CN111996210B - miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提出了一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，miR164a及前体基因它来自于亚洲棉品种Shixiya1，将前体基因插入经改造的棉花叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体系统中，获得亚洲棉CLCrV:miR164a重组表达载体，将重组表达载体转化到农杆菌菌株GV3101中，转染亚洲棉。实验结果表明miR164a负调节棉花对盐的胁迫应答，通过调控植株中miR164a的表达量，可以调控植株应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。

Description

miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用。

背景技术

亚洲棉是重要的天然纤维作物和油料作物之一，具有较高的经济价值，并且是抗旱耐盐先锋。亚洲棉属于非粮食作物，具有一定耐干旱盐碱的能力，亚洲棉是一种主要的栽培亚洲棉和有用的育种资源，具有很强的遗传稳定性和对一系列胁迫的良好抗性。随着全球气候变化，许多环境因素(如养分流失、土壤盐渍化和温室效应)严重制约农业产业的发展。其中，盐胁迫是植物生长和发育的主要威胁。每年，它都会在世界范围内造成亚洲棉纤维和种子产量的巨大损失。包括亚洲棉在内的植物已经进化出对应的反应和调节机制，以避免或抵抗外源胁迫。

miRNAs被转录并切割成一系列保守的小的非编码RNA，通常长度为18-22个核苷酸(Nt)。它们可以结合到下游的靶基因的mRNA上，通过翻译抑制或切割来转录后调节它们的表达。已有大量文献报道miRNA参与植物应答干旱、冷、热、ABA处理，紫外处理等多种胁迫应答过程，例如miR319，miR396c，miR394参与植物应答盐胁迫。陆地棉中一个新发现的miRNA，通过调控靶标CHR基因来响应盐胁迫。研究miRNAs调控植物耐盐将有助于理解亚洲棉中逆境响应miRNAs的动态特征和生物学功能，为亚洲棉育种提供更多的分子和机理数据。研究植物耐盐相关的功能基因对于提高植物耐盐性，降低盐胁下的产量的损失，对造福农业生产有着重要的意义。

发明内容

本发明提出一种miR164a及miR164a前序基因在应答亚洲棉耐盐中的应用，通过调控miR164a的表达量可用于调控目的植物应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。

本发明的技术方案是这样实现的：一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，所述miR164a的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

进一步地，通过调控所述miR164a在亚洲棉中的表达量负调控亚洲棉耐盐碱能力。

进一步地，所述miR164a的前序基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

进一步地，将所述miR164a的前序基因用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，连接到亚洲棉叶皱缩病毒的pCLCrVA中，得到重组表达载体。

进一步地，将所述重组表达载体转入农杆菌中，再将农杆菌转化至亚洲棉植株。

一种miR164a培育耐盐碱植物品种的方法，通过调控miR164a在植物中的表达量负调控植物耐盐碱的能力，所述植物为双子叶植物。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明提供了一种亚洲棉miRNA，即miR164a、以及其前体序列，通过调控该miRNA的表达量可用于调控目的植物应答盐胁迫的能力，表现为盐胁迫下48小时后所述转基因植物的叶片出现萎蔫，且相对电导率高于野生型植株，可见利用亚洲棉miRNA进行作物的遗传转化可培育耐盐作物，进而可提高农作物产量，本发明为调控目的植物应答盐胁迫的能力提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

2、本发明提供的miR164a，它来自于亚洲棉品种Shixiya1，将亚洲棉幼苗根采用150mM NaCl处理3小时之后，使用Trizol法提取根组织总RNA，以U6 snRNA为内参照的miRNA表达测定，使用Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计引物，利用qRT-PCR分析miR164a在亚洲棉的根中的表达量，发现miR164a表达量下降，可见miR164a参与盐胁迫应答。

3、本发明通过miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/)查找亚洲棉miR164a的前体基因序列，然后人工合成，将前体基因插入经改造的亚洲棉叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体系统中，获得亚洲棉CLCrV：miR164a重组表达载体，将重组表达载体转化到农杆菌菌株GV3101中，转染亚洲棉种子。种子发芽后，采用300mM NaCl溶液浇灌处理48小时，利用qRT-PCR分析，发现miR164a在感染CLCrV：miR164a的亚洲棉植株中的表达量显著高于感染CLCrV：00(未插入前体基因的空载体)的植株，说明miR164a在感染了CLCrV：miR164a重组表达载体的亚洲棉中过表达。通过表型鉴定和相对电导率的测定，发现感染CLCrV：miR164a重组表达载体的亚洲棉叶片出现萎蔫，并且叶片相对电导率显著升高，可见miR164a负调节亚洲棉对盐的胁迫应答，通过调控植株中miR164a的表达量，调控植株应答盐胁迫的能力，从而能够提高植株抗性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为150mM NaCl处理3小时之后，miR164a在实验组和对照组根组织中的表达量。

图2为亚洲棉叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体的基因组结构示意图；

亚洲棉叶皱缩病毒是双组份的双生蛋白，pCLCrVA和pCLCrVB是该病毒的两个组分；

其中，AC1、AC2、AC3和AC4都是pCLCrVA的编码蛋白，pre-miRNA代表插入的miRNA前体序列，AC1是外壳蛋白，AC2是转录激活蛋白，AC3是复制增强蛋白，AC4功能不明确；

BV1和BC1是pCLCrVB的编码蛋白，其中BV1是核穿梭蛋白，BC1是编码运动蛋白；CR表示基因共同区域；LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂。

图3为300mM NaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株叶片中miR164a表达情况的qRT-PCR鉴定结果。

图4为300mM NaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株的表型照片。

图5为300mM NaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株离体叶片中相对电导率的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中300mM NaCl，表示300毫摩尔/升，就是0.3摩尔/升，M表示“摩尔/升；ddH₂O指双蒸水(double distilled)；亚洲棉Shixiya1品种有棉花研究所种质资源库提供。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 miR164a响应亚洲棉应答盐胁迫

1、植株培养及胁迫处理

将亚洲棉Shixiya1(SXY1)品种的种子在80℃水中浸泡2h，在培养皿培养1day后发芽；培养至芽露白，移入40目石英砂中培养5day；待苗长到6-10cm，两片子叶完全展开后，转移到营养液进行水培18day，营养液配方如表1和表2；当亚洲棉幼苗长出3-5片真叶，开始处理，将棉花幼苗随机分为两组，即处理组和对照组，实验组将亚洲棉幼苗根浸没在150mMNaCl中，对照组将亚洲棉幼苗根浸没在蒸馏水中，处理3小时之后对根组织进行取材。

表1亚洲棉水培的营养液微量元素配方

化学物名称	化学物分子式	浓度(mmol/L)	原液(1000X)/g
				硼酸	H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.02	1.2366
硫酸锌	ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.001	0.28754
				硫酸铜	CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.0002	0.049936
硫酸锰	MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.001	0.16901
				钼酸铵	(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O	0.000005	0.006618

表2亚洲棉水培的营养液大量元素配方

化学物名称	化学物分子式	浓度(mmol/L)	原液(1000X)/g
				硝酸钙	Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·H<sub>2</sub>O	2.49841	590
磷酸二氢钾	KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.49967	68
				硫酸镁	MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	1.0012	246.5
硝酸钾	KNO<sub>3</sub>	2.5047	250
				乙二胺四乙酸铁钠	EDTA·FeNa	0.1	36.705

2、植株RNA提取、反转录及定量鉴定

取实验组和对照组植株根组织，液氮速冻后于-80℃保存。使用Trizol法提取总RNA，用分光光度计测定提取的RNA在260nm(OD260)和280nm(OD280)波长下的吸收光值及浓度；

采用PrimeScript^TMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒合成cDNA，具体操作按照说明书进行；

定量鉴定采用基于茎环定量逆转录的qRT-PCR方法：将从相同总RNA样品转录的400ng调整为100ng/μl，用于以U6 snRNA为内参照的miRNA表达测定；使用特定的茎环RT引物(Stem-loop RT Primer)，这些引物通过3'端的六个核苷酸延伸互补于每个miRNA。茎环RT引物对单个miRNA的特异性是由3′末端的6个核苷酸延伸赋予的。

所有引物均使用Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计。

(1)引物设计

U6 snRNA基因的特异引物序列如下：

正向引物(Forward Primer)：5'-GGGGACATCCGATAAAATTGG-3'；

茎环RT引物(Stem-loop RT Primer)：5'-ACCATTTCTCGATTTGTGCGT-3'。

miR164a的特异引物序列如下：

正向引物(Forward Primer)：5'-CACGATGGAGAAGCAGGGCA-3'(SEQ ID NO：3所示)；

正向引物(Stem-loop RT Primer)：

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCACG-3'

(SEQ ID NO：4所示)。

(2)qRT-PCR反应体系

(3)qRT-PCR反应步骤

(i)在16℃孵育30min；

(ii)依次在30℃和42℃下保温30s；

(iii)在50℃下1s并返回步骤(ii)60个循环；

(iv)在85℃下保温5分钟。

结果计算：计算实验组和对照组的平均CT值，使用公式2^-ΔΔCT计算出相对表达值，并进行作图分析。利用Livak KJ和Schmittgen TD报道的方法(Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTMethod.Methods 25:402–408)，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Time x－(CT.Target－CT.Actin)Time 0

其中，CT.Target表示目的基因CT值，CT.Actin表示内参基因CT值，Time x表示任意时间点；Time 0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

从图1中可以看到，qRT-PCR结果显示，150mM NaCl处理3小时之后，亚洲棉根中miR164a的表达量下降，说明miR164a参与盐胁迫应答。

实施例2利用亚洲棉miR164a调控目的植物应答盐胁迫的能力

1、亚洲棉CLCrV：miR164a重组表达载体的构建

通过miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/)查找亚洲棉miR164a的前体序列，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司采用亚磷酰胺三酯法合成,序列表中SEQ IDNO：1是miR164a的成熟序列，序列表中SEQ ID NO：2是miR164a的前体序列。

miR164a的前体序列片段用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，并连接到亚洲棉叶皱缩病毒的pCLCrVA中，得到重组载体(CLCrV：miR164a)，其载体基因组结构示意图如图2所示，图中pCLCrVA上标记pre-miRNA的地方就是插入的miR164a的前体片段位置。

将重组载体(CLCrV：miR164a)和空载体(CLCrV：00)转化到农杆菌菌株GV3101感受态细胞，得到重组载体农杆菌菌落和空载体农杆菌菌落；然后将包含pCLCrVB的农杆菌菌落、重组载体农杆菌菌落和空载体农杆菌菌落分别在50ml培养基中培养，当OD值为1.2时，离心重悬，暗处静置3h-6h后，将重组载体农杆菌菌落、空载体农杆菌菌落分别与包含pCLCrVB的农杆菌菌落按1：1的比例混合，得到重组载体农杆菌悬液和空载体农杆菌悬液。

2、植株培养及处理

将亚洲棉Shixiya1(SXY1)品种的种子浸泡在3％(v/v)H₂O₂溶液中1h，然后用ddH₂O冲洗掉H₂O₂。种子在ddH₂O中浸泡4-6小时之后除去软化的种皮，将裸露的种子浸泡在上一步得到的重组载体农杆菌悬液和空载体农杆菌悬液中感染，暗处理90min，随后将种子放在含有200μM乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基中继续暗培养，温度保持26℃，两天后，将种子移到含有60-100μg/mL^-1利福平的MS固体培养基上，待种子发芽以后移至在营养土壤中生长，每3天浇一次，浇水量为每次浇水200ml，约半个月后停止浇水，待营养土中基本无水后，用300mM NaCl溶液浇灌营养土壤，处理48小时。其中浸泡空载体农杆菌悬液的种子长成的植株为对照组，浸泡重组载体农杆菌悬液的种子长成的植株为实验组；MS培养基参照文献配置，文献来源：Murashige,T.and Skoog,F.(1962)A Revised Medium for Rapid Growthand Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.Physiologia Plantarum,15,473-497。

3、RNA提取、反转录及定量鉴定

取实验组和对照组植株叶片，液氮速冻后于-80℃保存。进行RNA提取、反转录及定量鉴定(方法和引物同实施例1的步骤2)。

从图3可以看出，qRT-PCR结果显示，miR164a在感染CLCrV：miR164a的亚洲棉植株的表达量显著高于感染CLCrV：00的植株，说明实验组中miR164a确实过表达。

4、表型鉴定

对处理48小时之后的植株观察表型，并进行拍照记录,从图4可以看到，与感染CLCrV：00的对照组亚洲棉相比，感染CLCrV：miR164a的亚洲棉在处理后48h叶片出现萎蔫。

5、电导率测量

相对电导率(REC,Relative Electric Conductivity)是衡量细胞膜透性的重要指标，植物在逆境中细胞膜容易破裂使细胞质外渗而使相对电导率增大。REC值越大，表示电解质的渗漏量越多，细胞膜受损程度越重。对叶片电导率进行测量，测量方法如下：

a.选择对照组和实验组的亚洲棉植株，选择前三片真叶，每片叶子作为一个重复，每片叶子用内径为0.9cm的打孔器打4～6个孔；

b.将叶片圆片放入15ml的离心管中，加入5ml 400mM甘露醇(mannitol)，摇匀(注意要将叶片整个浸在溶液中，不要粘在壁上或盖子上)，将其放入摇床，70rpm室温下摇3h，对其初始电导率(S1)进行测定；

c.把离心管放入水浴锅中，将溶液加热至100℃保持10min，冷却至室温，测得最终导电率(S2)。

叶片的相对电导率(REC,Relative Electric Conductivity)计算公式为：

REC(％)＝(S1/S2)×100。

见图5，感染CLCrV：miR164a的实验组亚洲棉的相对电导率REC：67.96％或71.16％，感染CLCrV：00的对照组亚洲棉的相对电导率REC：22.55％，可见与感染CLCrV：00的对照组亚洲棉相比，感染CLCrV：miR164a的实验组亚洲棉明显高于感染CLCrV：00的对照组亚洲棉。

综上所述，NaCl处理之后，与对照组相比，感染CLCrV：miR164a的亚洲棉中miR164a的表达水平升高，叶片出现萎蔫，并且叶片相对电导率显著升高，说明miR164a负调节亚洲棉对盐的胁迫应答，因此可以通过调控植株中miR164a的表达量，调控植株应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，所述miR164a的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其特征在于，通过在亚洲棉中过表达miR164a，使得在盐胁迫下亚洲棉出现萎蔫和电导率升高。

2.根据权利要求1所述的一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，所述miR164a的前序基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2 所示。

3.根据权利要求2所述的一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，将所述miR164a的前序基因用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，连接到亚洲棉叶皱缩病毒的pCLCrVA中，得到重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，将所述重组表达载体转入农杆菌中，再将农杆菌转化至亚洲棉植株。

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