CN111956752A - 一种用于儿童呼吸道疾病的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中医药领域，涉及一种用于儿童呼吸道疾病的药物组合物。具体地，所述药物组合物包含：牛蒡子2‑4重量份，薏苡仁1‑3重量份，桔梗1‑3重量份，赤芍1‑3重量份，紫苏叶1‑3重量份，连翘2‑4重量份，焦山楂1‑3重量份，薄荷1‑3重量份，甘草0.5‑1.5重量份；可选地，还包含菊花4‑12重量份。本发明还涉及该药物组合物的质控方法和制药用途。本发明的药物组合物具有益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊等作用，具有应用于制备治疗和/或预防咽炎的药物的潜力。

Description

一种用于儿童呼吸道疾病的药物组合物
技术领域
本发明属于中医药领域，涉及一种用于儿童呼吸道疾病的药物组合物。具体地，本发明涉及一种治疗或预防呼吸道疾病的儿童用茶散药物组合物。具体地，所述儿童用茶散药物组合物为儿童用袋泡茶剂。本发明还涉及该药物组合物的质控方法和制药用途。
背景技术
非菌性炎症为咽炎的病因，其具有症状顽固，缠绵难愈病程长等临床特点，可直接对人们的生活和工作带来影响。临床中应用西医治疗较为广泛，但是主要以抗生素药物为主，有时候疗效并不显著，还会存在一些较为严重的副作用；我国的传统中医药，明显区别于西医，更注重从疾病的整体出发，强调辩证的治疗方法，往往治疗效果会更令人满意，同时副作用小。但是目前临床中的中药制剂应用相对局限，缺乏中医治疗咽炎的大规模实验，因此需要进行更为科学的临床研究。
咽炎其反复发作和病程迁延的特点，时常会对患者的日常生活、学习和工作带来不良的影响，给患者身心健康造成较大的创伤。长期病情发展，咽部粘膜、粘膜下微循环系统常受到炎性因素的刺激，则可使组织缺氧，发生代谢紊乱和腺体分泌失调，再加上慢性刺激对咽部神经末梢持续刺激作用，病情会逐步加重，临床中抗病毒和抗生素药物的使用，并不能达到满意的治疗效果。
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)从中医角度属于“疫”病范畴。新型冠状病毒感染的肺炎患者以发热、乏力、干咳为主要临床表现，均表现出一定的咽部炎症症状。其中，新冠肺炎轻型寒湿郁肺症患者临床表现包括发热、乏力、咳嗽、咯痰等，湿热蕴肺症患者临床表现也包括干咳、痰少、咽痛。
“上医治未病”最早源自于《黄帝内经》所说：“上工治未病，不治已病，此之谓也”。疾病的发展都有顺逆传变的规律，正确的中药干预则能够及时阻断疾病的加重或转变。中医药干预病程早期，使其不再发展，达到早发现，早干预，早治疗的效果，具有重要现实和长远价值。实践证明，中药早期干预对治疗新冠肺炎也具有重要意义。
“茶为力病之药”为古籍中医记载。现在研究表明茶含氨茶碱、茶多酚、咖啡碱、茶碱、可可碱等，能对很多疾病有治疗和保健的功效，具体有降血压、防治动脉硬化、抗辐射、防癌、助消化、解疲劳等作用。虽然茶叶具有很多中药药理作用，但是有效作用甚微。
茶文化是我国传统文化的重要组成部分。从古至今，都对人们的生活和保健有着积极的影响。药茶即茶剂，为中医药宝库重要成员，通俗讲就是像喝茶一样，将茶叶、中草药经过冲泡或煎煮后饮用，达到日常防病的目的。古典医药书籍张揖的《广雅》、孙楚的《出歌》、陶弘景的《神农本草经集注》、孙思邀的《千金要方》、王煮的《外台秘要》均有对药茶选取和作用的描述，同时还有很多药茶新方出现，成为了上至帝王将侯、下至平民百姓的保健药饮。
中药袋泡茶剂是将药茶炮制成粗粉，在特制的纸袋中分装，将纸袋药渣在沸水浸泡去除，饮用药液的新型制剂。源于我国古代煮散和饮剂发展而来，能起到益充气力，扶助困竭，调品阴阳，祛除邪恶，荡涤脏腑，保养皮肤的作用。袋泡剂药量大、体积小、方便服用、溶出快，最大限度的保留了传统汤剂的优势与特色，更接近大众的生活习惯，有效的将传统汤剂过度发展，无形中发展成为大众喜爱药物剂型的主流。
20世纪70年代日本最先将中药袋泡剂进行了研究，我国于20世纪80年代也有了中药袋泡剂的专门研究，尤特别是在中药袋泡剂工艺制备、有效浸出率、药理作用、临床应用等方面进行了更为细致化的研究，降压袋泡茶、八珍袋泡茶、川芍茶调袋泡剂等都被《中华人民共和国卫生部药品标准》记载。
现实中的袋泡茶，由于使用和经济价值的考虑，把茶叶打成扇状碎片成了基本流程，这就与名茶的美学概念相冲，即便是部分采用袋泡茶包装，也是仅供海外市场需求，这就很大程度上限制了袋泡茶在中国市场的发展。不打碎茶叶、保持茶叶原形的原茶袋泡茶，似乎更符合我国消费者的需求。
袋泡剂制备工艺较为简单，能尽可能的保留有效成分，浸出率高，迅速起效，方便服用等特点，在近年来，药材有效成分的浸出率提高方法越来越被重视，所以专门的制备工艺研究也逐渐增多，优化保质保量，取得了满意成绩。
儿童的气候特点主要表现在天气多变、时寒时暖、雨水逐渐增加，是呼吸道传染病的多发季节。时冷时热的天气很容易使人罹患呼吸道疾病，病原微生物通过呼吸道侵入易感人体，并随呼吸道分泌物继续向外传播，侵入另一易感机体的形成呼吸道传染性疾病。服用中药茶剂，使情志随生发之气而舒畅，达到早干预早预防的有益效果。
为寻求新的预防和早期治疗咽炎等呼吸道感染性疾病(包括新型冠状病毒肺炎引起的咽炎等病症和/或症状)的手段，提高患者生活质量提高，特别是控制急性咽炎病情复发，临床中开始重视中医药方法。另外，考虑到通常中医方法较为简单易行，还可以有效的减少抗生素类药物的误用与滥用，减少不良反应，远期效果令人满意，值得在生活实践中推广使用。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种药物组合物，本发明人惊奇地发现，该药物组合物养阴利咽，具有益气润肺、清喉利咽、去秽化浊等功效，能够有效地治疗和/或预防咽炎特别是儿童呼吸道疾病引起的咽炎；能够有效地祛痰，和/或能够有效地止咳。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包括：
Figure BDA0002689380240000031
Figure BDA0002689380240000041
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其包括：
Figure BDA0002689380240000042
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其包括：
Figure BDA0002689380240000043
Figure BDA0002689380240000051
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中的各成分均为中药饮片；
优选地，所述牛蒡子为炒牛蒡子；和/或
优选地，所述薏苡仁为炒薏苡仁。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其由上述成分组成。在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其活性成分(有效成分)由上述成分组成；可选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物为茶剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物为一种预防和/或治疗(例如早期干预)呼吸道疾病特别是儿童呼吸道疾病药物组合物(也称为儿童用茶药物组合物，简称为儿童茶)。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其单位剂量为2-10g，优选为3-6g、3-5g、3-4.5g、4-6g或4-5g，更优选为3g或4.5g。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其为茶剂；优选地，其包装为袋泡茶形式。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其为经粉碎的或经未粉碎的；优选为经粉碎的；优选地，粉碎后的药粉通过1号筛；更优选地，粉碎后的药粉通过1号筛并且不能通过5号筛。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其含水量为小于12％；优选地，小于或等于10％，或者小于或等于8％；更优选地，小于或等于6％，或者小于或等于5％。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物包含：
Figure BDA0002689380240000052
Figure BDA0002689380240000061
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物包含：
Figure BDA0002689380240000062
方剂的组成原则，最早见于《素问至真要大论》“主病之为君，佐君之为臣，应臣之为使”。历代医家在此基础上对方剂组成原则进行了丰富和扩展。
1.君药
是针对主病或主证起主要治疗作用的药物，即针对病证的主要病因、主导病机或主症而设，它是方剂组成中的核心部分。君药通常具有药力较强、药味较少、用量相对较大的特点。“量大者为君”的含义是相对于该药物本身的常规剂量而言，而不是在方剂中与其他药物相比的绝对剂量，例如，受到到药物本身的质地、药材质量和毒性的限制，如花叶类质轻之品用量较轻；贝壳等质重之品用量较重；质优力强的药材，用量宜小，反之则用量可稍大；乌头等毒性药物即使作为君药，其用量也较小。
2.臣药
臣药的含义有两层：1)辅助君药加强治疗主病或主证的药物；2)针对兼病或兼证起主要治疗作用的药物。其药味较君药为多，其药力与药量相对于君药较小。
3.佐药
佐药的含义有三层：1)佐助药，即配合君、臣药以加强治疗作用，或直接治疗次要症状的药物；2)佐制药，指消除或缓解君、臣药毒性及副作用的药物；3)反佐药，药病格拒时，与君药药性相反而在治疗中起相成作用的药物。
4.使药
使药的含义有二：1)引经药，能引导方中药力直达病所；2)调和药，调和方中诸药的性能、协调诸药的相互作用或起到矫味作用。使药通常药味数少，用量较小。
不拘于理论的限制，本发明人推测：
牛蒡子味辛性凉，疏散风邪、解毒利咽；金银花甘寒芳香，疏散风热、清热解毒，共为君药。臣以辛温不燥之紫苏叶，发表散邪兼以宣发肺气；专入肺经之射干、桔梗，宣肺祛痰、利咽止咳。赤芍凉血散瘀；焦山楂酸收，敛肺止咳，共为佐药；甘草止咳化痰、调和诸药，以为佐使。诸药合用，共奏疏风解毒，宣肺止咳之功。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物由上述重量份的各成分组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物由上述重量份的各成分以及一种或多种药学上可接受的辅料组成。
术语“辅料”在本申请中是指用以将主药给药的赋形剂或者媒介物，其包括但不限于稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、包衣材料等。辅料在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中被一般性描述。辅料的实例包括但不限于单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基硬脂酸羟基二十八酯、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素等。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，按照每g药物组合物计算：
牛蒡苷含量≥4.4mg；
优选地，牛蒡苷含量≥5.5mg；
更优选地，牛蒡苷含量≥7mg或≥7.5mg。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，按照每4.5g药物组合物(每袋)计算：
牛蒡苷含量≥19.80mg；
优选地，
牛蒡苷含量≥20mg。
本发明的药物组合物也称为四季茶之儿童茶、四季茶儿童茶或四季茶-儿童茶(均简称为儿童茶)。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物用于选自如下的1)-6)项中任一项所述的用途：
1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊；
2)治疗和/或预防季节性呼吸道疾病，优选地，所述呼吸道疾病为流感；
3)治疗和/或预防咽炎，优选地，所述咽炎为急性咽炎；优选地，所述咽炎为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)引起的咽炎；
4)祛痰，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者祛痰；
5)止咳，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者止咳；
6)抗氧化。
本发明的另一方面涉及一种提取物，其为本发明中任一项所述的药物组合物的水或者乙醇溶液的提取物。优选地，水的温度为大于或等于80℃、大于或等于85℃、大于或等于90℃或者大于或等于95℃。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的药物组合物或者本发明的提取物在制备选自如下的(1)-(5)项中任一项所述的药物中的用途：
(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊的药物；
(2)治疗和/或预防咽炎的药物；优选地，所述咽炎为急性咽炎；优选地，所述咽炎为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)引起的咽炎；
(3)祛痰药物，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者祛痰的药物；
(4)止咳药物，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者止咳的药物；
(5)抗氧化的药物。
本发明的再一方面涉及选自如下的(1)-(5)项中任一项所述的方法：
(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊的方法；
(2)治疗和/或预防咽炎的方法；优选地，所述咽炎为急性咽炎；优选地，所述咽炎为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)引起的咽炎；
(3)祛痰方法，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者的祛痰方法；
(4)止咳方法，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者的止咳方法；
(5)抗氧化方法；
包括给予有需求的受试者以有效量的本发明任一项所述的药物组合物或者本发明的提取物的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述的方法，其包括如下步骤：
冲泡茶饮，每次1袋，每天2-3次。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
养阴，又称滋阴、补阴、育阴、益阴。属补法。
利咽，指通过祛邪扶正，以通利咽喉，治疗咽喉病证的方法。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述药物组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将各药材分别粉碎，过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉；优选地，将1号筛上粉再次粉碎并过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉，与前面得到的粗粉合并；
(2)将得到的粗粉混合均匀；
(3)包装，灭菌；
优选地，步骤(1)中，牛蒡子与赤芍一起进行粉碎；优选地，其余药材单独粉碎或者一起粉碎。
本发明的再一方面涉及一种对本发明中任一项所述的药物组合物进行质量控制或者质量检测的方法，包括检测牛蒡苷的含量的步骤，其中，按照每g药物组合物计算，
如果满足：
牛蒡苷含量≥4.4mg，
药物组合物的质量合格；
优选地，通过高效液相色谱法检测牛蒡苷的含量；
优选地，色谱条件如下：
色谱柱：Syncronis-AQ C18(例如250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：乙腈(A)和水(B)；
流速：0.8—1.2mL·min-1；
波长：230nm；
进样量：5-10μL；
柱温：30℃(20-35℃)；
梯度洗脱程序：0～10min，14％～18％A；10～18min，18％A；18～22min，18％～19％A；22～42min，19％～31％A；42～50min，31％～55％A。
发明的有益效果
本发明的药物组合物取得了如下的(1)-(6)项中的任意一项或者多项所述的技术效果：
(1)养阴利咽；
(2)益气润肺、清喉利咽、去秽化浊；
(3)能够有效地治疗和/或预防咽炎特别是新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDisease 2019，COVID-19)引起的咽炎；
(4)能够有效地祛痰特别是用于新型冠状病毒肺炎患者祛痰；
(5)能够有效地止咳特别是用于新型冠状病毒肺炎患者止咳；和
(6)显著的抗氧化作用。
附图说明
如果没有特别说明，本发明的儿童茶样品在附图中有时也简称为“儿童”或“儿”。
图1：赤芍的薄层鉴别结果。①芍药苷对照品，②儿童茶，③儿童茶赤芍阴性。
图2A-图2D：急性咽炎大鼠咽部组织病理切片(HE×10)。其中，图2A.空白组；图2B.模型组；图2C.阿莫西林组；图2D.儿童茶组。
图3：儿童茶样品对急性咽炎大鼠外周血中TNF-α含量的影响。与正常组比较,**P<0.01；与模型组比较,**P<0.01。
图4：儿童茶样品对急性咽炎大鼠外周血中IL-1β含量的影响。与正常组比较,**P<0.01；与模型组比较,*P<0.05。
图5：儿童茶样品对急性咽炎大鼠外周血中IL-6含量的影响。
图6A：CCK-8法检测不同浓度儿童茶样品处理后THP-1细胞活力值
Figure BDA0002689380240000121
(n＝6)。**P<0.01vs Control*P<0.001vs Control。
图6B：LDH法检测不同浓度儿童茶样品处理后THP-1细胞活力值
Figure BDA0002689380240000122
(n＝6)。**P<0.01vs Control*P<0.001vs Control。
图7A：儿童茶样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子TNF-α的表达
Figure BDA0002689380240000123
(n＝3)**P<0.01vs Control##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。
图7B：儿童茶样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IP-10的表达
Figure BDA0002689380240000124
(n＝3)**P<0.01vs Control##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。
图7C：儿童茶样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IKBα的表达
Figure BDA0002689380240000125
(n＝3)**P<0.01vs Control##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。
图7D：儿童茶样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-6的表达
Figure BDA0002689380240000126
(n＝3)**P<0.01vs Control##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。
图7E：儿童茶样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-1β的表达
Figure BDA0002689380240000127
(n＝3)**P<0.01vs Control##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。
图8A：CCK-8法检测儿童茶样品对293T细胞活力的影响
Figure BDA0002689380240000128
Figure BDA0002689380240000129
(n＝18)。**P<0.01vs Control*P<0.001vs Control。
图8B：LDH法检测儿童茶样品对293T细胞活力的影响
Figure BDA00026893802400001210
Figure BDA00026893802400001211
(n＝18)。**P<0.01vs Control*P<0.001vs Control。
图9A：不同浓度儿童茶样品对293T细胞ARE荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)。注：**P<0.001vs Control*P<0.05vs Control。
图9B：不同浓度儿童茶样品对293T细胞NF-κB启动子荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)。注：**P<0.01vs Control,*P<0.05vs Control,##P<0.01vs Model,#P<0.05vsModel。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实验例中用到的儿童茶药液，其配制方法均为用常温蒸馏水配制成所需浓度的药液，超声20min使药液充分混合，不需要除去药渣；取上清液用于给药、进一步稀释或存储备用。
制备例1：四季茶之儿童茶袋泡剂样品(SJE2020002)的制备
处方：
Figure BDA0002689380240000131
上述各药味单独粉碎，过筛成全部通过1号筛(10目)和5号筛(80目)之间的粗粉，按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)60分钟，共得药粉量为26.55kg。灭菌后，采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率98-99.5％)，再外包装即得成品。
制备例2：四季茶之儿童茶袋泡剂样品(SJE2020003)的制备
处方与制备例1相同。
上述药味按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将饮片混合后进行粉碎，粉碎成能全部通过1号筛(10目)和5号筛(80目)之间的粗粉，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)30分钟，共得药粉量为26.7kg。采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率98-99.6％)，灭菌后，外包装即得成品。
制备例3：四季茶之儿童茶袋泡剂样品(SJE2020004)的制备
处方与制备例1相同。
上述药味按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将饮片混合后进行粉碎，粉碎成能全部通过1号筛和5号筛(80目)之间的粗粉，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)30分钟，共得药粉量为26.77kg。灭菌，采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率99.7％)，再外包装即得成品。
实验例1：质量检测和控制
现用薄层色谱法(TLC)对样品中的主要药物之一赤芍和主要药物之一射干进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对主要成分之一牛蒡苷进行含量测定。根据茶剂标准(2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188)，进行全面的质量标准研究，为制剂的进一步研究提供科学有效的依据。
1实验材料与实验方法
1.1实验材料与试剂
1.1.1仪器
Figure BDA0002689380240000151
1.1.2试剂与材料
Figure BDA0002689380240000152
1.1.3对照品
含量测定用对照品：牛蒡苷(批号：110819-201812，纯度：95.0％)购自中国食品药品检定研究院。
薄层鉴别用对照品芍药苷(批号：110736-201943，纯度：95.1％)，均购自中国食品药品检定研究院。
1.1.4样品
按照制备例1-3制得的三批儿童茶样品(SJD2020001、SJD202001、SJD2020002)，同时同法制备缺赤芍各一批样品作为阴性对照。
阴性对照1除了不含赤芍之外，其它药材、用量以及制备工艺均与制备例3相同。设置阴性样品的目的是为了证明样品中赤芍的鉴别方法是可靠的，表明样品中确实有赤芍中芍药苷的特征斑点，并且除赤芍外其它药材中没有芍药苷。
1.2实验方法
1.2.1薄层鉴别
1.2.1.1赤芍薄层鉴别
(1)供试品及阴性供试品溶液制备
取样品(制备例3制得)的药粉2g，加乙醇40mL，振摇滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5mL，溶解，作为供试品溶液。
取阴性对照1，同法制成阴性对照溶液。
(2)对照药材溶液的制备
取赤芍对照药材0.5g，同1.2.1.1项(1)下方法制成对照药材溶液。
(3)对照品溶液配制
取芍药苷对照品2mg，加乙醇制成对照品溶液(2mg·mL-1)。
(4)薄层色谱展开条件
薄层板：硅胶G薄层板
点样量：上述各溶液5μL
展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)
显色剂：5％香草醛硫酸溶液，105℃加热显色
1.2.2检查
根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188检查。
1.2.2.1水分测定
根据2015版《中国药典》第四部水分测定法(通则0832)进行测定。
1.2.2.2装量差异
分别取制备例1-3制得样品各一批，每批10袋，根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188项下的“装量差异”方法检查，本品为3g，装量差异应在±12％。
1.2.2.3微生物限度
分别取制备例1-3制得样品各一批，每批3袋，根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188项下的“微生物限度”方法检查。
1.2.3含量测定
分别取制备例1-3制得样品各一批，各3份，每份3g。
样品制备：取3g样品置于烧杯中，加入180mL 85℃纯水，浸泡30min；取样品加甲醇超声30min，冷却，转移至离心管，室温离心15min(5000rpm)，上清液转移至10mL容量瓶，用90％甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得，备用。
色谱条件：色谱柱：Syncronis-AQ C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)；流速：0.8mL·min-1；波长：230nm；进样量：10μL；柱温：30℃。梯度洗脱程序：0～10min，14％～18％A；10～18min，18％A；18～22min，18％～19％A；22～42min，19％～31％A；42～50min，31％～55％A。理论塔板数按牛蒡苷峰计算不低于5000。
2实验结果
2.1薄层鉴别结果
薄层结果见图1。
由图1可见，儿童茶样品中均有芍药苷的特征斑点，同时缺赤芍的阴性样品未见芍药苷的特征斑点，说明该方法可以用于样品中赤芍的鉴别。
2.2茶剂通则检查结果
2.2.1水分检查结果
如表1所示。
表1：水分检查结果
Figure BDA0002689380240000171
Figure BDA0002689380240000181
由表1可见，水分均低于12％，符合茶剂要求。
2.2.2装量差异检查结果
如表2所示。
表2：装量检查结果
Figure BDA0002689380240000182
由表2可见，装量差异均符合茶剂要求。
2.2.3微生物检查结果
3批样品微生物检测结果符合规定。
2.3含量测定结果
外标法计算含量，取平均值，结果如表3所示。
表3：三批样品含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0002689380240000183
Figure BDA0002689380240000191
为了更有代表性地确定儿童茶的指标成分含量限度，本发明人以药典中牛蒡苷含量标准为依据，确定儿童茶的指标成分含量限度。具体内容如下：
依据2015版中国药典中规定炒牛蒡子饮片中牛蒡苷5.0％，按照茶剂制备工艺，牛蒡子在处方中质量占比为11.1％，结合三批次中试放大生产儿童茶平均收率为99.0％，计算为5.5mg/g，下浮20％为4.4mg/g，每袋(4.5g)为19.8mg作为儿童茶中牛蒡苷含量的标准。
儿童茶的含量限量标准：儿童茶每袋含牛蒡子以牛蒡苷(C27H34O11)计不少于19.8mg。
实验例2：儿童茶对金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎大鼠模型的预防与治疗作用
本实验中采用金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎大鼠，从表观指标、病理学指标、生化指标三方面评价了儿童茶的药效作用，为儿童茶的临床应用提供了科学依据。
1材料与方法
1.1实验仪器
Figure BDA0002689380240000192
Figure BDA0002689380240000201
1.2试剂
Figure BDA0002689380240000202
Figure BDA0002689380240000211
1.3受试药物
儿童茶处方浸泡提取2次，每次10倍量沸水，浸泡40分钟，过滤，60℃以下，浓缩到糖度15-17Brix,喷雾干燥制得。
1.4阳性药物
阿莫西林胶囊，山东淄博新达制药有限公司。批号：191040，在有效期内。规格：0.25g/片，用法用量：参照临床用法，造模第一天开始给药，剂量与临床等效，每只大鼠ig0.36g/kg，1次/日，连续5天。
1.5试验动物
SPF级SD大鼠，雌雄不限，体重180～220g；由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：1103222011009608，许可证号：SCXK(京)2019-0008。饲养条件：ABSL-2实验室，-20Pa，温度22±1℃，湿度40～50％。
1.6金黄色普通球菌
金黄色葡萄球菌标准菌株6538购自ATCC。
1.7剂量设计和药物配制
1.7.1儿童茶提取物：人临床用量为9g/70kg/d，试验大鼠用量为3.5g/kg/次，相当于临床16倍剂量。
药液配制：试验前用蒸馏水配制成0.35g/ml浓度的药液，按1ml/100g体重/次灌胃给药，2次/日，预给药7天后造模并继续灌胃给药5天。
1.7.2阿莫西林胶囊：参照临床用法。第1天感染金黄色葡萄球菌后1h阳性药组开始灌胃给予0.36g/kg(相当于人临床用量的等倍)剂量，1次/日，连续5天。
药液配制：试验前用蒸馏水将胶囊剂里面的颗粒配制成36mg/ml浓度的药液，4℃保存备用。
1.8细菌培养
取2个250ml锥形瓶，每个锥形瓶中加入1g酵母浸膏、2g蛋白胨、2g氯化钠、200ml去离子水并混合均匀，配制成LB培养基，放入4℃层析柜中保存备用。
取金黄色葡萄球菌菌落接种于装有LB培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养17h。菌液3220rcf，离心1min后，弃上清，显微镜下计数；调整菌液密度为1.9x109/ml。
1.9分组与检测
SD大鼠28只，随机分为正常组、模型组、儿童茶组、阿莫西林组，每组7只。
儿童茶给药组灌胃预给药七日，剂量3.5g/kg，一日两次；七天后除正常组外，其余各组于咽部注射金黄色葡萄球菌液造模，1x108/只，连续两日，造模同时持续给药；阿莫西林组于造模第一天开始灌胃给药，给药剂量为0.36g/kg，一日一次。造模结束后儿童茶给药组及阿莫西林组再继续给药三天，第四天称重解剖，进行观察和检测。
1.9.1咽部病变打分
评分标准(出自中华中医药学会中药实验药理专业委员会制定的《急性咽炎动物模型制备规范》(草案)，中药药理与临床2018；34(1))：根据组织的颜色，光泽，分泌物多少，咽部充血和肿胀程度，可分为4个等级。
“-”：咽组织浅红色，表面湿润有光泽，无分泌物，无充血，肿胀等病理现象；
“+”：咽部粘膜光泽度差，有少量分泌物和轻度充血、肿胀；
“++”：咽部黏膜颜色为深红色，光泽度差，出现分泌物，并伴有中度充血，肿胀等现象；
“+++”：咽部黏膜呈暗红色，粘液分泌增加，明显的充血和肿胀。
1.9.2大鼠外观行为表征打分
评分标准(出自中华中医药学会中药实验药理专业委员会制定的《急性咽炎动物模型制备规范》(草案)，中药药理与临床2018；34(1))：根据大鼠体重、活动能力、皮毛色泽的情况，可分为4个等级。如下面的表4所示。
表4
指标分级 体重 活动能力 皮毛色泽
0 正常 正常 正常
1 基本正常 基本正常 基本正常
2 轻度下降 轻度下降 轻度下降
3 明显下降 明显下降 明显下降
1.9.3大鼠血白细胞计数及其分类计数检测
各组动物处死前，断尾取血涂片进行血常规白细胞数目、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比的测定。
1.9.4病理学检测观察
1.9.4.1组织石蜡包埋切片
取材：大鼠麻醉，取咽部组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精1h-85％酒精1h-90％酒精1h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
1.9.4.2HE染色
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ30min-二甲苯Ⅱ30min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染5-10min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗10min，PBS返蓝5min，流水冲洗。
伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
显微镜镜检，图像采集分析。
1.9.5大鼠血清炎性因子检测
麻醉大鼠，腹主动脉取血，注入促凝管后于室温静置45min，3500rpm离心10min，吸取上清至无菌EP管内-80℃保存。测定前使样本置于室温中复融，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IL-1β，IL-6和TNF-α水平，操作依据试剂盒说明进行，酶标仪450nm吸光度检测各指标。
2实验结果
2.1儿童茶对急性咽炎大鼠外观行为和咽部打分的影响
如表5和表6所示。
表5：儿童茶对急性咽炎大鼠外观行为表征的影响
Figure BDA0002689380240000241
Figure BDA0002689380240000242
注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
表6：儿童茶对急性咽炎大鼠咽部病变的影响
Figure BDA0002689380240000243
Figure BDA0002689380240000251
表5结果显示：与正常组相比，模型组大鼠体重明显下降(P<0.01)；胸腺重量下降显著(P<0.01)；模型组表现出扎堆不动现象，精神状态欠佳，活动能力明显下降(P<0.01)；模型组皮毛干涩、暗淡无光，皮毛色泽评分显著升高(P<0.01)；与模型组大鼠比较，儿童茶给药组大鼠的体重、胸腺重量增加，活跃程度明显升高，与阿莫西林组大鼠的行为表征一致。
表6结果显示，正常组大鼠咽部炎症反应均为“-”级，无炎症特征出现。模型组咽部炎症反应为“++”和“+++”级，咽粘膜和组织病变明显，造模成功。儿童茶给药组，大部分伴有少量分泌物和轻度充血、肿胀，炎症症状明显改善，呈现“+”级，偶有“-”和“++”阿莫西林给药后与儿童茶组大鼠的咽部病变恢复情况一致，大部分呈现“+”级，偶有“++”级。
2.2儿童茶对急性咽炎大鼠外周血白细胞计数及其分类的影响
如表7所示。
表7：儿童茶对急性咽炎大鼠白细胞计数及分类的影响
Figure BDA0002689380240000252
Figure BDA0002689380240000253
注：WBC(×109/L)：白细胞；L(％)：淋巴细胞的百分比；N(％)：中性粒细胞的百分比。
与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
表7结果显示：与正常组相比，幼鼠急性咽炎模型组白细胞数目有所升高(P<0.05)，与模型组相比，儿童茶能够抑制白细胞数目的增多，有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组相比，模型组淋巴细胞百分比降低，中性粒细胞百分比升高。
2.3儿童茶对急性咽炎大鼠咽部组织病理形态学的影响
如图2A-图2D所示，正常组大鼠咽部组织结构清晰，黏膜上皮光滑，未见有增厚，固有层散在淋巴组织和腺体，腺体形态正常，黏膜下有少量小血管，无肉芽组织出现，肌层纤维排列紧密。模型组大鼠咽部组织分界不清，黏膜上皮角化、有上皮脱落现象，固有层和黏膜下血管增多、充血，可见大量炎性细胞浸润，腺体壁相比正常组明显增厚，大部分黏液腺上皮细胞坏死，可见大量肉芽组织生长；肌肉层纤维排列疏松。儿童茶给药组大鼠咽部黏膜上皮渐恢复平整，腺体壁恢复到正常水平，黏膜和黏膜下炎性细胞浸润程度明显减少，肌层纤维排列紧密；阿莫西林组大鼠咽部黏膜恢复情况与儿童茶组相似，提示给药后咽部病理情况有所改善。
2.4儿童茶对急性咽炎大鼠外周血炎症因子含量的影响
如下面的表8以及图3、图4和图5所示。
表8四季茶对急性咽炎大鼠外周血炎症因子含量的影响
Figure BDA0002689380240000261
Figure BDA0002689380240000262
Figure BDA0002689380240000271
注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
表8结果显示:急性咽炎模型组幼鼠外周血中炎性因子TNF-a含量显著增高(P<0.01)；儿童茶可显著降低幼鼠血清中IL-1β的含量(P<0.01)。
3小结
儿童茶可改善幼鼠咽部黏膜病变情况，增加幼鼠体重和胸腺重量，提高幼鼠活动能力，抑制急性咽炎幼鼠白细胞数目增多，淋巴细胞百分比降低、中性粒细胞百分比升高，减轻感染后幼鼠咽部组织病理损伤程度，亦可显著降低急性咽炎幼鼠血清中TNF-a、IL-1β含量；表明：儿童茶对金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎幼鼠模型有明显的预防与治疗作用，为急性咽炎临床用药提供实验室依据。
实验例3：儿童茶对LPS诱导的THP-1炎性因子表达的作用研究
本实验考察儿童茶对LPS诱导的人单核细胞THP-1细胞因子TNF-α、IP-10、IkBα、IL-6和IL-1β释放的影响，初步探讨儿童茶的抗炎作用。
1材料与方法
1.1实验仪器
Figure BDA0002689380240000272
Figure BDA0002689380240000281
1.2试剂
Figure BDA0002689380240000282
1.3实验药物
儿童茶处方浸泡提取2次，每次10倍量沸水，浸泡40分钟，过滤，60℃以下，浓缩到糖度15-17Brix,喷雾干燥制得。
1.3.1溶解儿童茶
精密称取儿童茶2.5mg于1ml双蒸水中，得2.5mg/ml的儿童茶标准储备液，采用双蒸水逐级稀释的方式配置其2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的样品溶液
1.3.2溶解LPS
将1mg LPS在21℃以下离心机中快速离心，加入1mL ddH2O充分溶解，用滤器进行过滤后，进行分装，方便实验过程中使用，置于-20℃保存。
1.4细胞培养
1.4.1THP-1细胞传代
本实验中所用THP-1细胞购买自ATCC,为悬浮细胞，所以传代时不需要离心，取20mL含有10％热灭活胎牛血清和1％双抗的RPMI细胞培养液加入到75cm2细胞培养瓶中，再将原25cm2培养瓶中的10mL细胞液加入，放入37℃恒温二氧化碳细胞培养箱继续培养。
1.4.2THP-1细胞冻存
将THP-1细胞在800rmp条件下离心5分钟，弃去上清液。根据实际情况取适量的细胞冻存液使细胞沉淀迅速重悬，按照1mL/管注入冻存管中，将冻存管放入异丙醇冻存盒，-80℃进行梯度降温后，将细胞转移至液氮罐中保存。
1.4.3THP-1细胞复苏
从液氮中取出冻存管，迅速放于37℃水浴中，快速震荡将细胞融化。将细胞移出冻存管，加入4mL培养液，混匀后在800rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用4mL培养液重悬，后加培养液至10mL，加入至25cm2的培养瓶中，放入37℃恒温二氧化碳细胞培养箱培养3-4天，当每毫升的细胞数达到1×106时即可进行传代培养。
1.4.4THP-1细胞计数
取干净的细胞计数板，盖上盖玻片，将10μL分散均匀的细胞悬液从盖玻片与计数板的边沿加入使之充满计数板和盖玻片之间。置倒置显微镜镜下观察，计算四个方格区域内的细胞数，压线细胞只计算左线和上线细胞，成团细胞按单个细胞计算。
按照以下公式计算细胞密度：
细胞数/mL＝(四个方格区域内的细胞数)/4×104×稀释倍数
1.5细胞活力检测
本实验使用CCK-8、LDH试剂盒考察不同浓度的儿童茶对THP-1细胞活力的影响。
取对数生长期的THP-1细胞，以1×106个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，将2.5-0.5μg/ml的儿童茶分别加到细胞培养孔中，每孔1μL，每个浓度6个复孔，同时设置未加入药物的Control组，分别做CCK8和LDH。培养24h后，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作于490nm处测定吸光度(OD值)。另96孔板每孔加入10μL CCK-8液，37℃孵育1h。置酶标仪于450nm处测定吸光度(OD值)。
1.6建立LPS诱导的THP-1细胞炎症模型
THP-1细胞以1×106/mL密度接种于6孔板，24h后分组处理细胞。模型组加入终浓度为100ng/mL的LPS；对照组用双蒸水代替LPS；药物处理组的培养基除加入LPS外，还分别加入终浓度含25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml儿童茶提取物，儿童茶预刺激4h后，再加LPS刺激16h后收集细胞待测。
1.7提取细胞RNA
(1)收集经过处理后的细胞悬液于15mL的离心管中，1000rmp离心3分钟，弃去上清，收集其中的细胞。
(2)向细胞沉淀中加入1ml TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
(3)以每1ml TRIzon Reagent加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。
(4)4℃，12,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase Free离心管(自备)中。
(5)在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。
(6)12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
重复步骤(8)。
(9)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
(10)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μlRNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
(11)使用RNA浓度测定仪测定RNA浓度，取1.5μL的RNA溶液测其浓度，以RNase-Free Water作为空白对照。在RNA浓度测定仪器上分别读取总RNA的浓度(ng/μL)以及OD260/280、OD 260/230的数值。
1.8RNA反转录及实时定量PCR
1.8.1RNA反转录
在冰上进行下列操作，按照表9配制20μL的反应体系，涡旋剧烈震荡，将反应体系混匀后，短暂离心将侧壁的溶液收集到管底，42℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟，结束后样品置于冰上进行冷却。
表9：反转录体系
Figure BDA0002689380240000311
1.8.2实时定量PCR
在冰上按照表10所列的配方用实时定量PCR试剂盒来配制20μL的PCR反应体系。配制好之后进行涡旋，使反应体系充分混合均匀，离心后进行实时定量PCR实验。在本实验中设置实时定量RT-PCR的反应循环条件为：95℃10s、60℃30s、共循环40次。添加熔解曲线：50℃到99℃之间。本实验中涉及到的引物序列见表11。
经检测得Ct值，ΔCt是待测基因Ct值与内参照基因Ct值的差值，分析反应板的数据，获得每个样品每次反应相应的Ct值，计算得到其ΔCt，与对照组相比后，取2-ΔΔCt的数值进行统计。
表10：PCR反应体系
试剂名称 20μL反应体系
2xqPCR Master Mix 10μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
RNase-Free Water 8μL
cDNA产物 1μL
表11：实验相关引物序列
Figure BDA0002689380240000321
1.9统计方法
实验数据使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)评估均值之间的差异，P<0.05时认为具有统计学差异，数据表示为平均值±S.E.M.。
2实验结果
2.1儿童茶对THP-1细胞的无毒剂量的筛选
用CCK-8和LDH法检测儿童茶在25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml时，对THP-1细胞活力的影响。结果显示，5μg/ml、10μg/ml儿童茶组THP-1细胞活力与正常对照组相比无显著性差异。采用药物的安全浓度探讨儿童茶的抗炎作用(图6A-图6B)。
2.2对THP-1细胞TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β分泌的抑制作用
与对照组比较，LPS刺激明显诱导THP-1细胞的TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β的mRNA表达的显著升高；与LPS刺激组比较，10μg/ml的儿童茶可以显著抑制炎性THP-1细胞的TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β的mRNA表达，提示儿童茶可以抑制LPS诱导的细胞因子释放(图7A-图7E)。
3小结
儿童茶可显著抑制LPS诱导THP-1细胞的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，提示有抗炎作用。
实验例4：儿童茶抗氧化/抗炎药效学实验研究
本实验基于ARE和NF-κB的荧光素酶报告基因系统考察儿童茶对ARE、NF-κB活性的影响，初步探讨儿童茶的抗氧化、抗炎作用。
1材料与方法
1.1实验仪器
Figure BDA0002689380240000331
Figure BDA0002689380240000341
1.2试剂
Figure BDA0002689380240000342
1.3受试药物
儿童茶处方浸泡提取2次，每次10倍量沸水，浸泡40分钟，过滤，60℃以下，浓缩到糖度15-17Brix,喷雾干燥制得。
1.4阳性药物
地塞米松，MedChemExpress公司。批号：HY-14648，在有效期内。规格：500mg，用法用量：参照临床用法，配置成10mM母液。
tBHQ((Tertiary butylhydroquinone，特丁基对苯二酚)，MedChemExpress公司。批号：HY-100489，在有效期内。规格：500mg，用法用量：参照临床用法，配置成100mM母液。
1.5试验细胞
293T细胞，购于ATCC细胞库。
1.6感受态细胞DH5a
感受态细胞DH5a购自天根生化科技有限公司
1.7剂量设计和药物配制
儿童茶：0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL。
药液配制：试验前用蒸馏水将药粉配制成100mg/ml浓度的药液，使用时稀释成实验浓度。
1.8质粒提取
1.8.1LB液体培养基的制备
将三角瓶经高温高压灭菌后，向瓶内加入2.5g LB液体培养基干粉，并加入100mL灭菌的超纯水使其溶解完全，瓶口贴上滤膜后，于高温高压下灭菌。待冷却至55℃左右时，加入100mg/mL氨苄西林100μL，混匀即得。细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中，待培养瓶内细胞长至80-90％时进行传代。
1.8.2LB固体培基的制备
取LB固体培养基干粉0.4g，LB液体培养基干粉0.3g于经高温高压灭菌的三角瓶中，加入灭菌超纯水20mL，加热煮沸，搅拌溶解，高压灭菌，待冷却至50-60℃时，加入50μL氨苄西林(50μg/mL)，混匀即得。将上述溶液分装于培养皿中，待冷却凝固后，盖上盖子，倒置，于4℃冰箱中保存。
1.8.3质粒载体的转化与验证
轻微混匀感受态细胞DH5a后取100μL于15mL离心管中，加入1μL质粒pGL4.37样品，置于冰上30min，立刻转入42℃水浴中孵育45s，后转置冰中停留1-2min，完成感受态细胞的转化。吸取上述转化的感受态细胞100μL到适量LB液体培养基中，混匀。用无菌的涂布器取适量上述菌液均匀涂布于LB固体培养基上，于室温放置至菌液完全被吸收。于37℃条件下倒置培养12h。
在生物安全柜中，挑取6个单克隆菌粒，分别加入到6个含有适量LB液体培养基的锥形瓶中得标号1-6的6份菌液样品。将上述样品于37℃恒温，160rpm振荡12h后，各编号样品各取1mL于离心管中，送华大基因测序，鉴定阳性克隆。
1.8.4质粒的提取及测定
(1)向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm，离心1min，尽量吸除上清，菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，彻底悬浮菌体沉淀。
(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分地裂解。
(5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀后，12000rpm离心10min。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(8)重复步骤(7)。
(9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm，离心2min。
(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm，离心2min，取上清于干净的离心管中，即得质粒溶液。
(11)取1μL质粒溶液，以DEPC水作空白对照。在紫外分光光度计上分别读取260nm、280nm波长下的光密度值。
1.9细胞培养
1.9.1 293T细胞复苏
将293T细胞株从液氮罐中取出，立即放入37℃的恒温水浴锅中，轻微晃动，使其快速融化。冻存管经酒精棉擦拭后转入生物安全柜，用移液枪将细胞吸至加入完全培养基的离心管中，1000rpm，4℃，离心3min，弃掉上清液，加入5mL完全培养基，用移液枪吹散均匀后转移到25cm2的培养瓶中。于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。24h后更换培养瓶内的培养液。根据细胞的生长状态进行传代培养。
1.9.2 293T细胞传代
在DMIL倒置相差显微镜下观察细胞，待培养瓶内细胞长至80-90％时进行传代。从培养箱中取出培养瓶，弃掉瓶内培养液，加入2mL PBS缓冲液润洗两次，加入500μL 0.25％的胰酶(含0.25％EDTA)，消化约15s，至细胞大部分凸起变圆，加入1mL完全培养基终止消化。将细胞悬液转入离心管内，1000rpm，4℃，离心3min。弃上清，加入4mL完全培养基轻轻吹打至细胞分散均匀，1:4传至新的培养瓶。
1.9.3 293T细胞计数
取干净的细胞计数板，盖上盖玻片，将10μL分散均匀的细胞悬液从盖玻片与计数板的边沿加入使之充满计数板和盖玻片之间。置倒置显微镜镜下观察，计算四个方格区域内的细胞数，压线细胞只计算左线和上线细胞，成团细胞按单个细胞计算。
按照以下公式计算细胞密度：
细胞数/mL＝(四个方格区域内的细胞数)/4×104×稀释倍数
1.9.4药物溶液的配制
分别精密称取儿童茶2.5于2.5ml水中，得100mg/ml的儿童茶标准储备液，采用DMEM培养基逐级稀释的方式配置其100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的样品溶液。
1.10分组与检测
细胞毒性检测分为空白对照组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL 5个儿童茶浓度组；
抗氧化活性检测分为空白对照组、阳性药tBHQ组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mLμg/mL 5个儿童茶浓度组；
抗炎作用检测分为空白对照组、模型组、阳性药地塞米松组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mLμg/mL 5个儿童茶浓度组。
1.10.1细胞毒性实验
本实验使用CCK-8、LDH试剂盒考察不同浓度的儿童茶对293T细胞活力的影响。
取对数生长期的293T细胞，以2×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，贴壁生长达70％-80％后，将0.01-100μg/mL的儿童茶分别加入不同的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度6个复孔，同时设置未加入药物的Control组，重复3次。培养24h后，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作检测LDH释放量。原96孔板用PBS清洗1次后每孔加入100μL稀释的1×CCK-8工作液，37℃孵育1h。置酶标仪于450nm处测定吸光度(OD值)。
按下列公式，计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％
其中As代表实验孔的吸光度，Ab代表空白孔的吸光度，Ac代表对照孔的吸光度。
1.10.2 293T细胞瞬时共转染及ARE和NFκB活性的测定
1.10.2.1 293T细胞瞬时共转染
取对数生长期的293T细胞，以2×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，待细胞生长密度达到70％-80％时，使用PEI(1mg/mL)转染试剂同时转染ARE、NF-κB荧光素酶报告质粒pGL4.37、pGL4.32(100ng/孔)和海肾荧光素酶报告质粒pGL4.75(10ng/孔)，培养24h。
1.10.2.2双荧光素酶报告系统检测分析测定ARE和NFκB转录活性
培养24h后，转染ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37的细胞，分别加入tBHQ(10μM)、安全浓度的儿童茶各组样品溶液，并设置Control组，培养6h；转染NF-κB荧光素酶报告质粒pGL4.32的细胞，分别加入TNF-α全培稀释的地塞米松(10μM)、安全浓度的儿童茶各组样品溶液，并设置Control、Model组，培养6h。弃上清液，PBS漂洗细胞，裂解后用Dual-Luciferase检测系统检测。每组实验设置6个复孔，重复3次。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值。L/S＝Luciferase活性值/Renilla活性值。
2实验结果
2.1儿童茶对293T细胞毒性的测定
0.01-1μg/ml儿童茶组293T细胞活力与正常对照组相比无显著性差异，为药物对293T细胞安全浓度。采用药物的安全浓度探讨儿童茶的抗氧化、抗炎作用(见图8A-8B)。
2.2儿童茶对ARE报告基因活性的影响
采用293T细胞转染对儿童茶样品溶液进行抗氧化活性验证。结果显示，1μg/ml儿童茶可显著诱导ARE荧光素酶活性(P<0.05)(见表12，图9A)。
表12：不同浓度儿童茶对293T细胞ARE荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)
Figure BDA0002689380240000391
注：***P<0.001vs Control
2.3儿童茶对NF-κB报告基因活性的影响
采用293T细胞转染NF-κB启动子荧光素酶报告质粒，检测儿童茶的抗炎活性。结果显示，0.01μg/mL儿童茶能显著抑制TNF-α诱导的NF-κB启动子的活性(P<0.05，P<0.01)，提示：0.01，0.1和1μg/mL浓度儿童茶均具有较好的抗炎活性(见表13，图9B)。
表13：不同浓度儿童茶对293T细胞NF-κB荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)
Figure BDA0002689380240000392
注：***P<0.001vs Control,###P<0.001vs Model,#P<0.05vs Model
3实验结论
100μg/ml儿童茶具有明显的抗氧化作用，0.01-100μg/ml儿童茶明显抑制TNF-α诱导的NF-κB活性，具有显著抗炎活性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津中医药大学
<120> 一种用于儿童呼吸道疾病的药物组合物
<130> IDC200315
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggtgagaaga gatgtctgaa tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtagggaagt gatgggagag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggcactggca gaaaacaacc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
gcaagtctcc tcattgaatc c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 5
gcacctccac tccatcctga agg 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccattacagg gctcctgagc attg 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccagggacag gtatggagca 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 8
ttcaacacgc aggacaggta cag 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcggtgcttg ttcctcag 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 10
ggctacaggc ttgtcactc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 11
atgattctac ccacggcaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 12
ctggaagatg gtgatgggtt 20

Claims (10)

1.一种药物组合物，包含：
Figure FDA0002689380230000011
优选地，所述药物组合物包含：
Figure FDA0002689380230000012
更优选地，所述药物组合物包含：
Figure FDA0002689380230000013
Figure FDA0002689380230000021
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中的各成分均为中药饮片；
优选地，所述牛蒡子为炒牛蒡子；和/或
优选地，所述薏苡仁为炒薏苡仁。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的药物组合物，其单位剂量为2-10g，优选为3-5g，更优选为3g或4.5g；
优选地，所述药物组合物为茶剂；优选地，其包装为袋泡茶形式。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的药物组合物，其为经粉碎的或经未粉碎的；优选为经粉碎的；优选地，粉碎后的药粉通过1号筛；更优选地，粉碎后的药粉通过1号筛并且不能通过5号筛。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的药物组合物，其含水量为小于12％；优选地，小于或等于10％；更优选地，小于或等于8％。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的药物组合物，其中，按照每g药物组合物计算：
牛蒡苷含量≥4.4mg；
优选地，牛蒡苷含量≥5.5mg；
更优选地，牛蒡苷含量≥7mg或≥7.5mg。
7.一种提取物，其为权利要求1-6中任一权利要求所述的药物组合物的水提取物或者乙醇溶液提取物。
8.权利要求1-6中任一权利要求所述的药物组合物或者权利要求7所述的提取物在制备选自如下的(1)-(5)项中任一项所述的药物中的用途：
(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊的药物；
(2)治疗和/或预防咽炎的药物；优选地，所述咽炎为急性咽炎；优选地，所述咽炎为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)引起的咽炎；
(3)祛痰药物，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者祛痰的药物；
(4)止咳药物，优选地，为用于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者止咳的药物；
(5)抗氧化药物。
9.一种制备权利要求1-6中任一权利要求所述药物组合物的方法，包括如下步骤：
(1)将各药材分别粉碎，过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉；优选地，将1号筛上粉再次粉碎并过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉，与前面得到的粗粉合并；
(2)将得到的粗粉混合均匀；
(3)包装，灭菌。
10.一种对权利要求1至6中任一权利要求所述的药物组合物进行质量控制或者质量检测的方法，包括检测牛蒡苷的含量的步骤，其中，按照每g药物组合物计算，
如果满足：
牛蒡苷含量≥4.4mg，
药物组合物的质量合格；
优选地，通过高效液相色谱法检测牛蒡苷的含量；
优选地，色谱条件如下：
色谱柱为Syncronis-AQ C18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：乙腈(A)和水(B)；
流速：0.8mL·min-1；
波长：230nm；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
梯度洗脱程序：0～10min，14％～18％A；10～18min，18％A；18～22min，18％～19％A；22～42min，19％～31％A；42～50min，31％～55％A。
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