CN111996286B - 用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel分子标记和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW‑81的InDel分子标记和方法，属于植物分子生物学领域。本发明的InDel分子标记序列如SEQ ID NO:1所示，用于扩增该标记的引物InDel‑2，其序列为F:cggcgggtgtgtttgtatgtcg；R:gcgggagcaacgcttgggat。方法如下：提取坛紫菜的丝状体或叶状体基因组DNA，使用InDel‑2引物进行PCR扩增，扩增产物电泳检测，若可检测到一条长度为545bp的特异性条带，则判断该坛紫菜为SW‑81品系。本方法只需一次简单的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳即可鉴别SW‑81品系，操作简单，快速，不受环境因素影响。

Description

用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel分子标记和方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具有涉及一种用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW- 81的InDel分子标记和方法。
背景技术
紫菜（Pyropia/ Porphyra spp.）因味道鲜美、营养价值高，被人们广泛食用，在中日韩三国被大规模栽培。紫菜栽培不仅产生了较大的经济价值，而且对栽培海区的生态修复也具有重要效果。目前，在我国被大规模人工栽培的紫菜有坛紫菜（Pyropia haitanensis）和条斑紫菜（Pyropia yezoensis），前者主要被栽培在福建、浙江和广东三省，后者被栽培于江苏和山东二省。2017年，我国紫菜产业规模达72977 hm2，年产量135251t，居世界首位，其中坛紫菜的产量约占全国紫菜总产量的78%。
上世纪六十年代，随着坛紫菜的基本生物学、生活史、全人工采苗和人工栽培技术等研究取得成功，该紫菜的人工栽培业得以建立和发展。但被栽培了50多年的野生种，由于栽培规模的持续扩大、栽培密度过大、再加上生产上基本上是从近交群体的后代中取种等原因，使得坛紫菜种质出现了严重退化，表现出产量和品质下降，对病害和高温等逆境生态条件的抵抗能力下降。近年来，受全球气候变暖的影响，在紫菜壳孢子采苗期间和海区栽培的第 1 个月左右，温度回升现象时常发生，即所谓的“小阳春”，这影响了紫菜壳孢子的萌发和叶状体的生长，严重时会引起大规模掉苗和烂苗，给生产造成巨大的经济损失。因此培育坛紫菜耐高温品种（系）对该产业的可持续发展具有重大意义。近年来，研究者采用紫菜诱变和杂交育种等技术已选育出数个耐高温的坛紫菜新品系，其中SW-81品系的叶状体耐高温性强，且具有生长快、主要光合色素和色素蛋白含量高以及壳孢子放散量大等优良特性（Ding HC, Fei QJ, Zhang P, Wang TG, Yan XH. Isolation and characterization of a heat-resistant strain with high yield of Pyropia haitanensis induced by ultraviolet ray. Aquaculture, 2020, 521: 735050）。SW-81品系的初步海区中试结果显示，该品系适宜大规模的生产栽培。为了将SW-81品系培育成一个可推广的新品种，需要得到该品系的可靠特异性标记，用于种质鉴定和产权保护。
传统的紫菜种质鉴定主要是采用形态学和细胞学方法，主要是利用叶状体的颜色、边缘细胞分布方式、精子囊和果孢子囊的分裂式及染色体数目等作为指标，且主要是用于种的鉴定。对于紫菜种内的不同品系，因它们一般只有颜色的细微区别，难以依据形态学和细胞学的特征进行品系鉴定。近年来，特异性DNA分子标记在紫菜种内品系的鉴定中得到了一些应用。其中，插入/缺失(InDel, insertion/deletion )标记是一种基于自身全基因组序列开发的新型分子标记类型，反映了基因组同一位点处序列不同大小核苷酸片段的插入/缺失情况，广泛分布于基因组中。目前，基于全基因组开发的InDel标记由于其特异性强、重复性好等优势，已被广泛应用于水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanumlycopersicum）等多种作物的遗传研究领域，但在紫菜中尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可快速、准确地鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel分子标记和方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：
cggcggttgtgtttgtatgtcggagaaaaaccaccggcggggacggtgaaggtatcgatcaggtgtgctcttgcaaaaggcggggcgggcgataggatgaggtcgcggggctcgggctcatccacaacgcggctgcccaggcacaagtcgtgcaccttgttgcccggcgggcacagcgcgtgcatgcccgccagaggatcccccgactagggccgcacgcgaggatcagatcgagacgcgggctgtggtgccctccgccggccaggccttcttggcctttgcacgcgggtgctgccgcccacggtgcgtcagcaccttccggtcaagacgtcagtggaccgggcgttgcgactgtaaagcaatcgtccggttcaccatcccgtcgggattgccaaccccccgtcgccgctcgccgcggcgcggcccacatcttgcacgaacaacattcgtccgccgccgcgtgtggggtggccagcccaccgccgtgccgcccctgccgttctcccctcctcccccccctggctgatcccaagcgtggctcccgc。
扩增上述标记的引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，具体为：
F：cggcgggtgtgtttgtatgtcg（SEQ ID NO:2）；
R：gcgggagcaacgcttgggat（SEQ ID NO:3）。
上述InDel分子标记或引物在鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81中的应用。
一种用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的方法，包括如下步骤：
（1）提取坛紫菜的丝状体或叶状体基因组DNA；
（2）使用引物进行PCR扩增；
（3）扩增产物电泳检测；
若可检测到一条长度为545bp的特异性条带，则判断该坛紫菜为SW-81品系。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明采用DNA分子标记技术鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81，结果准确、可靠，且不受环境因素影响。
（2）本发明提供的InDel分子标记具有检测结果稳定，操作快捷，稳定性好，检测成本低廉。
附图说明
图1为用InDel-2引物对坛紫菜各品系的丝状体DNA扩增产物电泳结果；其中，M为1500bp DNA Ladder Marker；1-3为坛紫菜耐高温品系SW-81；4-15为坛紫菜其他品系。
图2为用InDel-2引物对室内培养的坛紫菜各品系的叶状体DNA扩增产物电泳结果；其中，M为1500bp DNA Ladder Marker；1-3为坛紫菜耐高温品系SW-81；4-15为坛紫菜其他品系。
图3为用InDel-2引物对海区栽培的坛紫菜各品系的叶状体DNA扩增产物电泳结果；其中，M为1500bp DNA Ladder Marker；1-3为坛紫菜耐高温品系
SW-81；4-15为坛紫菜其他品系。
实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
（1）DNA的提取：收集坛紫菜耐高温品系SW-81和其他品系的丝状体，提取它们的基因组DNA，通过测定OD值和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
（2）引物筛选：对SW-81品系进行全基因组重测序，根据InDel位点两侧序列设计引物，以提取的各品系丝状体基因组DNA为模板，使用所设计的引物分别进行PCR扩增。
PCR反应体系为：20 ng/µL的DNA模板2 µL，Taq Mix 7.5 µL，10 µmol/L的引物-F和引物-R各0.4 µL，加ddH2O至15 µL。
反应程序为：94℃预变性5min；40个循环：94℃变性30s，退火（温度视引物而定）30s，72℃延伸30s；72 ℃延伸10min，4℃保温。
取1.5 µL PCR扩增产物，与loading buffer混匀后在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳条件：缓冲液1×TBE，电压130 V，时间4.0 h，随后利用银染显色法对电泳产物进行检测。发现InDel-2引物可在SW-81品系中扩增出545bp的特异性条带，而在其他品系中扩增出556bp的条带，结果如图1所示。
其中，InDel-2引物其序列为：
F：cggcgggtgtgtttgtatgtcg（SEQ ID NO:2）；
R：gcgggagcaacgcttgggat（SEQ ID NO:3）。
实施例2
对SW-81品系InDel特异性标记的稳定性进行验证。
（1）DNA的提取：收集室内培养或海区栽培的坛紫菜耐高温品系SW-81和其他品系的叶状体，提取它们的基因组DNA，通过测定OD值和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
（2）稳定性验证：使用InDel-2引物对坛紫菜各品系的叶状体DNA进行PCR扩增。
PCR反应体系为：20 ng/µL的DNA模板2 µL，Taq Mix 7.5 µL，10 µmol/L的引物-F和引物-R各0.4 µL，加ddH2O至15 µL。
反应程序为：94℃预变性5min；40个循环：94℃变性30s，65 ℃退火30s，72℃延伸30s；72 ℃延伸10min，4℃保温。
取1.5 µL PCR扩增产物，与loading buffer混匀后在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳条件：缓冲液1×TBE，电压130 V，时间4.0 h，随后利用银染显色法对电泳产物进行检测。发现与丝状体一样，InDel-2引物也可在室内培养或海区栽培的SW-81品系叶状体中扩增出545bp的特异性条带，而在其他品系中扩增出556bp的条带，结果如图2和图3所示。
（3）特异性条带回收测序：将实施例2步骤（2）中获得的特异性条带回收测序，结果显示该545bp特异条带序列如SEQ ID NO:1所示。
上述内容表明InDel-2标记可用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel分子标记和方法
<141> 2020-09-28
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 545
<212> DNA
<213> 坛紫菜(Pyropia haitanensis)
<400> 1
cggcggttgt gtttgtatgt cggagaaaaa ccaccggcgg ggacggtgaa ggtatcgatc 60
aggtgtgctc ttgcaaaagg cggggcgggc gataggatga ggtcgcgggg ctcgggctca 120
tccacaacgc ggctgcccag gcacaagtcg tgcaccttgt tgcccggcgg gcacagcgcg 180
tgcatgcccg ccagaggatc ccccgactag ggccgcacgc gaggatcaga tcgagacgcg 240
ggctgtggtg ccctccgccg gccaggcctt cttggccttt gcacgcgggt gctgccgccc 300
acggtgcgtc agcaccttcc ggtcaagacg tcagtggacc gggcgttgcg actgtaaagc 360
aatcgtccgg ttcaccatcc cgtcgggatt gccaaccccc cgtcgccgct cgccgcggcg 420
cggcccacat cttgcacgaa caacattcgt ccgccgccgc gtgtggggtg gccagcccac 480
cgccgtgccg cccctgccgt tctcccctcc tcccccccct ggctgatccc aagcgtggct 540
cccgc 545
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 坛紫菜(Pyropia haitanensis)
<400> 2
cggcgggtgt gtttgtatgt cg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 坛紫菜(Pyropia haitanensis)
<400> 3
gcgggagcaa cgcttgggat 20

Claims (4)

1.用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.扩增权利要求1所述的InDel分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
3.扩增权利要求1所述的InDel分子标记的引物或权利要求2所述的引物在鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81中的应用。
4.用于鉴定坛紫菜耐高温品系SW-81的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取坛紫菜的丝状体或叶状体基因组DNA；
(2)使用权利要求2所述的引物进行PCR扩增；
(3)扩增产物电泳检测；
若可检测到一条长度为545bp的特异性条带，则判断该坛紫菜为SW-81品系。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102660646A (zh) * 2012-05-11 2012-09-12 集美大学 用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记及其构建方法
CN103343122A (zh) * 2013-07-04 2013-10-09 上海海洋大学 用于鉴定条斑紫菜耐高温品系tm-18的方法、分子标记及其构建方法

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