CN111978280A - 一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法，该方法包括：将蓝莓果清洗干净并晾干，用盐水浸泡，再用清水洗净晾干，进行破碎处理，得蓝莓果浆；加混合酶Ⅰ，进行酶解获得果浆酶解液Ⅰ；中加入酸性乙醇溶液作为提取剂，并置于容器中，做密封处理；进行超声提取，获得超声提取产物，并进行减压过滤，得到粗提液；加入混合酶Ⅱ，静置酶解，并将酶解液真空浓缩；浓缩液洗脱纯化，并将洗脱液真空浓冷冻干燥，得干燥后的蓝莓花青素提取产物。本发明的提取方法能有效保证提取物纯度，提升提取率，且降低生产成本，生产工艺参数稳定，适合工业化生产。

Description

一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体是一种蓝莓花青素的高效提取分离纯化方法。
背景技术
蓝莓，又名笃斯、野生蓝莓被称为都柿(大小兴安岭、伊春)，甸果、地果、龙果、蛤塘果(吉林)等。蓝莓果实中含有丰富的营养成分，如花青素等，具有防止保护视力、抗氧化、抗癌、软化血管、增强人机体免疫等功能。
花青素(Anthocyanidin)，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物。蓝莓花青素是一种结合在蓝莓果皮纤维素上功能性食用色素，主要以葡萄糖苷、鼠李糖苷等形式存在。蓝莓中花青素含量是其他水果如苹果、葡萄的几倍甚至几十倍，具有抗氧化，保护视力，抑制肿瘤等功能，有重要的生物活性和提取价值。但因蓝莓花青素具有易氧化、热敏性，稳定性极差等特点，且通过糖苷键连接的大量糖链会直接影响花青素的色价及纯度，故提取分离纯化比较困难，现有技术中对蓝莓花青素的有效利用率较低。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法，本发明的方法是一种新型混合酶-超声联合辅助提取以及硅胶柱层析纯化工艺，操作简单效率高，以解决蓝莓花青素萃取率低、纯度低，易失活等问题。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将蓝莓果清洗干净并晾干，用盐水浸泡，再用清水洗净晾干，进行破碎处理，得蓝莓果浆；
(2)向上述蓝莓果浆中加混合酶Ⅰ，进行酶解，获得果浆酶解液Ⅰ；
(3)向上述混合果浆中加入酸性乙醇溶液作为提取剂，并置于玻璃容器中，做密封处理；
(4)将密封后的玻璃容器进行超声提取，获得超声提取产物，并进行减压过滤，得到粗提液；
(5)向上述粗提液中加入混合酶Ⅱ，静置酶解，并将酶解液真空浓缩；
(6)将上述浓缩液洗脱纯化，并将洗脱液真空浓冷冻干燥，得干燥后的蓝莓花青素提取产物；
所述混合酶Ⅰ成分为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶；所述混合酶Ⅱ的成分为α-葡萄糖苷酶及α-鼠李糖苷酶。
作为优选，所述混合酶Ⅰ中纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶的质量比为5:1:2:1，采用酶的酶比活力分别为纤维素酶为4000U/g、半纤维素酶1000U/g、果胶酶1000U/g、木瓜蛋白酶1000U/g，混合酶I与果浆比例为16-20g/kg果浆，酶解时间为1.5-2h。
作为优选，所述混合酶Ⅱ中α-糖苷酶：α-鼠李糖苷酶的质量比为3:1，两种酶活力均为1000U/ml，混合酶Ⅱ与粗提液比例为4g/L，酶解时间为1h-1.5h。
作为优选，步骤(1)所述盐水浸泡步骤中，采用盐水质量分数为10-15％，浸泡时间为0.5h-1h。
作为优选，步骤(3)所述酸性乙醇溶液作为提取剂中酸性乙醇浓度为60-70％，含有冰醋酸0.02-0.5％，比例为3L/kg果浆酶解液Ⅰ，用柠檬酸溶液调整pH值至3-4。
作为优选，步骤(4)所述超声温度设定50℃，功率设定500w，时间0.5h-1h。
作为优选，步骤(6)所述洗脱纯化中采用大孔树脂柱，上样量为0.1～0.5倍树脂柱体积，吸附0.5～24h，并用蒸馏水冲柱，乙醇溶液洗脱。
作为优选，所述大孔树脂采用AB-8或DX101型大孔树脂柱。
作为优选，步骤(6)所述真空浓缩步骤温度为45℃，冷冻干燥温度为-40℃，时间24h-48h。
本发明所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法所提取的蓝莓花青素。
本发明主要采用超声酶解法进行蓝莓花青素提取分离纯化。创新性采用由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶组成的混合酶Ⅰ，及超声提取技术，加速破坏细胞结构，并采用酸性乙醇作为提取剂，提高蓝莓花青素的提取率。创新性采用α-糖苷酶、α-鼠李糖酶组成的混合酶Ⅱ进行进一步酶解，破坏糖链，提升产品纯度。最后将花青素粗提取液通过AB-8型大孔树脂柱分离纯化，得到高纯度花青素。该提取方法能有效保证提取物纯度，提升提取率，且降低生产成本，生产工艺参数稳定，适合工业化生产。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明是一种全新的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，通过混合酶-超声联合辅助提取以及硅胶柱层析纯化，操作简单效率高，以解决蓝莓花青素萃取率低、纯度低，易失活等问题。
(1)本发明方法中盐水浸泡能有效除去蓝莓果表面的细菌、灰尘及其他杂质，降低产品被污染风险，提升产品质量；
(2)采用超声酶解提取方法，在原有的纤维素酶、果胶酶制成的混合酶基础上，创新性加入半纤维素酶和木瓜蛋白酶，能更好的破坏植物细胞壁结构，结合超声提取技术，增加破碎效率；
(3)采用加冰醋酸与柠檬酸的酸性乙醇用作提取剂，能保证花青素在提取的稳定性，并将容器密封处理，防止接触空气氧化花青素，进一步保证提取效率；
(4)采用由α-葡萄糖苷酶、α-鼠李糖苷酶制成的混合酶Ⅱ进行进一步酶解，破坏影响花青素纯度的大量糖链，提升产品纯度，保证下一步分离纯化效率；
(5)分离纯化采用如AB-8型大孔树脂，价格低廉，对花青素的吸附率和吸附量较高，能在短时间内达到解吸平衡，适用于大生产。
附图说明
图1为不同混合酶Ⅰ条件下五组实验组蓝莓花青素提取率测量结果；
图2为不同超声条件下六组实验组蓝莓花青素提取率测量结果；
图3为不同混合酶Ⅱ条件下四组实验组蓝莓花青素提取率测量结果。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步说明本发明，并不以任何方式限制本发明，这些实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
一种蓝莓花青素提取分离纯化方法
选取品质优良、无病虫害的蓝莓果1kg，清水洗净并沥干，用10％盐水(质量分数10％的氯化钠水溶液)浸泡30min，再用清水清洗2遍，沥干后用破碎机进行破碎处理，得蓝莓果浆。向蓝莓果浆中加入混合酶Ⅰ(纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶质量比5:1:2:1，纤维素酶为4000U/g、半纤维素酶1000U/g、果胶酶1000U/g、木瓜蛋白酶1000U/g；)，加入量18g/kg蓝莓果浆，水解90min，获得果浆酶解液Ⅰ；将果浆酶解液Ⅰ转移至玻璃锥形瓶中，加入体积分数60％酸性乙醇(含0.02％冰醋酸)3L/kg果浆酶解液Ⅰ，用柠檬酸调pH为3.5，并密封处理，将密封后的玻璃容器放入超声机中，进行超声提取，50℃，500w，超声提取30min，减压过滤至固体物全部除去，得到粗提液，加入混合酶Ⅱ4.0g/L粗提液(α-葡萄糖苷酶及α-鼠李糖苷酶质量比为3:1，酶活力均为1000U/g)，混合60min，并用45℃真空浓缩后(浓缩至粗提液原体积1/5)，加入填有AB-8型大孔树脂柱进行上样，上样量为0.5倍树脂柱体积，吸附12h，用蒸馏水冲柱，弃洗脱液，再用体积分数60％乙醇溶液洗脱3倍树脂体积并收集洗脱液。洗脱液45℃真空浓缩后-40℃冷冻干燥24h，得蓝莓花青素提取物。
实施例2
一种蓝莓花青素提取分离纯化方法
选取品质优良、无病虫害的蓝莓果1kg，清水洗净并沥干，用15％盐水浸泡30min，再用清水清洗2遍，沥干后用破碎机进行破碎处理，得蓝莓果浆。向蓝莓果浆中加入混合酶Ⅰ(纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶质量比5:1:2:1，纤维素酶为4000U/g、半纤维素酶1000U/g、果胶酶1000U/g、木瓜蛋白酶1000U/g；)，加入量16g/kg蓝莓果浆，水解2h，获得果浆酶解液Ⅰ；将果浆酶解液Ⅰ转移至玻璃锥形瓶中，加入体积分数70％酸性乙醇(含0.5％冰醋酸)3L/kg果浆酶解液Ⅰ，用柠檬酸调pH为3，并密封处理，将密封后的玻璃容器放入超声机中，进行超声提取，50℃，500w，超声提取1h，减压过滤至固体物全部除去，得到粗提液，加入混合酶Ⅱ4.0g/L粗提液(α-葡萄糖苷酶及α-鼠李糖苷酶质量比为3:1，酶活力均为1000U/g)，混合90min，并用45℃真空浓缩后(浓缩至粗提液原体积1/5)，加入填有DX101型大孔树脂柱进行上样，上样量为0.1倍树脂柱体积，吸附0.5h，用蒸馏水冲柱，弃洗脱液，再用体积分数60％乙醇溶液洗脱3倍树脂体积并收集洗脱液。洗脱液45℃真空浓缩后-40℃冷冻干燥48h，得蓝莓花青素提取物。
实施例3
实施例与实施例1制备方法相同，不同之处在于：混合酶I蓝莓与果浆比例为20g/kg果浆，酶解时间为2h；加入体积分数60％酸性乙醇(含0.5％冰醋酸)3L/kg果浆酶解液Ⅰ，用柠檬酸调pH为4。
试验例1
组1:对照组；(组1:无混合酶Ⅰ组：采用实施例1的提取方法，不同之处在于不添加混合酶Ⅰ)
组2:普通酶解组：采用实施例1的提取方法，不同之处在于：将混合酶Ⅰ替换成等量的普通混合酶(纤维素酶：果胶酶质量比1:1)；
组3:半纤维素酶组：采用实施例1的提取方法，不同之处在于：将混合酶Ⅰ替换成等量的半纤维素酶混合酶(纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶质量比5:2:1)；
组4:木瓜蛋白酶组：采用实施例1的提取方法，不同之处在于：将混合酶Ⅰ替换成等量的木瓜蛋白酶混合酶(纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶质量比5:2:1)；
组5:混合酶Ⅰ组：即实施例1。
测定五组实验组蓝莓花青素提取率(采用双波长示差法测定三组蓝莓花青素提取率，可参考张盼盼,王丽,时志军,蓝莓果渣花青素的超声辅助提取工艺优化[J].食品与机械,2017(2).)
蓝莓花青素提取率测量方法：双波长pH示差法
取1g产品溶解在1ml的60％酸性乙醇(含0.02％冰醋酸)中，分别加入pH4.5缓冲溶液(0.4mol/L醋酸钠)和pH1.0缓冲溶液(0.25mol/L氯化钾)9ml，摇匀，静置15min，转入光路长为1cm的比色皿中，以60％酸性乙醇(含0.02％冰醋酸)替代样品溶液做空白对照，分别在520nm和700nm波长处测定吸光度。
Y＝(A/εL)×M×DF×V/W
式中：
Y——花青素提取率；％
A——吸光度，A＝(A520pH1.0-A700pH1.0)-(A520pH4.5-A700pH4.5)；
Ε——花青素-葡萄糖苷消光系数；
L——光程，1cm；
M——花青素-葡萄糖苷分子量；
DF——稀释因子；
V——最终体积，mL；
W——产品重量，g。
结果如表1和图1所示。
表1五组蓝莓花青素提取率
序号 1 2 3 4 5
提取率(mg/100g) 308.40 485.45 532.63 523.97 648.32
由图1和表1以上数据可以看出，使用混合酶Ⅰ，即其中同时加入半纤维素酶和木瓜蛋白酶后，蓝莓花青素提取率上升，而半纤维素酶和木瓜蛋白酶在本发明的混合酶Ⅰ中均起到重要的作用，同时使用才能达到好的效果，单独使用在混合酶Ⅰ中效果均不佳，说明两种酶在破坏植物细胞结构上发挥协同作用，可破坏植物细胞壁与胞内支撑纤维。
试验例2
采用实施例1中蓝莓花青素提取分离纯化方法，验证超声提取适宜条件。
各分组的提取分离纯化方法同实施例1，不同之处在于：
组1：对照组；(组1:无超声处理组)
组2；超声条件：50℃，500w，30min；
组3；超声条件：60℃，500w，30min；
组4：超声条件：40℃，500w，30min；
组5：超声条件：50℃，450w，30min；
组6：超声条件：50℃，550w，30min。
并采用试验例1中的方法测定六组实验组蓝莓花青素提取率，结果如图2和表2所示。
表2六组蓝莓花青素提取率
序号 1 2 3 4 5 6
提取率(mg/100g) 280.24 650.42 608.32 598.56 632.68 642.74
由图2和表2以上数据可以看出，超声提取适宜条件为50℃，500w，30min。
当温度升高或者降低，功率提高或者降低效果均会降低，本发明50℃条件下酶活高。
试验例3
采用实施例1中蓝莓花青素提取分离纯化方法，验证混合酶Ⅱ对蓝莓花青素提取物纯度的影响。
各分组的提取分离纯化方法同实施例1，不同之处在于：
组1：对照组：不加混合酶Ⅱ处理；
组2：加入α-葡萄糖苷酶(1000U/g)4.0g/L粗提液；
组3：加入α-鼠李糖苷酶(1000U/g)4.0g/L粗提液；
组4：加入混合酶Ⅱ(α-葡萄糖苷酶：α-鼠李糖苷酶质量比3:1)4.0g/L粗提液，混合60min；
提取物中花青素纯度测定采用盐酸甲醇法，以2％盐酸甲醇溶液溶解样品后在波长530nm处测定吸光度，(530nm下样品吸光度/530nm下标准品吸光度)*100％，结果如图3所示。
表3四组蓝莓花青素纯度
序号 1 2 3 4
纯度 26.0％ 45.2％ 33.8％ 52.4％
由图3和表3以上数据可以看出，加入混合酶Ⅱ(α-葡萄糖苷酶：α-鼠李糖苷酶＝3:1)混合60min可有效提升产品花青素纯度，而α-葡萄糖苷酶：α-鼠李糖苷酶在本发明的混合酶Ⅱ中均起到到重要的作用，同时使用才能达到好的效果，单独使用在混合酶Ⅱ中效果均不佳，主要由于蓝莓细胞内花青素同时存在葡萄糖苷与鼠李糖苷几种结合形态，同时使用两种糖苷酶，水解糖苷种类更全面。

Claims (10)

1.一种蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蓝莓果清洗干净并晾干，用盐水浸泡，再用清水洗净晾干，进行破碎处理，得蓝莓果浆；
(2)向上述蓝莓果浆中加混合酶Ⅰ，进行酶解，获得果浆酶解液Ⅰ；
(3)向上述果浆酶解液Ⅰ中加入酸性乙醇溶液作为提取剂，并置于玻璃容器中，做密封处理；
(4)将密封后的玻璃容器进行超声提取，获得超声提取产物，并进行减压过滤，得到粗提液；
(5)向上述粗提液中加入混合酶Ⅱ，静置酶解，并将酶解液真空浓缩；
(6)将上述浓缩液洗脱纯化，并将洗脱液真空浓冷冻干燥，得干燥后的蓝莓花青素提取产物；
所述混合酶Ⅰ成分为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶；所述混合酶Ⅱ的成分为α-葡萄糖苷酶及α-鼠李糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，所述混合酶Ⅰ中纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶的质量比优选为5:1:2:1，采用纤维素酶为4000U/g、半纤维素酶1000U/g、果胶酶1000U/g、木瓜蛋白酶1000U/g，混合酶Ⅰ与果浆比例为16-20g/kg果浆，酶解时间为1.5-2h。
3.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，所述混合酶Ⅱ中α-糖苷酶：α-鼠李糖苷酶的质量比为3:1，两种酶活力均为1000U/g，混合酶Ⅱ与粗提液比例为4g/L，酶解时间为1h-1.5h。
4.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述盐水浸泡步骤中，采用盐水的质量分数为10-15％，浸泡时间为0.5h-1h。
5.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述酸性乙醇溶液作为提取剂中酸性乙醇体积分数为60-70％，含有体积分数冰醋酸0.02-0.5％，比例为3L/kg果浆酶解液Ⅰ，使用柠檬酸溶液调节pH值至3-4。
6.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述超声温度设定50℃，功率设定500w，时间0.5h-1h。
7.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(6)所述洗脱纯化中采用大孔树脂柱，上样量为0.1～0.5倍树脂柱体积，吸附0.5～24h，并用蒸馏水冲柱，乙醇溶液洗脱。
8.根据权利要求7所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法，其特征在于，所述大孔树脂采用AB-8或DX101型大孔树脂柱。
9.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的提取方法，其特征在于，步骤(6)所述真空浓缩步骤温度为45℃，冷冻干燥温度为-40℃，时间24h-48h。
10.一种权利要求1所述的蓝莓花青素的提取分离纯化方法所提取的蓝莓花青素。
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