CN111991400B

CN111991400B - 一种复合维生素b及其在防治真菌感染中的应用

Info

Publication number: CN111991400B
Application number: CN202011080454.6A
Authority: CN
Inventors: 宋章永; 雷君文; 张倩; 信彩岩; 陈文碧; 肖伟
Original assignee: Southwest Medical University
Current assignee: Southwest Medical University
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN111991400A

Abstract

本发明公开了一种复合维生素B，包括功效成分维生素B₂和维生素B₉，所述维生素B₂和维生素B₉的质量比为1﹕0.2～0.4。本发明还提供该复合维生素B在制备防治真菌感染的药物中的应用。本发明的复合维生素B具有显著的防治真菌感染的作用。该复合物细胞毒性低，且与传统的抗真菌药物相比，不易使真菌产生耐药性，可作为临床抗真菌感染治疗的候选药物。

Description

一种复合维生素B及其在防治真菌感染中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种复合维生素B及其在防治真菌感染中的应用。

背景技术

目前，真菌感染根据感染部位可分为浅部真菌感染和深部真菌感染，前者发病率高但危害轻，后者发病率低但危害程度高。随着广谱抗生素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂在临床上的广泛使用，免疫功能低下患者逐渐增多，条件性真菌感染的易感因素逐渐增加，从而导致侵袭性真菌感染的发病率和致死率呈急剧上升趋势。然而，临床抗真菌药物的种类有限，且因用药疗程及药量的增加导致的耐药性增加。此外，传统抗真菌药物的肝、肾毒性较大，价格昂贵。在这种严峻的背景下，迫切需要开发高效、无毒的抗真菌药物来替代传统药物，以解决真菌耐药问题。

核黄素(维生素B₂)是人体内黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的重要组成部分，参与机体复杂的生物氧化反应及能量代谢。临床上核黄素主要用于防治口角炎、舌炎、阴囊炎、结膜炎脂溢性皮炎等核黄素缺乏症。

叶酸(维生素B₉)是人体生长发育必不可少的维生素之一，临床上主要用于防治由叶酸缺乏引起的神经管畸形、巨幼细胞性贫血、唇腭裂、抑郁症、肿瘤等。然而目前，对核黄素和叶酸在抗真菌领域鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有抗真菌药物种类有限及其耐药性增加的问题，基于“老药新用”理念，提供一种能够防治真菌感染的复合维生素B，为新的抗真菌药物的研发奠定基础。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种复合维生素B，包括功效成分维生素B₂和维生素B₉。

所述维生素B₂和维生素B₉的质量比为1﹕0.2～0.4。

上述技术方案中，所述复合维生素B还包括药剂学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括润湿剂和/或黏合剂。

进一步优选地，所述润湿剂为水，所述黏合剂为质量百分比10％的淀粉浆。

优选地，所述复合维生素B为粉剂、片剂、胶囊剂、针剂、粉针剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂或膏剂。

本发明的另一目的是提供上述任一复合维生素B在制备防治真菌感染的药物中的应用。

所述真菌为白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、库德毕赤酵母菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉。

本发明复合维生素B制剂可采用皮肤给药(搽剂)、口服、皮下注射、肌内注射等方式，从而达到不同的效果，间接增加了其应用范围。

本发明的有益效果是：本发明的复合维生素B具有显著的防治真菌感染的作用。该复合物细胞毒性低，且与传统的抗真菌药物相比，不易使真菌产生耐药性，可作为临床抗真菌感染治疗的候选药物。

附图说明

图1是本发明的复合维生素B在固体培养基上对真菌的抑制作用。

图2是本发明的复合维生素B对肝癌细胞HepG2及人肾小管上皮细胞HK2的细胞毒性试验结果，其中，(a)图为药物作用24h结果，(b)图为药物作用48h结果，(c)图为单因素方差分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

主要试剂来源：

实施例中的标准菌株为本领域常规试剂，可商购获得。

实施例中的临床分离得到的菌株均为申请人从临床患者肺泡灌洗液中分离得到的菌株，保藏于本实验室。

YPD固体培养基:即酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，具体配制方法为：无水葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母10g，琼脂粉18g，加双蒸水1000ml，搅拌均匀，高压蒸汽灭菌后，室温放置冷却，放置4℃冰箱待用。

YPD液体培养基:不含琼脂粉，其它步骤同YPD固体培养基配制。

DMEM高糖培养基购自上海麦克林生化科技有限公司。

顺铂(cisplatin)购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，也可商购获得。

实施例1不同配比的VB组合物对真菌的抑制作用

1.试验菌株及材料：

(1)试验菌株：标准菌株白色念珠菌ATCC MYA-2876菌株。

(2)受试药物：维生素B₂及维生素B₉购自上海麦克林生化科技有限公司。

2.菌悬液的制备：

酵母菌解冻复苏，并连续在YPD固体培养基上传代两次，挑取单个较大菌落，YPD液体培养基活化过夜后，RPMI 1640(含1％Tween 80)重悬至0.2～1×10⁶cells/mL，待用。

3.药物的配制：VB₂及VB₉溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使VB组合物母液浓度为20mg/ml，-20℃贮存备用，VB₂与VB₉质量比为1﹕0.2～0.4。

4.液体抑菌试验

(1)用RPMI 1640(含1％Tween 80)将VB组合物稀释至4mg/ml，继续用RPMI 1640稀释至0.1～1.6mg/ml，96孔板从左至右1～9孔依次加入浓度为1.6、1.4、1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2及0.1mg/ml的VB组合物100μl，第10孔加入100μl RPMI 1640(含1％Tween 80)培养基为对照组，第11孔加入200μl含1％Tween 80的RPMI 1640培养基，第12孔弃用。

(2)第1～10孔加入前面已配制好的菌悬液100μl，使菌悬液终浓度为1～5×105cells/mL，使药物终浓度自第1至10孔浓度依次为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1及0.05mg/ml，37℃孵育，酵母菌孵育24h后，于595nm测OD值，每组3个重复孔，3个平行96孔板。

(3)抑菌率＝[1-(A_处理-A_空白)/(A_对照-A_空白)]×100％。

前述维生素B₂、维生素B₉的质量比为1﹕0.2～0.4，配制不同维生素B₂和维生素B₉配比的VB组合物样品1～3，采用微量液基法测定各样品对白色念珠菌ATCC-MYA2876的抑菌效果，具体配比及其抑菌效果如表1所示，样品2(VB₂与VB₉质量比为1﹕0.3)抑菌率可达90％，选定该样品进行后续试验。

表1

实施例2微量液基法测定维生素B组合物对各真菌的MIC值

1.试验菌株及材料：

(1)试验菌株：标准菌株白色念珠菌ATCC MYA-2876菌株、白色念珠菌ATCC 90028菌株、近平滑念珠菌ATCC 22019菌株、克柔念珠菌ATCC 6258菌株、新生隐球菌H99菌株及烟曲霉Af293菌株，临床分离近平滑念珠菌Cp1菌株和Cp2菌株、临床分离光滑念珠菌Cg1菌株、临床分离热带念珠菌Ct2菌株和Ct3菌株、临床分离库德毕赤酵母菌PK1菌株、临床分离黄曲霉Afl 1菌株及临床分离黑曲霉An 1菌株。

(2)受试药物：维生素B2及维生素B9购自上海麦克林生化科技有限公司。

2.菌悬液的制备：

(1)酵母菌及新生隐球菌解冻复苏，并连续在YPD固体培养基上传代两次，挑取单个较大菌落，YPD液体培养基活化过夜后，RPMI 1640(含1％Tween 80)重悬至0.2～1×10⁶cells/mL，待用。

(2)烟曲霉Af293、黄曲霉Afl 1、黑曲霉An 1和解冻复苏，并连续在PDA固体培养基上传代两次，挑取孢子于RPMI 1640完全培养基(含1％Tween 80)，涡旋混匀，调至0.2～1×10⁶cells/mL，待用。

3.VB组合物药物的配制：取设定比例的VB₂及VB₉溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使VB组合物母液浓度为20mg/ml，-20℃贮存备用，VB₂与VB₉质量比为1﹕0.3。

4.测定最小抑菌浓度MIC₉₀

(2)第1～10孔加入已配制好的菌悬液100μl，使菌悬液终浓度为1～5×10⁵cells/mL，使药物终浓度自第1至10孔浓度依次为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1及0.05mg/ml，37℃孵育，酵母菌孵育24h、隐球菌及烟曲霉孵育48h，酵母菌及隐球菌于595nm测OD值，烟曲霉于490nm测OD值，每组3个重复孔，3个平行96孔板。

(3)抑菌率＝[1-(A_处理-A_空白)/(A_对照-A_空白)]×100％，MIC₉₀值为90％抑制真菌生长的最低药物浓度。

结果如表2所示，VB组合物对白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、库德壁赤酵母菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉及黑曲霉的MIC₉₀。

表2维生素B组合物的MIC₉₀

实施例3维生素B组合物在固体培养基中对真菌的抑制作用

1.配制含0.5mg/ml维生素B组合物的YPD固体培养基：

取设定比例的VB组合物(VB₂与VB₉质量比为1﹕0.3)溶于DMSO中，使组合物原浓度为50mg/ml。待YPD固体培养基冷却到50-60℃之间，加入VB组合物使培养基中使VB组合物终浓度为0.5mg/ml，不含VB组合物的YPD固体培养基作为对照组。

2.抑菌实验：本实施例所用实验菌株与实施例2相同。

(1)酵母菌及新生隐球菌：取37℃，200rpm孵育过夜的酵母菌及隐球菌，灭菌水重悬至1×10³cells/mL，取3μl分别垂直接种于含0.5mg/ml VB组合和不含VB组合物的YPD固体培养基中，37℃孵育48h，观察菌落形态，拍照记录。

(2)曲霉：挑取YPD培养基孢子数量较多区域的烟曲霉和黄曲霉，置于含1％Tween80的灭菌水中，涡旋混匀，浓度调至1×10⁵cells/mL，取3μl接种于含和不含VB组合物的YPD培养基中，37℃孵育4天，观察菌落形态，拍照记录。

结果如图1所述，在固体YPD培养基中，本发明VB组合物可一定程度抑制白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌及新生隐球菌的生长，并使其菌落形态变小，其中对白色念珠菌、进平滑念珠菌及新生隐球菌抑菌效果更显著。VB组合物处理减少烟曲霉、黄曲霉及黑曲霉色素的色素产生，并使其菌苔变薄，产孢量下降。

实施例4维生素B组合物的细胞毒性试验

1.取细胞状态良好的HepG2细胞(每孔7500-8000个细胞)和HK2细胞(每孔5000-6000个细胞)100μl于96孔板，以100μl DMEM高糖培养基作为空白对照组，37℃，5％CO₂孵育24h。

2.沿壁轻轻吸去旧培养基，加入100μl含0.13、0.39及0.78mg/ml VB组合物(VB₂与VB₉质量比为1﹕0.3)的DMEM高糖培养基，以与处理组含等量DMSO作为DMSO组，以DMEM高糖培养基作为对照组，以顺铂(抗肿瘤药物)和多柔比星(化疗药物)作为阳性对照，37℃孵育分别孵育24h、48h。

3.弃去旧培养基，加入含CCK 8的DMEM高糖培养基100ul，每孔含CCK试剂10μl，37℃，避光孵育2h，450nm测OD值，3个重复孔，3组独立重复试验。

4.通过对照组及DMSO组评估DMSO对细胞的增殖的影响，通过各VB组合物处理组与空白组及对照组比较评估药物处理对细胞增殖的影响，从而评估药物毒性。

结果如图2所示，VB组合物低、中、高浓度分别为0.13、0.39、0.78mg/ml(VB₂、VB₉质量比为1﹕0.3)，HepG2以顺铂(5、10及20mg/ml)为阳性对照，HK2以多柔比星(2.5、5及10μM)为阳性对照；图2中，(a)图为药物作用24h结果，(b)图为药物作用48h结果，(c)图为单因素方差分析结果，*p<0.05,**p<0.001，***p<0.0005,****p<0.0001，每组均与DMSO组比较；结果显示本发明的VB组合物在0.13～0.78mg/ml范围内均无细胞毒性。

Claims

1.复合维生素B作为活性成分在制备防治真菌感染的药物中的应用，其特征在于：所述复合维生素B包括质量比为1﹕0.2~0.4的功效成分维生素B₂和维生素B₉。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述真菌为白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、库德毕赤酵母菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述复合维生素B还包括药剂学上可接受的辅料。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述辅料包括润湿剂和/或黏合剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述润湿剂为水，所述黏合剂为质量百分比10%的淀粉浆。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述复合维生素B为粉剂、片剂、胶囊剂、针剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂或膏剂。