以体积比1：(1‑3)组成。本发明发现甲醇和二氯甲烷以特定体积比混合得到的混合液作为提取剂用于蜂花粉脂提物的提取，不仅能够保证提取物的安全性，而且对蜂花粉中功能性极性脂质具有显著的提取选择性，可较大程度提高蜂花粉中功能性极性脂质的含量，同时减少对极性较弱的甘油三酯以及长链饱和脂肪酸的提取程度，从而使蜂花粉脂提物具有预防/治疗急性肺炎的显著功效。

Description

一种蜂花粉脂提物及其提取方法与应用
技术领域
本发明属于天然植物药制剂技术领域，具体涉及一种蜂花粉脂提物及其提取方法与应用。
背景技术
急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是一种全身炎性反应综合征，临床表现为肺部急性呼吸窘迫(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)，是由各种非心源性原因所致的肺毛细血管内皮和肺泡上皮损伤，以及血管通透性增高而引起急性、进行性加重的呼吸困难、难治性低氧血症和肺水肿。临床上通常采取控制原发病与抗感染治疗、机械通气支持治疗、药物(如肾上腺皮质激素)治疗等来控制疾病进一步发展。
尽管药物治疗在很多急性肺炎患者中取得了积极的治疗效果，但仍有相当数量患者其临床症状得不到改善，因此仍需不断研发出新型药物用于预防、治疗急性肺炎。
蜂花粉是蜜蜂从植物雄蕊或裸子植物小孢子囊内采集的花粉粒，并加入了自身腺体分泌物、唾液，及花蜜粘合而形成的一种不规则扁圆形团状物。蜂花粉与其他蜂产品如蜂胶、蜂蜜相比，在营养价值上大不相同。例如，蜂花粉中富含更加丰富、多样的营养成分，包括碳水化合物、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、酚酸、黄酮、活性酶等；各种营养素之间的比例较蜂胶、蜂蜜中更为均衡；并且，蜂花粉中脂质含量特别是功能性磷脂，较蜂胶、蜂蜜中更高。
目前蜂花粉主要是作为功能性食品供人类食用，对于其中脂类物质的提取及其预防治疗功能的研究还未见报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种蜂花粉脂提物的提取方法。所述提取方法可较大程度提取到蜂花粉中功能性极性脂质，包括卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血型卵磷脂，并且降低对极性较弱的甘油三酯以及长链饱和脂肪酸的提取。这种提取选择性可使得蜂花粉脂提物对急性肺炎具有更好的预防/防止效果。
所述蜂花粉脂提物的提取方法，其是利用提取剂对蜂花粉水溶液进行提取；所述提取剂由甲醇和二氯甲烷以体积比1：(1-3)组成。
蜂花粉脂提物的定性定量分析检测中通常以甲醇-氯仿的混合液作为脂质提取试剂，但由于氯仿毒性较大，不适用于作为食品或药品的蜂花粉脂提物的提取，而且氯仿还易于提取到塑料容器中的污染物。
本发明发现，甲醇和二氯甲烷以特定体积比混合得到的混合液可作为提取剂用于蜂花粉脂提物的提取，不仅能够保证提取物的安全性，而且对蜂花粉中功能性极性脂质具有显著的提取选择性，可较大程度提高蜂花粉中功能性极性脂质的含量，同时减少对极性较弱的甘油三酯以及长链饱和脂肪酸的提取程度，从而使蜂花粉脂提物具有预防/治疗急性肺炎的显著功效。
优选地，所述提取剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:2，其提取选择性的效果最佳。
进一步优选地，所述蜂花粉与所述提取剂的质量体积比为1g：(3-6)mL，以保证对蜂花粉的充分提取。
进一步优选地，所述蜂花粉水溶液的浓度控制在(0.5-1)g/mL之间，研究表明合适的浓度更有助于提高提取效果。
本发明所述蜂花粉可选择新鲜蜂花粉，如自采集日起算6个月内且日常于-20℃及更低温度下储存的蜂花粉。
所述蜂花粉的品种优选茶花蜂花粉，其脂提物中活性组分群的协同作用更好，对急性肺炎的预防及治疗效果更佳。
优选地，所述提取方法还包括冰水浴中超声萃取，如此可减少蜂花粉脂提物发生氧化反应，从而保持蜂花粉脂提物的活性。
进一步优选地，所述超声萃取的条件为：功率60～100KHz，时间为30～60min。如此可使功能极性脂类提取最大化，并防止无效成分过度提取，从而使所得蜂花粉脂提物发挥相对更好的功效。
进一步优选地，所述冰水浴的温度为0～4℃。
作为本发明的具体实施方式之一，所述蜂花粉脂提物的提取方法，包括：
(1)将蜂花粉先经过冻干、粉碎、过筛50～300目后获得蜂花粉粉末，再配制成蜂花粉水溶液；
所述蜂花粉水溶液的浓度控制在(0.5-1)g/mL之间；
(2)利用提取剂对蜂花粉水溶液提取；所述提取剂由甲醇和二氯甲烷以体积比1：(1-3)组成；所述蜂花粉与所述提取剂的质量体积比为1g：(3-6)mL；
(3)将步骤(2)所得混合液于冰水浴中超声萃取，离心，收集下层清液；所述超声萃取的条件为：功率60～100KHz，时间为30～60min；所述冰水浴的温度为0～4℃；
所述离心的转速为2000～4000rpm；所述离心的温度为0～4℃，时间10～20min；
(4)将下层清液干燥，获得具有一定粘稠度的黄色固体，即得蜂花粉脂提物；所述干燥的条件为：温度0～4℃，氮气吹干。
本发明的第二目的是提供上述方法获得的蜂花粉脂提物。
所述蜂花粉脂提物中卵磷脂含量至少为5.2mg/g蜂花粉，脑磷脂含量至少为3.4mg/g蜂花粉，磷脂酰甘油含量至少为0.3mg/g蜂花粉，磷脂酰丝氨酸含量至少为0.1mg/g蜂花粉，溶血型卵磷脂含量至少为1.7mg/g蜂花粉；甘油二酯含量至少为4.6mg/g蜂花粉，单不饱和脂肪酸含量至少为1.4mg/g蜂花粉，多不饱和脂肪酸含量至少为3.2mg/g蜂花粉。
研究表明，本发明所述提取方法获得的脂提物具有较高浓度的功能极性脂类，较低浓度的甘油三酯以及长链饱和脂肪酸，由于活性成分群具有良好的协同作用，从而对急性肺炎起到更好的预防/治疗效果。
本发明的第三目的是提供上述蜂花粉脂提物在制备预防和/或治疗急性肺炎药物中的应用。
优选地，所述急性肺炎为细菌脂多糖诱导的急性肺炎。
本发明取得的有益效果如下：
本发明所述的提取方法可较大程度提取到蜂花粉中功能性极性脂质，包括卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血型卵磷脂，并且降低对极性较弱的甘油三酯以及长链饱和脂肪酸的提取。所得蜂花粉脂提物对急性肺炎具有良好的预防/防止效果。
附图说明
图1为茶花蜂花粉脂提物保护急性肺炎小鼠实验的肺部病理学得分。
图2为茶花蜂花粉脂提物保护急性肺炎小鼠实验的肺部炎症因子免疫组化得分。
图3为茶花蜂花粉脂提物和油菜蜂花粉脂提物分别灌胃急性肺炎小鼠的肺部病理学对比图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种茶花蜂花粉脂提物的制备方法，具体步骤如下：
1)将新鲜茶花蜂花粉于真空冷冻干燥机中冻干，之后利用中药粉碎机进行粉碎，通过50～300目筛孔后得蜂花粉粉末，并按料液比(g/mL)1:1.5比例通过涡旋震荡方式充分溶解于去离子水中，形成蜂花粉水溶液；
2)向蜂花粉水溶液中按体积比1:4添加提取剂，充分混匀后得到蜂花粉混合溶液；提取剂由甲醇、二氯甲烷按体积比1:2混合而成；
3)将蜂花粉混合溶液在0～4℃冰水浴中进行超声辅助萃取40min，超声功率为100KHz，并在4℃，3000rpm，15min条件下于冷冻离心机离心，收集下层清液；
4)利用氮吹仪在0～4℃下将步骤3)所述下层清液吹干，获得具有一定粘稠度的黄色固体即为茶花蜂花粉脂提物。
对本实施例所得茶花蜂花粉脂提物进行超高效液相色谱-串联四级杆-轨道阱-高分辨质谱的脂质组分析，结果如下：卵磷脂含量为5.2mg/g蜂花粉，脑磷脂含量为3.4mg/g蜂花粉，磷脂酰甘油含量为0.3mg/g蜂花粉，磷脂酰丝氨酸含量为0.1mg/g蜂花粉，溶血型卵磷脂含量为1.7mg/g蜂花粉，甘油二酯含量为4.6mg/g蜂花粉，甘油三酯含量为3.5mg/g蜂花粉，饱和脂肪酸含量为0.9mg/g蜂花粉，单不饱和脂肪酸含量为1.4mg/g蜂花粉，多不饱和脂肪酸含量为3.2mg/g蜂花粉。
试验例1:
本试验例检验实施例1所得茶花蜂花粉脂提物对急性肺炎的抑制作用。
具体检测步骤如下：
(1)试验动物饲养：共32只雄性ICR小鼠(6-8周龄，22-26g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于北京实验动物中心。
培养环境为光照(12h昼夜循环)，温度(20-23℃)，相对湿度为50％。小鼠自由饮食和饮水，日粮配方参照美国AIN-93M标准配方。
(2)试验分组：经过一周适应性饲喂后，小鼠被随机分为4组，每组8只。
正常组，供应正常饮食7天；
疾病组，供应正常饮食7天，但在第7天尾静脉注射1mg/kg细菌脂多糖；
地塞米松组，供应正常饮食7天，但在第7天注射细菌脂多糖前1h灌胃10mg/kg地塞米松；
茶花粉脂组(实施例1)，除供应正常饮食外，连续7天灌胃300mg/kg茶花蜂花粉脂提物，在第7天尾静脉注射1mg/kg细菌脂多糖。
(3)试验步骤：在第7天尾静脉注射细菌脂多糖3h后处死4组小鼠并体重、器官称重。用10％福尔马林固定小鼠肺组织，供后续组织病理学和免疫组化分析检测。
(4)试验结果：
肺部组织病理学结果显示：
疾病组较正常组相比，HE指数显著增高(如图1所示)，反映出疾病组小鼠由于细菌脂多糖刺激而导致大量炎症细胞浸润，产生急性肺炎；
地塞米松组和茶花粉脂组均较疾病组相比，HE指数显著降低(如图1所示)，反映出地塞米松和茶花蜂花粉脂提物均产生抑制肺炎的功效。
免疫组化结果显示：
疾病组较正常组相比，炎症因子COX-2和NLRP3的H得分值显著增高(如图2所示)，同样反映出疾病组小鼠由于细菌脂多糖刺激而导产生急性肺炎症状；
地塞米松组和茶花粉脂组均较疾病组相比，炎症因子COX-2和NLRP3的H得分值显著降低(如图2所示)，也反映出地塞米松和茶花蜂花粉脂提物均产生抑制肺炎的功效。
对比例1(正己烷提取剂)
本对比例提供一种茶花蜂花粉脂提物的制备方法，具体步骤如下：
1)将新鲜茶花蜂花粉于真空冷冻干燥机中冻干，之后利用中药粉碎机进行粉碎，通过50～300目筛孔后得蜂花粉粉末，并按料液比(g/mL)1:1.5比例通过涡旋震荡方式充分溶解于去离子水中，形成蜂花粉水溶液；
2)向蜂花粉水溶液中按体积比1:4比例添加正己烷提取剂，充分混匀后得到蜂花粉混合溶液；
3)将蜂花粉混合溶液在0～4℃冰水浴中进行超声辅助萃取40min，超声功率为100KHz，并在4℃，3000rpm，15min条件下于冷冻离心机离心，收集上层清液；
4)利用氮吹仪在0～4℃下将步骤3)所述的上层清液吹干，获得具有一定粘稠度的黄色固体即为茶花蜂花粉脂提物。
对对比例1所得茶花蜂花粉脂提物进行超高效液相色谱-串联四级杆-轨道阱-高分辨质谱的脂质组分析发现：
功能性极性脂质卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血型卵磷脂的总含量较实施例1得到的茶花蜂花粉脂提物中卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血型卵磷脂的总含量相比降低约35％；
而甘油三酯和长链饱和脂肪酸的总含量较实施例1得到的茶花蜂花粉脂提物中的甘油三酯和长链饱和脂肪酸的总含量相比增加约30％。
采用试验例1的方法测试后发现对比例1所得脂提物不具备抑制肺炎的功效。
对比例2(油菜蜂花粉)
本对比例提供一种油菜蜂花粉脂提物的制备方法，具体步骤如下：
1)将新鲜油菜蜂花粉于真空冷冻干燥机中冻干，之后利用中药粉碎机进行粉碎，通过50～300目筛孔后得蜂花粉粉末，并按料液比(g/mL)1:1.5比例通过涡旋震荡方式充分溶解于去离子水中，形成蜂花粉水溶液；
2)向蜂花粉水溶液中按体积比1:4比例添加提取剂，充分混匀后得到蜂花粉混合溶液；提取剂由甲醇、二氯甲烷按体积比1:2混合而成；
3)将蜂花粉混合溶液在0～4℃冰水浴中进行超声辅助萃取40min，超声功率为100KHz，并在4℃，3000rpm，15min条件下于冷冻离心机离心，收集下层清液；
4)利用氮吹仪在0～4℃下将步骤3)所述下层清液吹干，获得具有一定粘稠度的黄色固体即为油菜蜂花粉脂提物。
对本实施例所得油菜蜂花粉脂提物进行超高效液相色谱-串联四级杆-轨道阱-高分辨质谱的脂质组分析，结果发现：
卵磷脂含量为1.6mg/g蜂花粉，脑磷脂含量为0.4mg/g蜂花粉，磷脂酰甘油含量为0.07mg/g蜂花粉，磷脂酰丝氨酸含量为0.04mg/g蜂花粉，溶血型卵磷脂含量为0.5mg/g蜂花粉，甘油二酯含量为1.7mg/g蜂花粉，单不饱和脂肪酸含量为0.5mg/g蜂花粉，多不饱和脂肪酸含量为1.4mg/g蜂花粉。
采用试验例1的方法测试后发现对比例1所得脂提物不具备抑制肺炎的功效。
试验例2:
本试验例检验实施例及对比例所得脂提物对急性肺炎的抑制作用。
具体检测步骤如下：
(1)动物饲喂条件参考试验例1；
(2)试验分组：除设置试验例1所述正常组、疾病组、地塞米松组、茶花粉脂组外，还设置油菜粉脂组(即对比例2)，即除供应正常饮食外，连续7天灌胃300mg/kg油菜蜂花粉脂提物，在第7天尾静脉注射1mg/kg细菌脂多糖；
(3)试验步骤参考试验例1；
(4)试验结果：
肺部组织病理学结果显示，油菜粉脂组与疾病组相比，肺损伤情况无明显减轻(如图3所示)，反映出油菜蜂花粉脂提物无显著抑制肺炎的功效；进一步对比发现，茶花蜂花粉脂提物可显著减轻肺部组织炎性细胞浸润，发挥良好的抑制肺炎的功效。
由此可见，本发明所述茶花蜂花粉脂提物可发挥特有的减轻肺炎的作用，在预防、治疗肺炎领域具有广阔的应用前景。
对比例3(超声萃取不同)
本对比例提供一种茶花蜂花粉的提取方法，步骤如下：
1)将新鲜茶花蜂花粉于真空冷冻干燥机中冻干，之后利用中药粉碎机进行粉碎，通过50～300目筛孔后得蜂花粉粉末，并按料液比(g/mL)1:1.5比例通过涡旋震荡方式充分溶解于去离子水中，形成蜂花粉水溶液；
2)向蜂花粉水溶液中按体积比1:4添加提取剂，充分混匀后得到蜂花粉混合溶液；提取剂由甲醇、二氯甲烷按体积比1:2混合而成；
3)将蜂花粉混合溶液在室温条件下水浴超声辅助萃取40min，超声功率为100KHz，并在3000rpm，15min，室温条件下利用离心机进行离心，收集下层清液；
4)利用氮吹仪在室温条件下将步骤3)所述下层清液吹干，获得具有一定粘稠度的黄色固体即为茶花蜂花粉脂提物。
采用试验例1的方法测试后发现，对比例3所得提取物中部分功能极性脂质已被氧化，所得提取物不具备抑制肺炎的功效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种蜂花粉脂提物的提取方法，其特征在于，包括：
（1）将蜂花粉先经过冻干、粉碎、过筛50～300目后获得蜂花粉粉末，再配制成蜂花粉水溶液；
所述蜂花粉水溶液的浓度控制在（0.5-1）g/mL之间；
（2）利用提取剂对蜂花粉水溶液提取；所述提取剂由甲醇和二氯甲烷以体积比1：（1-3）组成；所述蜂花粉与所述提取剂的质量体积比为1g：（3-6）mL；
（3）将步骤（2）所得混合液于冰水浴中超声萃取，离心，收集下层清液；所述超声萃取的条件为：功率60~100 KHz，时间为30～60 min；所述冰水浴的温度为0～4 ℃；
所述离心的转速为2000～4000 rpm；所述离心的温度为0～4 ℃，时间10～20 min；
（4）将下层清液干燥，获得具有一定粘稠度的黄色固体，即得蜂花粉脂提物；所述干燥的条件为：温度0～4 ℃，氮气吹干；
所述蜂花粉为茶花蜂花粉。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:2。
3.权利要求1或2所述提取方法获得的蜂花粉脂提物。
4.根据权利要求3所述的蜂花粉脂提物，其特征在于，所述蜂花粉脂提物中卵磷脂含量至少为5.2 mg/g蜂花粉，脑磷脂含量至少为3.4 mg/g蜂花粉，磷脂酰甘油含量至少为0.3mg/g蜂花粉，磷脂酰丝氨酸含量至少为0.1 mg/g蜂花粉，溶血型卵磷脂含量至少为1.7 mg/g蜂花粉；甘油二酯含量至少为4.6 mg/g蜂花粉，单不饱和脂肪酸含量至少为1.4 mg/g蜂花粉，多不饱和脂肪酸含量至少为3.2 mg/g蜂花粉。
5.权利要求3或4所述的蜂花粉脂提物制备预防和/或治疗急性肺炎药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述急性肺炎为细菌脂多糖诱导的急性肺炎。
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