TWI818267B - 小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途，由於該小分子克弗爾胞外多醣萃取物係具有抑制NF-kB發炎因子、調控血糖、保護胰島細胞、保護腎臟細胞等功效，因此，透過投予有效量之本發明所揭小分子克弗爾胞外多醣萃取物或含有其之組合物係能夠改善或預防發炎反應、發炎相關疾病、高血糖及其相關病症、糖尿病、糖尿病併發症等疾病，其中，糖尿病併發症或高血糖相關病症係包含有高血磷症、高血脂症、糖尿病腎病變等。
Description
本發明係有關於發酵次產物之用途，特別係指一種小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途。
按，糖尿病是目前世界前十大流行的疾病之一，其死亡率更排在全球十大死因中的第七名，在眾多糖尿病類型中又以第二型糖尿病佔最多糖尿病總人口數，第二型糖尿病成因主要因胰島素阻抗所致，目前的藥物主要以提升胰島素分泌、降低糖質新生與促進細胞的醣類攝取來降低胰島素阻抗帶來的症狀，然而這些藥物大多數帶有極強的副作用與肝毒性，可能會使患者帶來較大的身體負擔。
克弗爾發酵乳乃係由乳酸菌及酵母菌所組成之克弗爾菌（kefir grain）發酵牛奶、羊奶或馬奶所得者，為一種流行於北高加索、東歐與俄羅斯地區的發酵飲品，近年已有許多研究已經證實克弗爾發酵乳中含有許多小分子胜肽，對於肥胖、腸胃道疾病、過敏等病症有改善之功效，並具有抗菌、提高傷口癒合、預防高血壓、抗氧化等功效。由於克弗爾發酵乳係為一種極具安全性且機能性之食品，長期服用對於人體亦不會產生不良副作用，故克弗爾發酵乳係為優質的營養補充品或機能性食品之原料。
本發明之主要目的係在於提供一種小分子克弗爾胞外多醣萃取物之第二用途，由於小分子克弗爾胞外多醣萃取物係同時具有抗發炎、調控血糖及促進胰島再生之多重功效，故透過投予有效量之小分子克弗爾胞外多醣萃取物或含有其之組合物至一個體，能夠有效地達到治療或/及預防發炎疾病、糖尿病或其併發症之功效。
緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種將小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於製備機能性組合物之用途，其中，該小分子克弗爾胞外多醣萃取物係分離自克弗爾發酵物而富含葡萄糖之混合物，其分子量為12kDa。
其中，該機能性組合物係得為一食品、一營養補充品或一醫藥組合物，並且，得依據需求而被製備為不同型態，如錠劑、粉劑、液態飲料等。
於本發明之一實施例中，該機能性組合物係為一抗發炎組合物，意即藉由投予含有有效量之小分子克弗爾胞外多醣萃取物至一個體，係能夠有效地抑制或改善發炎反應或其相關病症。
於本發明之一實施例中，該抗發炎組合物係能用以抑制複數器官內促發炎因子之表現，該些器官至少包含下列任二器官：脾臟、肺臟、肝臟、胰臟、腎臟，而該促發炎因子係為NF-kB蛋白。
於本發明之另一實施例中，該機能性組合物係為一治療或/及預防糖尿病及其相關病症之組合物，意即藉由投予含有有效量之小分子克弗爾胞外多醣萃取物至一罹患糖尿病或高血糖症之個體，能夠有效地預防或改善糖尿病、高血脂症、高血磷症、糖尿病腎病變、糖尿病肝損傷或糖尿病胰臟病變等疾病。
於本發明之一實施例中，該治療或/及預防糖尿病及其相關病症之組合物係能用以降低糖尿病所造成的飲水量增加及尿量增加之病徵。
於本發明之又一實施例中，該機能性組合物係為一血糖調控劑，具體來說，該血糖調控劑係能增加PI3K蛋白磷酸化及GLUT2蛋白之表現量，而能夠有效地達到延緩糖尿病惡化或預防糖尿病之功效。
於本發明之次一實施例中，該機能性組合物係為一促胰島再生組合物，具體來說，該促胰島再生組合物係能減少胰島β細胞凋亡、避免胰島β細胞受損，以有效地達到治療或改善胰島受損相關疾病之功效。
本發明係揭露一種小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途，而該小分子克弗爾胞外多醣萃取物係為一種克弗爾發酵次產物，分離自克弗爾粉，分子量小於12kDa，具有抑制NF-kB發炎因子、調控血糖、維持血糖穩定、保護胰島細胞、保護腎臟細胞等能力，因此，透過投予有效量之本發明所揭小分子克弗爾胞外多醣萃取物或含有其之組合物係能夠改善或治療發炎反應、發炎相關疾病、高血糖及其相關病症、糖尿病、糖尿病併發症、肝損傷，或是能夠有效地預防上述疾病之發生，其中，糖尿病併發症或高血糖相關病症係包含有高血磷症、高血脂症、糖尿病腎病變等。
以下，為能說明本發明之技術特徵將茲舉若干實例並搭配圖表做更詳細說明如後。
以下實例中所使用之克弗爾粉係為商業產品（中化健康生技，台灣台中）。進一步來說，克弗爾粉其係由將奶粉基質以克弗爾粒（kefir grain）作為發酵菌元於20℃下發酵20小時後，進行乾燥噴霧所得者，其內含有小分胜肽及小分子多醣。
以下實例中所使用之KE萃取物，係傳統以克弗爾粒分離的單一乳酸菌之發酵多醣（Kefiran extract; KE），屬於大分子多醣（＞805 kDa）。
以下實例所使用之細胞株，如小鼠巨噬細胞株RAW264.7（mouse macrophage cell line RAW264.7）等皆為商業細胞株，無須另外進行寄存，並且，所有細胞試驗皆僅為驗證本發明所揭技術特徵之功效，並非用以限制本發明之技術特徵及其解釋範圍。
以下實例所使用之NF-κB-螢光素酶+/+基因轉殖小鼠（下稱NF-kB-Luc小鼠），係為攜帶由NF-κB啟動子驅動之螢光素酶基因的小鼠，而能透過觀察螢光素酶活性（發光程度）來反應NF-κB之活性。
以下動物試驗都按照動物實驗相關指導準則進行，並且獲得國立中興大學動物照護利用委員會之核准。
實例一：製備克弗爾胞外多醣萃取物
取一定量之克弗爾粉溶4倍體積之蒸餾水，以95～100℃加熱4小時，而後於室溫下進行離心30分鐘（5000xg），離心結束後取上清液加入等體積之20%三氯乙酸溶液（Trichloroacetic acid）靜置30分鐘，於4℃離心30分鐘（5000xg），取上清液，將上清液用0.45 µm之過濾器過濾，取其濾液並加入三倍體積之95%酒精，等待沉澱；將沉澱完畢的液體於4℃離心30分鐘（5000xg），除去上清液收集沉澱物，其係為本發明所揭克弗爾胞外多醣萃取物（下稱KEPS萃取物），產率約為11.0 ± 0.4% (w/w)。凍乾後供下列實例使用。
實例二：製備習知克弗蘭萃取物
取Lactobacillus kefiranofaciens subsp. Kefiranofaciens（ATCC 43761）於MRS培養基（Man-Rogosa-Sharpe broth medium, LAB 094, Heywood, United Kingdom）於30°C之厭氧條件境下進行發酵，收集發酵液，加入等體積之20%三氯乙酸溶液（Trichloroacetic acid）於4℃離心30分鐘（5000xg）並過濾，取上清液，將上清液加入三倍體積之95%酒精，等待沉澱；將沉澱完畢的液體於4℃離心30分鐘（5000xg），得到之物係為克弗蘭萃取物（kefiran，下稱KE萃取物），產率約為0.08 ± 0.01% (w/v)。凍乾後供下列實例使用。
實例三：KEPS萃取物係為小分子多醣
將實例一所得KEPS萃取物及實例二所得之KE萃取物分別以蒸餾水回溶後，進行過濾（0.20μm）及脫氣處理，再分別取20μl溶液以HPSEC（high performance size-exclusion chromatography）管柱分析，結果如圖1所示，其中，使用標準品（pullulan standards, Shodex, Kanagawa, Japan）分別為6.2 kDa、10 kDa、21.7 kDa、48.8 kDa、113 kDa、210 kDa、366 kDa及805 kDa作為檢測KEPS萃取物及KE萃取物之分子量之點。
另將KEPS萃取物及KE萃取物分別以單糖高效液相色譜法檢測技術進行分析，結果如下表1所示。詳言之，將150mg KEPS萃取物及KE萃取物分別與2M之三氟乙酸（10ml）混合加熱後，於真空下進行蒸發乾燥，再加入等分的5ml去離子水重新溶解，分別得到KEPS萃取物及KE萃取物之樣品混合物。藉由先前研究（Yasuno S et. al）所揭方法製備ABEE衍生的單醣（p-Aminobenzoic acid ethyl ester-derivatized monosaccharides）。將各樣品混合物及各標準溶液之等分試樣（30μl）分別與ABEE試劑溶液（Seikagaku Co.，Tokyo，Japan）混合並加熱，冷卻後加入600μl的蒸餾水和600μl的氯仿，進行離心（4°C、1800×g、5分鐘），取出5μl上層水層進行HPLC分析，其中，HPLC分析係使用Gemini C 18管柱（Phenomenex C18 250 mm × 4.6 mm），分析條件為：管柱（90:10）的流動相為0.04 M硼酸鉀緩衝液（pH 8.9，溶劑A）和100％乙腈（溶劑B）；50°C；檢測波為308nm；流速為0.8ml / min；並且，所使用之10個糖標準品分別為葡萄醣醛酸、半乳醣醛酸、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、岩藻糖和鼠李糖。
表1：KEPS萃取物及KE萃取物之單醣組成
| 單醣 | KEPS萃取物(%) | KE萃取物 (%) |
| 半乳糖 | 1.20 ± 0.02 | 8.28 ±0.06 |
| 葡萄糖 | 98.1 ± 0.06 | 10.1 ± 0.08 |
| 甘露糖 | 0.74 ± 0.05 | 76.4 ± 1.23 |
由圖1之結果可知本發明所揭KEPS萃取物之分子量大小僅為12 kD，分子量明顯小於習知KE萃取物（分子量＞805 kDa）；並且，由表1之結果可知，KEPS萃取物及KE萃取物之組成係不相同，具體來說，KEPS萃取物中之主要成分為葡萄糖，而KE萃取物中之主要成分為甘露糖。
綜合圖1及表1之結果係清楚顯示本發明所揭KEPS萃取物與習知KE萃取物乃為不同組合物，意即本發明所揭KEPS萃取物係有別於習知克弗蘭，而為一種新穎之小分子多醣組合物。
實例三：細胞毒性分析
將小鼠巨噬細胞株RAW264.7（每孔1×10
6cells）分別處理不同濃度（0、2、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000 μg/ml）之KEPS萃取物或KE萃取物，另以1μg/ ml脂多醣處理之細胞作為陽性控制組，分別培養24小時後進行細胞存活率分析（MTT分析），檢測波長為550nm，結果如圖2A及圖2B所示，其中，培養條件為37°C、5％二氧化碳及濕度為95％之空氣，使用添加10％胎牛血清、4 mM L-谷氨酰胺、100μg/ mL鏈黴素和100U / mL青黴素之DMEM 培養基。
由圖2A及圖2B之結果可知，相較於脂多醣處理之細胞來說，以KEPS萃取物或KE萃取物處理細胞係能夠提升細胞之存活率，並且，當KEPS萃取物或KE萃取物濃度高於2μg/ ml時係具有刺激細胞增殖之活性；換言之，由圖2A之結果顯示本發明所揭KEPS萃取物不具有細胞毒性。
實例四：抗發炎試驗
取小鼠巨噬細胞株RAW264.7（每孔1×10
6cells），其中，培養條件係如同實例三所述。將小鼠巨噬細胞株RAW264.7分為A組及B組，其中，A組係為未處理脂多醣之模式，並分別以不同濃度（0、7.8、31.3、125 μg/ml）之KEPS萃取物或KE萃取物處理細胞；B組係為處理脂多醣（1μg/ ml）之模式，意即各孔細胞同時處理脂多醣及不同濃度（0、7.8、31.3、125 μg/ml）之KEPS萃取物或KE萃取物；A組及B組之各孔細胞依據處理條件處理後培養24小時，收及其細胞培養上清液，以ELISA套組（Abcam, Cambridge, MA, USA）進行細胞因子測定，結果如圖3A及圖3B所示。
由圖3A之結果可知，於細胞未處理脂多醣之條件下，投予KEPS萃取物或KE萃取物對於細胞分泌IL-6之量並未有影響；但由圖3B之結果可知，當細胞培養環境中加入脂多醣後，細胞會受到脂多醣刺激而分泌IL-6，而若同時投予KEPS萃取物或KE萃取物係會抑制細胞受脂多醣刺激分泌IL-6，並且當投予KEPS萃取物之濃度為7.8及125 μg/ml時，抑制細胞受脂多醣刺激分泌IL-6較佳。
由圖3A及圖3B之結果證實本發明所揭KEPS萃取物係能夠抑制細胞發炎激素分泌，而能達到預防或減緩發炎反應之功效。
實例五：生物發光影像分析（一）
取8週齡雄性及雌性NF-kB-Luc小鼠複數隻，隨機分為5組，並分別以下列條件處理各組小鼠：
控制組：未投予任何藥物或樣品；
LPS組：投予12.5 mg / kg之脂多醣；
KEPS/LPS組：投予12.5 mg / kg之脂多醣及100 mg / kg之本發明所揭KEPS萃取物；
KE/LPS組：投予12.5 mg / kg之脂多醣及100 mg / kg之習知KE萃取物；
ASA/LPS組：投予12.5 mg / kg之脂多醣及12.5 mg / kg之阿斯匹靈（acetylsalicylic acid）；
其中，KEPS/LPS組與KE/LPS組係為先投予KEPS萃取物或KE萃取物7天，再以腹腔注射方式投予脂多醣；ASA/LPS組係為投予腹腔投予脂多醣前1小時先投予阿斯匹靈。
除控制組小鼠外，其餘小鼠皆於投予脂多醣24小時後以活體冷光影像（In Vivo Imaging System）照射分析各組小鼠體內冷光成像並進行定量，結果如圖4A至圖4D所示；並且犧牲各組小鼠，取心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、腸等組織，以活體冷光影像觀察照射分析各組小鼠之各器官的冷光成像並進行定量，結果如圖5A至圖5D所示。
由圖4及圖5之結果可知，相較於控制組來說，LPS組小鼠全身和體內器官發光強度明顯提升，其中又以雌性NF-kB-Luc小鼠之腸組織發光強度最高（如圖4A及圖5A所示）。就雌性NF-kB-Luc小鼠來說，KEPS/LPS組、KE/LPS組和ASA/LPS組之全身及其體內器官之發光強度皆較LPS組者明顯下降；而就雄性NF-kB-Luc小鼠來說，投予脂多醣僅能刺激脾臟和胰腺中的發光信號，但是KEPS/LPS組和/或KE/ LP組中的熒光素酶強度明顯低於LPS組。
由圖4及圖5之結果顯示當個體暴露於高氧化壓力環境下，如脂多醣誘導形成之氧化壓力時，投予一定量之本發明所揭KEPS萃取物係能夠保護個體或其體內器官抵抗氧化壓力，有效地避免或預防高氧化壓力所造成之疾病或器官損傷。
實例六：分析發炎相關細胞因子表現（一）
取實例五中各組NF-kB-Luc小鼠脾臟、肺臟、肝臟，經蛋白質萃取與電泳膠體分離後，以西方墨點法檢測各組小鼠體內器官中與發炎相關細胞因子之表現，包含有NF-κB、MAPK、p-NF-κB 或p-MAPK，結果如圖6至圖8所示。
由圖6至圖8之結果可知，相較於控制組，LPS組NF-kB-Luc小鼠脾臟、肺臟及肝臟中之p-NF-κB表現量係明顯增加，並會使雌性NF-kB-Luc小鼠脾臟內p-MAPK表現量增加，顯示投予脂多醣會促使個體器官內產生促發炎細胞因子，進而會產生發炎反應。相較於LPS組，KEPS/LPS組及KE/LPS組NF-kB-Luc小鼠器官中之p-NF-κB及p-MAPK表現量皆明顯下降，顯示投予本發明所揭KEPS萃取物係能夠有效地抑制促發炎因子表現，意即能夠調控與發炎相關蛋白：p-NF-κB及p-MAPK之表現，進而達到預防或治療發炎或其相關疾病之功效。
實例七：生物發光影像分析（二）
參照實例七所述流程，取正常小鼠及NF-kB-Luc小鼠，並將NF-kB-Luc小鼠隨機分組，各組小鼠分別以下列條件處理之：
正常控制組：為正常小鼠，未投予任何藥物或測試樣品；
LPS組：為NF-kB-Luc小鼠，以腹腔方式投予5 mg/kg 脂多醣；
LPS/KEPSL組：為NF-kB-Luc小鼠，先投予7天本發明所揭KEPS萃取物，劑量為50 mg/kg，再以腹腔方式投予5 mg/kg 脂多醣；
LPS/KEPSH組：為NF-kB-Luc小鼠，先投予7天本發明所揭KEPS萃取物，劑量為100 mg/kg，再以腹腔方式投予5 mg/kg 脂多醣；
其中，各組小鼠於投予脂多醣24小時後，以活體冷光影像進行照射分析，結果如圖9A及圖9B所示。
由圖9A及圖9B之結果可知，相較於正常控制組之小鼠，LPS組小鼠具有高度冷光的呈像，顯示投予脂多醣確實能夠誘導小鼠具有全身性發炎反應，並且於腎臟、腸道、胰臟、肺部及大腦等器官具有明顯發炎反應；而相較於正常控制組之小鼠來說，LPS/KEPSL組及LPS/KEPSH組小鼠之冷光強度皆下降，並且隨著所投予之本發明KEPS萃取物劑量之增加而提升抑制冷光強度之效果，顯示本發明所揭KEPS萃取物確實能夠抑制脂多醣所誘導之全身性發炎反應，且抑制效果係隨著投予劑量增加而提升。
實例八：分析發炎相關細胞因子表現（二）
將實例七中試驗完成之各組小鼠予以犧牲，並分別取其胰臟及腎臟，經蛋白質萃取與電泳膠體分離後，以西方墨點法進行定量分析各組織中NF-kB及p-NF-κB之表現，結果如圖10A及圖10B所示。
由圖10A及圖10B之結果顯示，LPS組小鼠於胰臟及腎臟中具有大量的NF-kB發炎因子之蛋白表現，顯示投予脂多醣會促使體內器官產生發炎反應；而相較於LPS小鼠來說，LPS/KEPSL組及LPS/KEPSH組小鼠胰臟與腎臟之NF-kB發炎因子表現明顯下降，顯示投予本發明所揭KEPS萃取物係能夠抑制脂多醣所誘導之NF-kB發炎因子表現，並且抑制發炎因子之效果係隨著投予劑量之增加而提升。
實例九：動物試驗
取8週齡雄性Sprague Dawley （SD）品系大鼠（購自台灣樂斯科生物科技股份有限公司），試驗期間共8週，試驗期滿後犧牲各組大鼠。試驗時間都餵食60％高脂飼料。於試驗第4週時，禁食16小時後，腹腔注射STZ（35 mg/kg/bw，溶於pH 4.4的檸檬酸緩衝液中）進行糖尿病誘導處理，並於3日後空腹12小時後檢測大鼠血糖、血清中胰島素含量，再透過HOMA-IR公式及HOMA-β細胞功能公式得到胰島素指數及β細胞功能指數，並管餵2 g/kg/bw葡萄糖溶液進行葡萄糖耐受性試驗（Oral glucose tolerance test，OGTT），後於30、60、90、120分鐘時分別記錄大鼠血糖值，上述試驗結果係如圖11A至圖11F所示。
由圖11A至圖11D之結果可知，經STZ誘導處理之大鼠的血糖值明顯上升、HOMA-IR值高於正常值（2.8）且β細胞功能明顯下降；由圖11E及圖11F之結果可知以STZ誘導之大鼠鼠血糖均超出正常值200 mg/dl，且經PGAUC公式計算OGTT曲線下面積，高於未經STZ誘導之大鼠的平均數值501.4 mg h/dl。由圖11A至圖11F之結果顯示同時以高脂飼料及STZ誘導確實能夠建立第二型糖尿病模式。
其中：
HOMA-IR指數= 空腹血糖值(mg/dl) x 血清胰島素值(µIU/mL)/405
HOMA-β細胞功能指數=20 x 血清胰島素值(µIU/mL)/(空腹血糖值(mg/dl)/18-3.5)
將檢測結果為空腹血糖值大於等於200 mg/dl且餵食葡萄糖溶液（2 g/kg/bw）2小時後血糖值大於等於200mg/dl之大鼠進行分組。各組大鼠之處理條件說明如下：
第1組係為正常組，誘導處理程序以檸檬酸緩衝液作為安慰劑取代STZ，並口服餵食蒸餾水；
第2組係為空白對照組，注射STZ誘導糖尿病，並誘導時口服餵食蒸餾水；
第3組係為KEPS高劑量組，注射STZ誘導糖尿病，於試驗第5週開始口服餵食本發明所揭KEPS萃取物，劑量為100 mg/kg/day；
第4組係為KEPS低劑量組，注射STZ誘導糖尿病，於試驗第5週開始口服餵食本發明所揭KEPS萃取物，劑量為50 mg/kg/day。
實例十：分析各組大鼠之生理數值
實例九之各組大鼠於試驗期間之每週進行各組小每週檢測其體重、尿量、攝食量、飲水量及血糖，結果如圖12A至圖12E所示。
由圖12A及圖12B之結果可知，第2組至第4組大鼠於試驗第0週至第4週於高脂飼料之誘導下，體重呈現穩定上升，並因於第5週注射STZ後，體重呈現下降；由圖12C及圖12D之結果可知，第4組大鼠之飲水量及尿量明顯低於第2組大鼠之飲水量及尿量，且接近於第1組大鼠之飲水量及尿量，顯示投予本發明所揭KEPS萃取物係有助於改善糖尿病所引起之多飲及多尿症狀，並且於高劑量時效果較佳；由圖12E之結果可知，第2組至第4組大鼠於經高脂飼料與STZ共同誘導，其血糖皆明顯較第1組大鼠高，並所有大鼠空腹血糖值皆高於200 mg/dl，如第2組大鼠之平均空腹血糖值為353.71 mg/dl，而第3組與第4組大鼠之血糖值隨著投予本發明所揭KEPS萃取物之時間增加而下降，並且血糖下降程度與投予劑量間呈現正相關。
換言之，由圖12A至圖12E之結果顯示本發明所揭KEPS萃取物係能夠有效調降糖尿病個體之血糖值及改善或舒緩糖尿病所引起之病徵，如多飲或多尿，並且當投予劑量增加時，改善血糖及糖尿病相關病徵之效果會隨之增加，意即本發明所揭KEPS萃取物係具有治療或預防糖尿病或其相關病症之能力。
實例十一：分析KEPS萃取物對於血糖調控之胰島功能改善之功效
實例九中各組大鼠於8週試驗結束後，進行下列檢測：
採集各組大鼠血液，檢測血糖值與胰島素值，並HOMA-IR指標及HOMA-β細胞功能指數，結果如圖13A至圖13D所示；進一步將上述結果與實例九中於試驗第4週所得之結果相比，結果如圖13G至圖13H所示；
管餵2 g/kg/bw葡萄糖溶液進行葡萄糖耐受性試驗，於30、60、90、120分鐘時分別記錄大鼠血糖值，並將之結果與實例九中於試驗第4週所進行之葡萄糖耐受性試驗結果相比，結果如圖13E及圖13F所示。
由圖13A至圖13H之結果可知，第2組大鼠於高脂飼料及STZ誘導下出現糖尿病，以致於血糖大幅提高、葡萄糖耐受性增加，並且由圖13C及D可知第2組大鼠之胰島素阻抗上升且胰島β細胞功能下降。相較於第2組大鼠來說，第3組及第4組大鼠之血糖值下降，且能阻止葡萄糖耐受性降低嚴重化，意即能夠提升個體之葡萄糖耐受性，表示本發明所揭KEPS萃取物能夠有效地調控血糖，使個體血糖不論於空腹或用餐後都能夠維持穩定；又，第3組及第4組大鼠胰島素阻抗之情形明顯下降、胰島β細胞功能指數上升（圖13B至圖13D），表示本發明所揭KEPS萃取物能確實具有使胰島β細胞再生且提升胰島β細胞功能之功效。
由圖13A至圖13F之結果證明對於罹患糖尿病或血糖不穩之個體投予一定量之本發明所揭KEPS萃取物，係能夠有效地治療或預防糖尿病或其相關病症，並且能夠提升胰島β細胞功能，以降低胰島素阻抗之情形，並且，本發明所揭KEPS萃取物治療或預防糖尿病及其相關病症之效果係隨著投予劑量之增加而提升。
實例十二：分析KEPS萃取物對於肝腎代謝之影響
實例九中各組大鼠於8週試驗結束後，分別取其血液，以商業檢測套組檢測高密度脂蛋白（high density lipoprotein，簡稱HDL）、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白（low density lipoprotein/ very low density lipoprotein，簡稱LDL/ VLDL）、三酸甘油酯、磷、血液尿素氮（blood urea nitrogen，簡稱BUN），結果如圖14A至圖14E所示。
由圖14A至圖14C之結果可知，第3組或第4組大鼠血清中低密度脂蛋白、三酸甘油脂之含量係較第2組大鼠血清中低密度脂蛋白、三酸甘油脂之含量為低。如同本發明所屬技術領域者所周知者，基於低密度脂蛋白及三酸甘油脂之含量增加係為高血脂症狀，並且高血脂係為糖尿病個體中最常見之病症，因此，由圖14A至圖14C之結果可證實，投予一定量之本發明所揭KEPS萃取物至罹患糖尿病之個體或是血糖不穩定之個體，係能夠有效降低其血清中低密度脂蛋白、三酸甘油脂之含量，進而能夠達到治療或預防糖尿病所引發之高血脂其其相關病症之功效，並且，治療或預防之效果係隨著投予劑量之增加而提升。
再者，由圖14D及圖14E之結果可知，相較於第1組大鼠來說，第2組大鼠血清中磷、血液尿素氮含量明顯上升，代表第2組大鼠因為罹患糖尿病或高血糖症而使腎臟功能受損，以致於出現高血磷症或糖尿病腎病變之情形；而相較於第2組大鼠，第3組或第4組大鼠血清中磷與血液尿素氮之含量係較低，顯示本發明所揭KEPS萃取物係能夠保護腎臟免受高血糖影響而受損，達到降低或預防糖尿病或高血糖症患者發生腎臟受損情形之功效。換言之，透過投予一有效量之本發明所揭KEPS萃取物係能夠延緩或預防由高血糖或糖尿病引起之腎臟病變疾病，例如高血磷症、糖尿病腎病變。
實例十三：胰臟組織切片分析
實例九中各組大鼠於試驗結束後予以犧牲，取其胰臟進行組織切片，分別進行蘇木精和伊紅（hematoxylin & eosin stain, H&E）染色及免疫組織化學染色，結果如圖15A所示。
進一步分析各組大鼠胰臟組織切片，包含對β細胞凋亡程度進行胰臟病變程度進行評分、分析胰島切片中之胰島數量及免疫染色中胰島素表達面積占比，而胰島病變分數係依據嚴重程度分為5級，其中，1級為最小病變，病變面積小於1％；2級為輕微病變，病變面積小於1-25％；3級為中等病變，病變面積小於26-50％；4級為中/重病變，病變面積小於51-75％；5級為嚴重/較高病變，病變面積小於76-100％；胰臟組織切片分析結果係如圖15B至圖15D所示。
由圖15A至圖15C之結果可知，第1組大鼠之胰島細胞型態最為完整其周圍形狀也較接近圓弧；第2組之胰島型態較為萎縮，且胰島周圍出現細碎的稜稜角角，並內部的β細胞有出現大量的細胞凋亡的情形；第3組大鼠胰臟H&E染色切片中，其胰島萎縮現象相對於第2組有改善，並胰島周圍具有如第2組中的細碎稜角，根據病理判讀報告指出其細胞凋亡的情形（黑色箭頭處）雖較第1組升高，但相較於第2組卻有明顯下降（圖15B）；第4組大鼠胰臟H&E染色切片中之胰島形狀與胰島的完整度較接近第1組的型態，其胰島周圍的稜角較第2組及第3組大鼠減少且更加趨近於圓弧，而在胰島中雖然仍有細胞凋亡的發生，但其發生的數量相對於第2組有顯著下降（圖15B）。
再者，由圖15A之結果可知，第1組大鼠之胰島素分布區域十分密集且其顏色顯示較深表示濃度較高；第2組大鼠之胰島素染色區域較為零碎，且顏色較淡；第3組大鼠之胰島素染色情形與第2組大鼠相近，但其胰島素染色之區域密集度較第2組組高；第4組大鼠之胰島素染色區域形狀趨近完整，未如第2組之胰島素呈現零碎狀態。又，如圖15D之結果顯示，第2組大鼠胰島素表達面積係較第1組大鼠顯著下降；第3組大鼠胰島素表達面積雖然較第1組大鼠低，但是較第2組大鼠仍是明顯提升；第4組大鼠胰島素表達面積不僅較第2組大鼠來說呈現明顯提升之結果，並且，幾乎與第1組大鼠間明顯差異，表示於高劑量之本發明所揭KEPS萃取物之投予下，係能使胰島細胞再生。
由圖15A至圖15D之結果顯示本發明所揭KEPS萃取物確實能夠有效地降低胰島的萎縮與細胞凋亡發生之情形，並且，高劑量之本發明所揭KEPS萃取物係具有促進胰島再生之功效，由此可知，投予有效量之本發明所揭KEPS萃取物至罹患糖尿病或高血糖症之個體，係能夠有效地達到預防或治療糖尿病及其相關病症之發生，並且能夠延緩糖尿病之惡化。
實例十四：腎臟組織切片分析
實例九中各組大鼠於試驗結束後予以犧牲，取其腎臟進行組織切片，分別進行蘇木精和伊紅染色，結果如圖16A所示；進一步分析各組大鼠腎臟組織切片，依據近曲小管病變程度進行評分，並計算出腎臟與體重之比例，而腎臟近曲小管病變病分數係依據嚴重程度分為5級，其中，1級為最小病變，病變面積小於1％；2級為輕微病變，病變面積小於1-25％；3級為中等病變，病變面積小於26-50％；4級為中/重病變，病變面積小於51-75％；5級為嚴重/較高病變，病變面積小於76-100％；分析結果係如圖16B及圖16C所示。
由圖16A及圖16B之結果可知，於第2組大鼠腎臟組織中，近曲小管大量出現管腔擴大的現象，代表腎臟組織已經病變而出現水樣變性（黑色箭頭處）；第3組及第4組大鼠之腎臟組織中雖然亦有出現多發性的近曲小管水樣變性之情形，但相較於第2組大鼠來說，第3組與第4組大鼠腎臟組織中近曲小管水樣變性之情形已經有改善，並且於第4組大鼠腎臟組織切片中更發現空泡大小明顯改善。由圖16C之結果可知，腎臟組織病變且產生水樣變性會使腎臟重量增加，而相較於第2組大鼠之腎臟重量，第3組與第4組大鼠之腎臟重量係較為下降。
由圖16A至圖16C之結果可證實本發明所揭KEPS萃取物係能夠保護腎臟細胞，以達到改善或減緩因高血糖或糖尿病所引發之腎臟病變。換言之，投予有效量之本發明所揭KEPS萃取物至罹患糖尿病或高血糖症之個體，係能夠有效地達到預防或治療糖尿病引起之腎臟病變。
實例十五：分析KEPS萃取物對於葡萄糖代謝相關蛋白表現之影響
實例九中各組大鼠於試驗結束後予以犧牲，取其肝臟，以西方墨點法檢測肝臟中PIK3、AKT及GLUT2蛋白之表現，並且進行定量，結果如圖17至圖19所示。
由圖17A至圖17C之結果可知，AKT蛋白在各組大鼠肝臟間表現量相近；以p-AKT蛋白表現量來說，第2組至第4組大鼠皆較第1組大鼠提高；並且根據AKT蛋白與p-AKT蛋白表現量計算出AKT蛋白磷酸化表現量（圖17C），可知第2組至第4組大鼠肝臟內AKT蛋白磷酸化表現量係呈現提高之趨勢。
由圖18A至圖18C之結果可知，以PI3K蛋白表現量來說，第2組至第4組大鼠皆較第1組大鼠之表現量下降，但第4組大鼠係較第2組大鼠之表現量明顯提升；而以p-PI3K蛋白表現量來說，第3組與第4組大鼠皆較第2組大鼠顯著提升；更進一步由PI3K磷酸化表現量（圖18C）可知，第2組大鼠PI3K蛋白磷酸化表現量較第1組大鼠明顯降低，而相較於第2組大鼠，第3組及第4組大鼠肝臟內PI3K蛋白磷酸化表現量不只顯著提升，甚至超越第1組大鼠PI3K蛋白磷酸化表達量。
由圖19之結果可知，以GLUT2蛋白質表現來說，第2組大鼠之表現量係明顯較第1組大鼠下降，而第3組與大鼠之表現量係幾乎與第1組大鼠相同，並第4組大鼠之表現量更是較第3組大鼠提升。
由圖17至圖19之結果顯示本發明所揭KEPS萃取物係能夠透過增加PI3K蛋白磷酸化來刺激PI3K/AKT途徑，進而使GLUT2蛋白表現量上升，以有效達到降低血糖或治療糖尿病及其相關病症之功效。
無
圖1係分析本發明所揭KEPS萃取物及習知KE萃取物之分子量的結果。
圖2A係為小鼠巨噬細胞株RAW264.7經不同濃度之KEPS萃取物處理24小時後之細胞存活率。
圖2B係為小鼠巨噬細胞株RAW264.7經不同濃度之KE萃取物處理24小時後之細胞存活率。
圖3A係為小鼠巨噬細胞株RAW264.7經不同濃度之KEPS萃取物或KE萃取物處理後檢測IL-6表現量之結果。
圖3B係為小鼠巨噬細胞株RAW264.7經同時處理脂多醣及不同濃度之KEPS萃取物或KE萃取物後，分別檢測各孔細胞IL-6表現量之結果。
圖4A係以活體冷光影像照射各組雌性小鼠個體之結果。
圖4B係為統計分析各組雌性小鼠之生物發光量的結果。
圖4C係以活體冷光影像照射各組雄性小鼠個體之結果。
圖4D係為統計分析各組雄性小鼠之生物發光量的結果。
圖5A係以活體冷光影像照射各組雌性小鼠心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、腸之結果。
圖5B係為統計分析各組雌性小鼠心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、腸之生物發光量的結果。
圖5C係以活體冷光影像照射各組雄性小鼠心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、腸之結果。
圖5D係為統計分析各組雄性小鼠心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、腸之生物發光量的結果。
圖6A係為各組雌性小鼠脾臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖6B係為各組雌性小鼠肺臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖6C係為各組雌性小鼠肝臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖7A係為各組雄性小鼠脾臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖7B係為各組雄性小鼠肺臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖7C係為各組雄性小鼠肝臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖8A係為各組雌性與雄性小鼠脾臟中MAPK及p-MAPK之表現。
圖8B係為各組雌性與雄性小鼠肺臟中MAPK及p-MAPK之表現。。
圖8C係為各組雌性與雄性小鼠肝臟中MAPK及p-MAPK之表現及其定量結果。
圖9A係以活體冷光影像照射各組小鼠個體之結果。
圖9B係為統計分析各組小鼠之生物發光量的結果。
圖10 A係為各組小鼠胰線中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖10 B係為各組小鼠腎臟中NF-κB及p-NF-κB之表現及其定量結果。
圖11A係為檢測正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠血糖值的結果。
圖11B係為檢測正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠血清中胰島素含量的結果。
圖11C係為正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠HOMA-IR指數。
圖11D係為正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠β細胞功能指數。
圖11E係為正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠之葡萄糖耐受性曲線圖。
圖11F係為統計分析正常大鼠及經STZ誘導處理之大鼠之葡萄糖耐受性曲線下面積積分之結果。
圖12A係為檢測各組大鼠於試驗第4週至第8週之體重的結果。
圖12B係為分析各組大鼠於試驗第4週至第8週之體重變化的結果。
圖12C係為檢測各組大鼠於試驗第4週至第8週之飲水量的結果。
圖12D係為檢測各組大鼠於試驗第4週至第8週之尿量的結果。
圖12E係為檢測各組大鼠於試驗第4週至第8週之血糖的結果。
圖13A係為檢測各組大鼠試驗結束後之血糖值的結果。
圖13B係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中胰島素含量的結果。
圖13C係為分析各組大鼠試驗結束後HOMA-IR指數之結果。
圖13D係為分析各組大鼠試驗結束後β細胞功能指數之結果。
圖13E係比較正常大鼠及經STZ誘導處理之各組大鼠於試驗結束後之葡萄糖耐受性之結果。
圖13F係比較正常大鼠及經STZ誘導處理之各組大鼠葡萄糖耐受性曲線下面積積分之結果。
圖13G係比較正常大鼠及經STZ誘導處理之各組大鼠於試驗結束後之HOMA-IR之結果。
圖13H係比較正常大鼠及經STZ誘導處理之各組大鼠胰島β細胞功能指數之結果。
圖14A係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中高密度脂蛋白含量的結果。
圖14B係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中低密度脂蛋白含量的結果。
圖14C係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中三酸甘油酯含量的結果。
圖14D係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中磷含量的結果。
圖14E係為檢測各組大鼠試驗結束後血清中尿素氮含量的結果。
圖15A係為各組大鼠胰臟組織切片染色之結果。
圖15B係依據各組大鼠胰臟組織切片β細胞凋亡程度進行病變程度評分之結果。
圖15C係為統計分析各組大鼠胰臟組織切片中胰島數量之結果。
圖15D係為各組大鼠胰臟組織經免疫組織染色後，以IMAGE J量化胰島的胰島素染色區域，分析各組大鼠胰島素表達面積占比之的結果。
圖16A係為各組大鼠腎臟組織切片染色之結果。
圖16B係依據各組大鼠腎臟組織近曲小管病變程度進行評分之結果。
圖16C係為統計分析各組大鼠腎臟體重比之結果。
圖17A係為各組大鼠肝臟中AKT蛋白表現量化之結果。
圖17B係為各組大鼠肝臟中p-AKT蛋白表現量化之結果。
圖17C係為各組大鼠肝臟中AKT蛋白磷酸化量化之結果。
圖18A係為各組大鼠肝臟中PI3K蛋白表現量化之結果。
圖18B係為各組大鼠肝臟中p-PI3K蛋白表現量化之結果。
圖18C係為各組大鼠肝臟中PI3K蛋白磷酸化量化之結果。
圖19係為各組大鼠肝臟中GLUT2蛋白表現量化之結果。
無
Claims (4)
- 一種將小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於製備治療胰島病變或其相關病症之組合物之用途，其中：該小分子克弗爾胞外多醣萃取物係分離自克弗爾發酵物而富含葡萄糖之混合物，其分子量為12kDa；該胰島病變相關病症係選包含有第1型糖尿病、第2型糖尿病及上述任一糖尿病所引起之併發症。
- 如請求項1所述將小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於製備治療胰島病變或其相關病症之組合物之用途，其中，該糖尿病所引起之併發症係為高血脂症、高血磷症、糖尿病腎病變、糖尿病肝損傷或糖尿病胰臟病變。
- 一種將小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於製備促胰島再生組合物之用途，其中，該小分子克弗爾胞外多醣萃取物係分離自克弗爾發酵物而富含葡萄糖之混合物，其分子量為12kDa。
- 如請求項3所述將小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於製備促胰島再生組合物之用途，其中，該促胰島再生組合物係能減少胰島β細胞凋亡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110120302A TWI818267B (zh) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | 小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| TW110120302A TWI818267B (zh) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | 小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202247847A TW202247847A (zh) | 2022-12-16 |
| TWI818267B true TWI818267B (zh) | 2023-10-11 |
Family
ID=85793431
Family Applications (1)
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| TW110120302A TWI818267B (zh) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | 小分子克弗爾胞外多醣萃取物用於治療或預防糖尿病及促進胰島再生與抗發炎之用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI818267B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008081461A (ja) * | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Kyushu Univ | ケフィアを用いた薬剤およびその製造方法、健康食品 |
-
2021
- 2021-06-03 TW TW110120302A patent/TWI818267B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008081461A (ja) * | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Kyushu Univ | ケフィアを用いた薬剤およびその製造方法、健康食品 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 Carmen R. Pop et al. Influence of extraction conditions on characteristics of microbial polysaccharide kefiran isolated from kefir grains biomass. Journal of Food and Nutrition Research. 55(2). 2016 Jun. 121-130. * |
| 期刊 Kiichiro Teruya et al. Fermented milk, Kefram-Kefir enhances glucose uptake into insulin-responsive muscle cells. Cytotechnology. 40. 2002 Nov. 107–116.; * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202247847A (zh) | 2022-12-16 |
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