CN111965278A - 一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测桑枝中1‑脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法，具体包括将桑枝粉碎的样本粉末；采用超纯水溶解样本粉末，依次经过超声、离心处理，得待测样品提取液；待测样品提取液采用1‑脱氧野尻霉素衍生化试剂盒进行衍生化处理，得到待测液；再利用液相色谱准确测定待测液中1‑脱氧野尻霉素含量。本发明公开的检测试剂盒及利用其检测桑枝中1‑脱氧野尻霉素含量的方法，操作简单、结果准确，证明桑枝中含有较高含量的DNJ，有利于桑枝提取DNJ的发展和桑树的综合利用。

Description

一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及桑树中生理活性物质研究技术领域，更具体的说是涉及一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法。
背景技术
桑树(Morus albaL.)是桑科，桑属落叶乔木或灌木，高可达15米。叶为桑蚕饲料，木材可制器具，枝条可编箩筐，桑皮可作造纸原料，桑椹可供食用、酿酒，叶、果和根皮均可入药。早在《本草纲目》中就有记载：“桑叶乃手足阳明之药，汁煎代茗，能止消渴，明目长发”，即证明桑叶具有要用效果。而桑白即桑根的皮，具有消渴、消肿、泻下及治鼻衄、降压、抗炎、抗癌等治疗效作用和生物活性。桑椹即桑果，富含果糖、果酸、果胶、天然色素、白藜芦醇，Vc、B1、B2等7种维生素，人体必须的铁、钙、锌、硒、锰等16种微量元素及氨基酸，具有补血、益肾、明目、乌发、抗衰老、降血压、预防慢性肝炎、治疗失眠和神经衰弱等多种医疗保健功能。
桑叶、桑白、桑果之所以有药效是因为含有生理活性物质。1-脱氧野尻霉素(DNJ)是桑树中的一种哌啶类生物碱，是桑叶、桑白、桑果中的特征成分。现代药理实验证明，DNJ在治疗糖尿病和抗菌消炎等方面具有良好的作用，具有明显抑制食后血糖急剧升高、延缓糖尿病发作和恶化等作用，并且还具有抑制肿瘤转移和病毒活性等作用。
为了研究和推广需要寻求大量提取DNJ的方法，但是桑叶、桑果、桑白中虽然含有DNJ，但是由于原料成本高、资源有限，造成提取DNJ成本较高。而桑枝主要指桑树的一年生及半年生枝条，桑树每年需要剪伐桑枝1～2次，产生大量的桑枝资源，成本低廉。但是，采用现有检测桑枝中DNJ等活性物质含量时，粉碎处理因桑枝皮层纤维多不易粉碎，过筛时去除皮层纤维，而DNJ等活性物质在皮层纤维中含量不容忽视，从而导致检测桑枝中DNJ等活性物质含量低，所以预计提取效果低、提取成本高，严重限制了由桑枝提取DNJ的发展。
因此，提供一种准确、简单的检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的主要试剂盒及使用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的试剂盒及方法，检测结果准确，操作简单有利于桑枝提取DNJ的发展。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒，包括盒身以及与所述盒身铰接的盒盖，所述盒身内固定有瓶架，其特征在于，所述瓶架顶面向内形成凹槽，所述凹槽内安装有第一标准液瓶、第二标准液瓶、第三标准液瓶、第四标准液瓶、第五标准液瓶、第六标准液瓶、A液瓶、B液瓶、C液瓶和D液瓶。
上述优选技术方案的有益效果是：操作简单、节省试剂、检测准确。
本发明还公开了一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，包括如下步骤：
(1)将桑枝粉碎，得到样本粉末密封，测定样本粉末的含水率；
(2)采用超纯水浸溶样本粉末，依次经过超声、离心处理，得待测样品提取液；
(3)取待测样品提取液采用上述公开的衍生化试剂盒进行衍生化处理，得到待测液；
(4)利用液相色谱仪检测1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的标准液，将检测结果与标准液建立标准曲线，再将待测液经过液相色谱仪检测得到峰面积，根据检测得到的峰面积与标准曲线确定桑枝中1-脱氧野尻霉素的含量。
需要说明的是，桑枝主要指桑树的一年生和半年生枝条，为常用的中药材，据《中国药典》记载，有着祛风湿，利关节，行水之功效，适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。现代药理学研究表明，桑枝主要含有多糖、黄酮类化合物、香豆精类化合物、生物碱等活性物质。此外还含有挥发油、氨基酸、有机酸以及各类维生素,其具有抗真菌、消炎、降血糖、清除体内超氧离子自由基的作用。
优选的，步骤(1)中所述桑枝包括一年生桑树枝条或半年生及以上桑树冬伐或夏伐的枝条；所述桑树包括桂桑优12、桂桑优62、桑特优2号、桂桑5号或桂桑6号的桑树；所述粉碎过程设定技术参数粉碎至60目，共进行2～3次；取0.1-3g样本粉末加入至水分测定仪进行测定，得样本粉末的含水率。
优选的，步骤(2)中所述超纯水按照固液比为0.5：35(g/mL)加入；所述超声波处理的温度为50℃、时间为2h-3h；所述离心的转速为3500r-4000r/min，时间为4min-8min。
优选的，步骤(3)中将待测样品提取液与所述1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的A液及B液混合均匀，恒温反应；然后加入C液终止衍生化，最后加D液酸化，使沉淀物溶解。
优选的，步骤(3)中所述A液加入至待测样品提取液后，与B液、C液和D液的体积比为1：1：2：10；所述恒温反应的温度是25℃，时间为20min。
优选的，所述A液采用PH为8-9、浓度为0.4mol/L的硼酸钾液；
所述B液为5mol/L芴甲氧羰酰氯溶液，所述芴甲氧羰酰氯溶液采用50％的乙腈-水混合液溶解芴甲氧羰酰氯制备得到；
所述C液为1mol/L的甘氨酸溶液；
所述D液为质量分数为0.1％的乙酸溶液。
优选的，步骤(4)具体为：
(a)将DNJ标准品用超纯水稀释分别配成标准浓度1(标1)为1.0×10-1g/ml、标准浓度2(标2)为1.0×10-2g/ml、标准浓度3(标3)为1.0×10-3g/ml、标准浓度4(标4)为1.0×10- 4g/ml、标准浓度5(标5)为标1.0×10-5g/ml、标准浓度6(标6)为1.0×10-6g/ml溶液，按照步骤(3)所述方法进行衍生化处理，并分别通过0.45μm尼龙膜过滤；
(b)将经过衍生化处理的标准溶液加入至液相色谱仪中进行检测，测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值；将检测得到的峰面积和标准液的浓度建立标准方程，即根据标准品的不同的浓度(x)和相应的峰面积(y)，按y＝ax+b，算出常数a、b值和标准曲线y＝ax+b；
(c)将待测液经过0.45μm尼龙膜过滤后加入至液相色谱仪进行检测，流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值得待测样品峰面积；
(d)根据待测样品峰面积和标准方程计算得到待测液中DNJ含量；根据步骤(b)得到的标准曲线y＝ax+b和样本浓度的峰面积(y)，计算出样本浓度(x)，即为待测液中DNJ含量；
(e)由待测液中DNJ含量、待测样品粉末含水率计算得到桑枝中DNJ含量。
优选的，步骤(b)和步骤(c)中乙酸溶液的质量百分比为0.1％。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，具有如下有益效果：
(1)粉碎过程中不过筛或过筛不去除皮层，从而可以保留皮层纤维中的生理活性成分，减少人为误差，使得最终的检测结果准确；
(2)经过检测得到桑枝中1-脱氧野尻霉素含量明显提高，有利于进一步研究从桑枝中提取1-脱氧野尻霉素，降低1-脱氧野尻霉素的提取成本；
(3)本发明公开的试剂盒操作简单，并且借助标准方程进行测量，结果误差率小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1提供的一种1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的结构示意图。
在图中：
1为瓶架；2为盒身；3为盒盖；4为第一标准液瓶(标准浓度1(标1)为1.0×10-1g/ml的标准液)；5为第二标准液瓶(标准浓度2(标2)为1.0×10-2g/ml的标准液)；6为第三标准液瓶(标准浓度3(标3)为1.0×10-3g/ml的标准液)；7为第四标准液瓶(标准浓度4(标4)为1.0×10-4g/ml的标准液)；8为第五标准液瓶(标准浓度5(标5)为1.0×10-5g/ml的标准液)；9为第六标准液瓶(标准浓度6(标6)为1.0×10-6g/ml的标准液)；10为A液瓶；11为B液瓶；12为C液瓶；13为D液瓶。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，包括如下步骤：
(1)将桑枝粉碎，得到样本粉末密封，测定样本粉末的含水率；桑枝包括一年生桑树枝条或两年生及以上桑树冬伐或夏伐的枝条；桑树包括桂桑优12、桂桑优62、桑特优2号、桂桑5号或桂桑6号的桑树；粉碎过程设定技术参数粉碎至60目，共进行2～3次；取0.1-3g样本粉末加入至水分测定仪进行测定，得样本粉末的含水率。
(2)采用超纯水浸溶样本粉末，依次经过超声、离心处理，得待测样品提取液；超纯水按照固液比为0.5：35(g/mL)加入；超声波处理的温度为50℃、时间为2h-3h；离心的转速为3500r-4000r/min，时间为4min-8min；
(3)取待测样品提取液采用权利要求1公开的衍生化试剂盒进行衍生化处理，得到待测液；将待测样品提取液与1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的A液及B液混合均匀，恒温反应；然后加入C液终止衍生化，最后加D液酸化，使沉淀物溶解；A液加入至待测样品提取液后，与B液、C液和D液的体积比为1：1：2：10；恒温反应的温度是25℃，时间为20min。
A液采用PH为8-9、浓度为0.4mol/L的硼酸钾液；
B液为5mol/L芴甲氧羰酰氯溶液，芴甲氧羰酰氯溶液采用50％的乙腈-水混合液溶解芴甲氧羰酰氯制备得到；
C液为1mol/L的甘氨酸溶液；
D液为质量分数为0.1％的乙酸溶液。
(4)利用液相色谱仪检测1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的标准液，将检测结果与标准液建立标准曲线，再将待测液经过液相色谱仪检测得到峰面积，根据检测得到的峰面积与标准曲线确定桑枝中1-脱氧野尻霉素的含量；
具体为：
(a)将DNJ标准品用超纯水稀释分别配成标准浓度1(标1)为1.0×10-1g/ml、标准浓度2(标2)为1.0×10-2g/ml、标准浓度3(标3)为1.0×10-3g/ml、标准浓度4(标4)为1.0×10- 4g/ml、标准浓度5(标5)为标1.0×10-5g/ml、标准浓度6(标6)为1.0×10-6g/ml溶液，按照步骤(3)方法进行衍生化处理，并分别通过0.45μm尼龙膜过滤；
(b)将经过衍生化处理的标准溶液加入至液相色谱仪中进行检测，测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值；将检测得到的峰面积和标准液的浓度建立标准方程，即根据标准品的不同的浓度(x)和相应的峰面积(y)，按y＝ax+b，算出常数a、b值和标准曲线y＝ax+b；
(c)将待测液经过0.45μm尼龙膜过滤后加入至液相色谱仪进行检测，流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值得待测样品峰面积；
(d)根据待测样品峰面积和标准方程计算得到待测液中DNJ含量；根据步骤(b)得到的标准曲线y＝ax+b和样本浓度的峰面积(y)，计算出样本浓度(x)，即为待测液中DNJ含量；
(e)由待测液中DNJ含量、待测样品粉末含水率计算得到桑枝中DNJ含量。
其中，步骤(b)和步骤(c)中乙酸溶液的质量百分比为0.1％。
需要说明的是，桑枝主要指桑树的一年生和半年生枝条，为常用的中药材，据《中国药典》记载，有着祛风湿，利关节，行水之功效，适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。现代药理学研究表明，桑枝主要含有多糖、黄酮类化合物、香豆精类化合物、生物碱等活性物质。此外还含有挥发油、氨基酸、有机酸以及各类维生素,其具有抗真菌、消炎、降血糖、清除体内超氧离子自由基的作用。
实施例1
本发明实施例1公开了一种1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒，包括盒身以及与盒身铰接的盒盖，其特征在于，盒身内固定有瓶架，瓶架顶面向内形成凹槽，凹槽内安装有第一标准液瓶、第二标准液瓶、第三标准液瓶、第四标准液瓶、第五标准液瓶、第六标准液瓶、A液瓶、B液瓶、C液瓶和D液瓶。
实施例2
本发明实施例2一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，具体为桂桑优12桑园冬伐枝条的DNJ含量测定，包括如下步骤：
(1)桂桑优12桑园在冬至前10天冬伐，剪取下半年生枝条，称鲜物重；枝条稍干就可粉碎，按60目粉碎2-3次；加热除去水分，加热称三次恒重表示已充分干燥，得到样本粉末，称量干物重、并计算枝条含水率；
因桑枝粉会回潮，故要测样本粉末含水率；取样本粉末2-3g，用水分测定仪测定含水率；得到样本粉末前重为2.288g、烘干为2.213g，待测样本粉末含水率为3.320％。
(2)准确称取样本粉末0.5g，加超纯水35～40ml，水浴加温到50℃浸提，用超声波处理2.5h-4h，收集上清液；用3500r～40000r/min离心4-8min，收集上清液，2次合并，定溶至50.0ml得待测液。
(3)取配制的标准液(标1、标2、标3、标4、标5、标6)各1.0ml，分别加入A液1.0ml，与2.0ml B液混合，衍生化反应5min，加C液终止，再加D液20ml混匀；用0.45nm尼龙膜和干净注射器过滤到进样瓶，用高效液相色谱仪Agilent 1260测标1-标6的峰面积(y)。测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm。每个进样测量3次取平均值。根据标准品的不同的浓度(x)和相应的峰面积(y)，按y＝ax+b，算出常数a、b值，计算得标准方程y＝1.909x+7.039R2＝0.9977保存此方程，可多次使用。
(4)取上述制得的待测液1.0ml,加入1.0mlA液，与2.0ml B液混合，衍生化反应5min，加C液终止，再加D液20ml混匀,用0.45nm尼龙膜和干净注射器过滤到进样瓶，用高效液相色谱仪Agilent 1260测标1-标6的峰面积(y)。测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm。每个进样测量3次取平均值。3次峰面积为29.6、27.1、29.7。用标准方程y＝1.909x+7.039计算，进样液DNJ浓度为11.82、10.51、11.87ug/ml，平均为11.4ug/ml；桑枝干物DNJ含量为1.179mg/g。
实施例3
本发明实施例3一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，桂桑优62桑园夏伐枝条的DNJ含量测定，包括如下步骤：
(1)桂桑优62桑园在7月份夏剪，剪取上半年生枝条，称鲜物重；枝条稍干就可粉碎，按60目粉碎2-3次；加热除去水分，加热称三次恒重表示已充分干燥，得到样本粉末，称量干物重、并计算枝条含水率；
取样本粉末2-3g，用水分测定仪测定含水率，得到样本粉末前重为2.292g、烘干为2.233g，待测样本粉末含水率为2.57％。
(2)准确称取干桑枝粉0.5g，加超纯水35～40ml，水浴加温到50℃浸提，用超声波处理2.5h～4h，收集上清液；用3500r～40000r/min离心4-8min，收集上清液，2次合并，定容至50.0ml得待测液。
(3)实施例1得出的标准曲线方程和仪器的准确性，随机取标准液1.0ml,加入A液1.0ml,，与2.0ml B液混合，衍生化反应5min，加C液终止，再加D液20ml混匀；用0.45nm尼龙膜过滤至进样瓶,用高效液相色谱仪Agilent 1260测峰面积(y)。用方程y＝1.909x+7.039计算DNJ浓度(x)，验证是否与标准浓度相似。
(4)取待测液1.0ml,加入A液1.0ml,，与2.0ml B液混合，衍生化反应5min，加C液终止，再加D液20ml混匀，用0.45nm尼龙膜过滤到进样瓶，用高效液相色谱仪Agilent 1260测标1-标6的峰面积(y)。测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；每个进样测量3次取平均值，3次峰面积为3次峰面积为25.3、25.3、25.1，平均为25；用标准方程y＝1.909x+7.039计算，进样液DNJ浓度为9.57、9.62、9.52，平均为9.57ug/ml，因干桑枝还含有水分2.57％，所以桑枝干物DNJ含量为0.982mg/g。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述m的比较简单，相关之处参见部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒，包括盒身以及与所述盒身铰接的盒盖，其特征在于，所述盒身内固定有瓶架，所述瓶架顶面向内形成凹槽，所述凹槽内安装有第一标准液瓶、第二标准液瓶、第三标准液瓶、第四标准液瓶、第五标准液瓶、第六标准液瓶、A液瓶、B液瓶、C液瓶和D液瓶。
2.一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤
(1)将桑枝粉碎，得到样本粉末密封，测定样本粉末的含水率；
(2)采用超纯水浸溶样本粉末，依次经过超声、离心处理，得待测样品提取液；
(3)取待测样品提取液采用权利要求1公开的衍生化试剂盒进行衍生化处理，得到待测液；
(4)利用液相色谱仪检测1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的标准液，将检测结果与标准液建立标准曲线，再将待测液经过液相色谱仪检测得到峰面积，根据检测得到的峰面积与标准曲线确定桑枝中1-脱氧野尻霉素的含量。
3.根据权利要求1所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(1)中所述桑枝包括一年生桑树枝条或半年生及以上桑树冬伐或夏伐的枝条；所述桑树包括桂桑优12、桂桑优62、桑特优2号、桂桑5号或桂桑6号的桑树；所述粉碎过程设定技术参数粉碎至60目，共进行2～3次；取0.1-3g样本粉末加入至水分测定仪进行测定，得样本粉末的含水率。
4.根据权利要求1所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(2)中所述超纯水按照固液比为0.5：35(g/mL)加入；所述超声波处理的温度为50℃、时间为2h-3h；所述离心的转速为3500r-4000r/min，时间为4min-8min。
5.根据权利要求1所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(3)中将待测样品提取液与所述1-脱氧野尻霉素衍生化试剂盒的A液及B液混合均匀，恒温反应；然后加入C液终止衍生化，最后加D液酸化。
6.根据权利要求5所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(3)中所述A液加入至待测样品提取液后，与B液、C液和D液的体积比为1：1：2：10；所述恒温反应的温度是25℃，时间为20min。
7.根据权利要求6所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，所述A液采用PH为8-9、浓度为0.4mol/L的硼酸钾液；
所述B液为5mol/L芴甲氧羰酰氯溶液，所述芴甲氧羰酰氯溶液采用50％的乙腈-水混合液溶解芴甲氧羰酰氯制备得到；
所述C液为1mol/L的甘氨酸溶液；
所述D液为质量分数为0.1％的乙酸溶液。
8.根据权利要求7所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：
(a)将标准液按照步骤(3)所述方法进行衍生化处理，并分别通过0.45μm尼龙膜过滤；
(b)将经过衍生化处理的标准溶液加入至液相色谱仪中进行检测，测定条件为：流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值；将检测得到的峰面积和标准液的浓度建立标准方程；
(c)将待测液经过0.45μm尼龙膜过滤后加入至液相色谱仪进行检测，流动相由40％乙腈和60％的乙酸溶液组成，流速为1.0ml/min，进样量10μl，紫外检测波长为254nm；测定得到峰面积，重复检测多次，取平均值得待测样品峰面积；
(d)根据待测样品峰面积和标准方程计算得到待测液中DNJ含量；
(e)由待测液中DNJ含量、待测样品粉末含水率计算得到桑枝中DNJ含量。
9.根据权利要求8所述的一种检测桑枝中1-脱氧野尻霉素含量的方法，其特征在于，步骤(b)和步骤(c)中乙酸溶液的质量百分比为0.1％。
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