CN111944869B - 一种去氢表雄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去氢表雄酮的制备方法。是以甘薯为原料经如下工艺步骤：原料预处理、甘薯浆液制备、一次发酵、二次发酵、超声浸提、多次超声浸提、纯化与浓缩干燥。本发明制备方法采用二次发酵不仅充分游离富集甘薯中去氢表雄酮，还通过微生物对甘薯原料进行适度分解消化，并充分保留了甘薯中营养功效成分，提升了副产物干薯残渣食用品质、加工品质。所获得的高纯度去氢表雄酮，去氢表雄酮纯度80％以上，且得率超过50mg/100g鲜薯。
Description
技术领域
本发明涉及一种去氢表雄酮的制备方法，尤其涉及一种以甘薯为原料，制备高纯度去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)又名脱氢表雄酮，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式为C19H28O2，分子量为288.42。DHEA是人体血液循环中最为丰富的甾体物质，在人体内由肾上腺组织合成分泌，是多种激素合成的前体物质，会随年龄的增长而逐渐降低。许多医学研究证明，DHEA具有延缓衰老、美容养颜；增强体力，保持青春活力；补充营养，提高睡眠质量，增强记忆力；恢复性能力，增强性欲；强化免疫系统提高免疫能力；防治肥胖、心脏疾病；降低血液中的胆固醇等生理功效。DHEA也是合成许多甾体激素类药物的中间体，如合成甾体抗炎药、避孕药、糖皮质激素类药物等，甾体激素类药物是医学临床上的一类重要药物，对于维持人体健康水平具有重要意义。随着DHEA生理功效不断被证实和发掘，DHEA已广泛应用于临床、医药、保健品等领域。当前，工业上多以化学合成方法制备DHEA，该方法以薯蓣皂甙元、胆固醇以及各种甾醇化合物为合成前体，经取代、缩合等多步化学反应，工艺流程繁复，不易控制，合成产率低，副产物种类多，且多为有毒有害成分，分离、提纯、回收处理较为繁琐，目标产物回收率低，环境污染严重。相比化学合成，从天然产物中提取DHEA是安全、有效的途径。
甘薯又名甜薯、地瓜、番薯、红薯等，是我国主要种植农作物之一，栽培面积和产量均居世界首位。甘薯是目前已知少数几种天然含有DHEA的植物原料之一，在甘薯中DHEA与葡萄糖通过甙键以皂甙形式贮存。前人研究中，有少量以甘薯或薯渣为原料，通过自然预发酵、酸水解、索氏提取等步骤工艺提取DHEA的报道，该方法存在技术参数不易控制、DHEA提取率和得率难以保证、由强酸强碱产生废液污染环境、原料综合利用率低等问题。本发明创新二次发酵的DHEA提取技术工艺，获得以甘薯为原料，高纯度DHEA的制备方法，剩余甘薯残渣可作为原料用于主食、焙烤制品等产品生产中，基本无副产物和废弃物产生。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种去氢表雄酮的制备方法。该方法采用二次发酵技术工艺，充分游离甘薯中去氢表雄酮，并获得了高纯度去氢表雄酮产品，所述去氢表雄酮纯度为80％以上。
为解决上述技术问题，本发明提供一种去氢表雄酮的制备方法。
本发明提供一种去氢表雄酮的制备方法，其以甘薯为原料依次进行如下工艺步骤：原料预处理、甘薯浆液制备、一次发酵、二次发酵、超声浸提、多次超声浸提、纯化与浓缩干燥。
进一步的，上述去氢表雄酮的制备方法，具体包括如下工艺步骤：
(1)原料预处理：新鲜甘薯经分选、整理、清洗、去皮后，切片，经瞬时过热蒸汽处理，取出冷却，备用；
(2)甘薯浆液制备：将步骤(1)处理后甘薯片制成甘薯浆液，备用；
(3)一次发酵：按质量体积比向步骤(2)制得甘薯浆液中添加1-3％脱脂蚕蛹粉、0.2-0.5％葡萄糖，均质，按体积比接种0.5-2％植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理；
(4)二次发酵：步骤(3)一次发酵产物密封包装后于10-20℃，200-800Mpa下处理30-60min，常温下静置1-5h，接种2-8％米曲霉孢子悬浮液，进行二次发酵，得二次发酵产物；
(5)超声浸提：将步骤(4)的二次发酵产物加提取剂，进行超声提取；
(6)纯化与浓缩干燥：将超声提取后上清液，经减压浓缩、减压干燥得固体与溶剂混合，充分混匀后，离心收集上清液，重复上述减压浓缩、干燥、溶剂纯化、离心等步骤2-4次，最终得去氢表雄酮产品。
优选地，所述步骤(1)中所述的甘薯切片厚度为1-2cm，瞬时过热蒸汽处理为：于1.2-1.6Mpa过热蒸汽下处理60-90s。
优选地，所述步骤(2)中：甘薯浆液经斩拌、粉碎至体积平均粒径80-200μm，加入适量清水至其固形物含量达10-15％，再经胶体磨粉碎至体积平均粒径20-40μm，得到甘薯浆液。
优选地，所述步骤(3)中：均质条件为：20000-30000r/min下均质2-5min，均质后过筛，过筛目数为20-80目，然后接种植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理。
优选地，所述步骤(3)中植物乳杆菌悬浮液发酵工艺为：发酵温度10-20℃，发酵时间12-30h。
优选地，所述步骤(3)中植物乳杆菌悬浮液中植物乳杆菌浓度为1-5×109cfu/mL。
优选地，所述步骤(4)中米曲霉包子悬浮液的浓度为1-5×107个/mL。
优选地，所述步骤(4)中所述的二次发酵为：于20-30℃下发酵培养12-60h。
优选地，所述步骤(4)中米曲霉包子悬浮液制作方法为：市售米曲霉孢子粉接种于PDA斜面培养基5-10d后，用生理盐水冲洗斜面至盛有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，并于50-100r/min，10-20℃下，振荡摇匀30-60min，得孢子悬浮液。
优选地，步骤(5)中的超声提取为多次重复超声提取，具体为：
a将步骤(4)中二次发酵产物加提取剂，进行超声提取，静置弃上层水相，余下混合液于离心分别收集上清液与沉淀；
b多次超声浸提：将上述离心收集沉淀与提取剂混合，充分混匀后，进行超声提取，离心，分别收集上清液与残渣；残渣按上述步骤重复提取1-3次，收集上清液；
优选地，所述步骤(5)a中，二次发酵产物与提取剂按体积比1：(0.1-2)混合，于10-20℃，30-60kHz，300-500W下超声提取10-20min。
优选地，所述步骤(5)b中，沉淀按按料液比1：(2-8)g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于10-20℃，30-60kHz，300-500W下超声提取10-20min，离心。
优选地，所述步骤(5)中提取剂由正己烷、乙酸乙酯、正戊烷按(4-8)：(1-3)：(0.5-2)比例混合而成。
优选地，所述步骤(6)中固体按料液比1：(2-5)g/mL与溶剂混合。
优选地，所述步骤(6)中溶剂由正己烷、甲苯、氯仿按(5-9):(0.5-3):(0.5-2)比例混合而成。
本发明的有益效果：
1.本发明以甘薯为原料，充分挖掘利用甘薯中天然功能因子，通过技术工艺对功能因子进行游离富集，提取纯化，获得高纯度去氢表雄酮，丰富了甘薯加工产品种类，提升甘薯加工经济效益，也为药品、保健品行业提供了新的去氢表雄酮原料来源。
2.本发明技术工艺简单，易于操控，易于工业化和产业化生产。
3.本发明副产物少，提取所用有机溶剂可回收再利用，产生的甘薯原料残渣可回收进行食品化利用，无有毒有害物质产生。
4.本发明采用二次发酵不仅充分游离富集甘薯中去氢表雄酮，还通过微生物对甘薯原料进行适度分解消化，并充分保留了甘薯中营养功效成分，提升了副产物干薯残渣食用品质，加工品质。
5.本发明所获得的高纯度去氢表雄酮，去氢表雄酮纯度80％以上，可直接用于保健品生产研发，进一步纯化后可直接作为药品或作为药品生产原料。
6.本发明以新鲜甘薯制备去氢表雄酮，得率超过50mg/100g鲜薯。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的发明内容进行说明，实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)原料预处理：新鲜甘薯经分选、整理、清洗、去皮后，切片至厚度1cm，于1.5Mpa过热蒸汽下处理60s，取出冷却，备用。
(2)甘薯浆液制备：将步骤(1)处理后甘薯片经斩拌、粉碎至体积平均粒径150μm，加入适量清水至其固形物含量达12％，再经胶体磨粉碎至体积平均粒径40μm，得甘薯浆液，备用。
(3)一次发酵：按质量体积比向步骤(2)制得甘薯浆液中添加2％脱脂蚕蛹粉、0.4％葡萄糖，于30000r/min下均质3min，过40目筛后按体积比接种0.5％植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理。所述植物乳杆菌悬浮液发酵工艺为：发酵温度10℃，发酵时间18h，植物乳杆菌悬浮液中植物乳杆菌浓度为1×109cfu/mL。
(4)二次发酵：步骤(3)一次发酵产物密封包装后于20℃，200Mpa下处理30min，常温下静置2h，接种2％米曲霉孢子悬浮液，于20℃下发酵培养25h，得二次发酵产物。所述米曲霉包子悬浮液制作方法为：市售米曲霉孢子粉接种于PDA斜面培养基5d后，用0.9％生理盐水冲洗斜面至盛有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，并于50r/min，10℃下，振荡摇匀30min，得孢子悬浮液，其浓度为1×107个/mL。
(5)超声浸提：步骤(4)中二次发酵产物与提取剂按体积比1：0.5混合，于:10℃，30kHz，300W下超声提取10min，静置10min弃上层水相，余下混合液于3000r/min下离心10min，分别收集上清液与沉淀。
(6)多次超声浸提：步骤(5)中离心收集沉淀按料液比1：2g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于20℃，60kHz，500W下超声提取20min，3000r/min下离心10min，分别收集上清液与残渣；残渣按上述步骤重复提取1次，收集上清液。所述提取剂由正己烷、乙酸乙酯、正戊烷按4：3：2比例混合而成。
(7)纯化与浓缩干燥：合并步骤(5)、(6)中上清液，经减压浓缩、减压干燥得固体按料液比1：2g/mL与溶剂混合，充分混匀后，离心收集上清液，重复上述减压浓缩、干燥、溶剂纯化、离心等步骤4次，最终得去氢表雄酮产品。所述提取剂由正己烷、甲苯、氯仿按5：1：1比例混合而成。
实施例2：一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)原料预处理：新鲜甘薯经分选、整理、清洗、去皮后，切片至厚度1.5cm，于1.6Mpa过热蒸汽下处理90s，取出冷却，备用。
(2)甘薯浆液制备：将步骤(1)处理后甘薯片经斩拌、粉碎至体积平均粒径120μm，加入适量清水至其固形物含量达15％，再经胶体磨粉碎至体积平均粒径20μm，得甘薯浆液，备用。
(3)一次发酵：按质量体积比向步骤(2)制得甘薯浆液中添加3％脱脂蚕蛹粉、0.5％葡萄糖，于25000r/min下均质2min，过30目筛后按体积比接种1.5％植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理。所述植物乳杆菌悬浮液发酵工艺为：发酵温度15℃，发酵时间25h，植物乳杆菌悬浮液中植物乳杆菌浓度为2×109cfu/mL。
(4)二次发酵：步骤(3)一次发酵产物密封包装后于18℃，600Mpa下处理45min，常温下静置5h，接种6％米曲霉孢子悬浮液，于25℃下发酵培养45h，得二次发酵产物。所述米曲霉包子悬浮液制作方法为：市售米曲霉孢子粉接种于PDA斜面培养基8d后，用0.9％生理盐水冲洗斜面至盛有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，并于80r/min，15℃下，振荡摇匀45min，得孢子悬浮液，其浓度为3×107个/mL。
(5)超声浸提：步骤(4)中二次发酵产物与提取剂按体积比1:1混合，于15℃，45kHz，500W下超声提取15min，静置10min弃上层水相，余下混合液于3000r/min下离心10min，分别收集上清液与沉淀；
(6)多次超声浸提：步骤(5)中离心收集沉淀按料液比1：8g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于18℃，30kHz，300W下超声提取18min，3000r/min下离心10min，分别收集上清液与残渣；残渣按上述步骤重复提取3次，收集上清液。所述提取剂由正己烷、乙酸乙酯、正戊烷按5：2：1比例混合而成。
(7)纯化与浓缩干燥：合并步骤(5)、(6)中上清液，经减压浓缩、减压干燥得固体按料液比1：4g/mL与溶剂混合，充分混匀后，离心收集上清液，重复上述减压浓缩、干燥、溶剂纯化、离心等步骤3次，最终得去氢表雄酮产品。所述提取剂由正己烷、甲苯、氯仿按9:0.5:0.5比例混合而成。
实施例3：一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)原料预处理：新鲜甘薯经分选、整理、清洗、去皮后，切片至厚度2cm，于1.4Mpa过热蒸汽下处理80s，取出冷却，备用。
(2)甘薯浆液制备：将步骤(1)处理后甘薯片经斩拌、粉碎至体积平均粒径100μm，加入适量清水至其固形物含量达10％，再经胶体磨粉碎至体积平均粒径30μm，得甘薯浆液，备用。
(3)一次发酵：按质量体积比向步骤(2)制得甘薯浆液中添加1％脱脂蚕蛹粉、0.3％葡萄糖，于20000r/min下均质4min，过50目筛后按体积比接种2％植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理。所述植物乳杆菌悬浮液发酵工艺为：发酵温度20℃，发酵时间20h，植物乳杆菌悬浮液中植物乳杆菌浓度为3×109cfu/mL。
(4)二次发酵：步骤(3)一次发酵产物密封包装后于12℃，400Mpa下处理50min，常温下静置1h，接种5％米曲霉孢子悬浮液，于30℃下发酵培养60h，得二次发酵产物。所述米曲霉包子悬浮液制作方法为：市售米曲霉孢子粉接种于PDA斜面培养基10d后，用0.9％生理盐水冲洗斜面至盛有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，并于100r/min，20℃下，振荡摇匀60min，得孢子悬浮液，其浓度为5×107个/mL。
(5)超声浸提：步骤(4)中二次发酵产物与提取剂按体积比1:1.5混合，于20℃，60kHz，400W下超声提取20min，静置10min弃上层水相，余下混合液于3000r/min下离心10min，分别收集上清液与沉淀；
(6)多次超声浸提：步骤(5)中离心收集沉淀按料液比1：6g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于12℃，45kHz，400W下超声提取12min，3000r/min下离心10min，分别收集上清液与残渣；残渣按上述步骤重复提取2次，收集上清液。所述提取剂由正己烷、乙酸乙酯、正戊烷按7：1：0.5比例混合而成。
(7)纯化与浓缩干燥：合并步骤(5)、(6)中上清液，经减压浓缩、减压干燥得固体按料液比1：3g/mL与溶剂混合，充分混匀后，离心收集上清液，重复上述减压浓缩、干燥、溶剂纯化、离心等步骤4次，最终得去氢表雄酮产品。所述提取剂由正己烷、甲苯、氯仿按7:1.5:1.5比例混合而成。
对比例1：未经植物乳杆菌发酵处理外，其他步骤和参数与实施例1相同。
对比例2：未经米曲霉发酵处理外，其他步骤和参数与实施例2相同。
对比例3：采用以下酶解工艺代替步骤(4)，其他步骤和参数与实施例3相同。
第一次发酵产物于沸水浴中水浴处理10min后，冷却至室温后用HCl溶液调节pH至5，并加入α-淀粉酶，α-淀粉酶的酶解条件：温度60℃，酶添加量3.0g/100mL，时间45min。
对比例4：采用水浴振荡提取代替步骤(5)、(6)，其他步骤和参数与实施例3相同。
二次发酵产物与提取剂按体积比1:1.5混合，于20℃，80r/min下振荡提取60min，静置10min弃上层水相，余下混合液于3000r/min下离心10min，分别收集上清液与沉淀。沉淀按料液比1:5g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于20℃下，80r/min振荡提取30min，提取液于3000r/min下离心10min，分别收集上清液与残渣，残渣上述步骤重复提取2次，收集并合并上清液。
对上述实施例1-3和对比例1-4制得的去氢表雄酮的得率、纯度(高效液相方法测定)进行测定，其结果如下表所示：
去氢表雄酮得率＝去氢表雄酮产品重量÷鲜薯原料重量×100％；
去氢表雄酮纯度＝去氢表雄酮产品中去氢表雄酮重量÷去氢表雄酮产品重量×100％。
通过实施例1-3与对比例1-4的结果分析，不难看出，本发明在将原料预处理、甘薯浆液制备、一次发酵、二次发酵、超声浸提、超声多次浸提、纯化与浓缩干燥等技术手段进行有序组合和反复改进、优化后，所得去氢表雄酮得率显著提升，100g鲜薯原料，去氢表雄酮得率可达50mg以上，且去氢表雄酮产品纯度明显提升，纯度达80％以上。这一技术进步通过天然产物提取技术，从甘薯中获得高纯度去氢表雄酮产品，提升甘薯加工经济效益，为药品、保健品等行业提供了安全、丰富的去氢表雄酮原料，也为其他来源的去氢表雄酮的提取和工艺改进提供了很好的借鉴作用。
本领域的技术人员应当明了，上述优选实施例只是对本发明的具体说明，并不构成对本发明的限制。根据需要可以对其进行多种改进、组合、亚组合以及变换，所有的改进、组合、亚组合、变换以及等效替换都落入在所附的权利要求的范围内。
Claims (2)
1.一种以甘薯为原料制备得率超过50mg/100g鲜薯的去氢表雄酮的方法，其特征在于，具体包括如下工艺步骤：
(1)原料预处理：新鲜甘薯经分选、整理、清洗、去皮后，切片，经瞬时过热蒸汽处理，取出冷却，备用；
(2)甘薯浆液制备：将步骤(1)处理后甘薯片制成甘薯浆液，备用；
(3)一次发酵：按质量体积比向步骤(2)制得甘薯浆液中添加1-3％脱脂蚕蛹粉、0.2-0.5％葡萄糖，均质，按体积比接种0.5-2％植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理；
(4)二次发酵：步骤(3)一次发酵产物密封包装后于10-20℃，200-800Mpa下处理30-60min，常温下静置1-5h，接种2-8％米曲霉孢子悬浮液，进行二次发酵，得二次发酵产物；
(5)超声浸提：将步骤(4)的二次发酵产物加提取剂，进行超声提取；
(6)纯化与浓缩干燥：将超声提取后上清液，经减压浓缩、减压干燥得固体与溶剂混合，充分混匀后，离心收集上清液，重复以上减压浓缩、干燥、溶剂纯化、离心等步骤2-4次，最终得去氢表雄酮产品；
其中，
所述步骤(1)中所述的甘薯切片厚度为1-2cm，瞬时过热蒸汽处理为：于1.2-1.6Mpa过热蒸汽下处理60-90s；
所述步骤(2)中甘薯浆液经斩拌、粉碎至体积平均粒径80-200μm，加入适量清水至其固形物含量达10-15％，再经胶体磨粉碎至体积平均粒径20-40μm，得到甘薯浆液；
所述步骤(3)中均质条件为：20000-30000r/min下均质2-5min，均质后过筛，过筛目数为20-80目，然后接种植物乳杆菌悬浮液，进行发酵处理；所述步骤(3)中植物乳杆菌悬浮液发酵工艺为：发酵温度10-20℃，发酵时间12-30h；所述步骤(3)中植物乳杆菌悬浮液中植物乳杆菌浓度为1-5×109cfu/mL；
所述步骤(4)中米曲霉孢子悬浮液的浓度为1-5×107个/mL，所述二次发酵为：于20-30℃下发酵培养12-60h；
所述步骤(5)中超声浸提为多次重复超声提取，具体为：a将步骤(4)中二次发酵产物加提取剂，进行超声提取，静置弃上层水相，余下混合液于离心分别收集上清液与沉淀；b多次超声浸提：将上述离心收集沉淀与提取剂混合，充分混匀后，进行超声提取，离心，分别收集上清液与残渣；残渣按上述步骤重复提取1-3次，收集上清液；所述步骤(5)a中，二次发酵产物与提取剂按体积比1：(0.1-2)混合，于10-20℃，30-60kHz，300-500W下超声提取10-20min；所述步骤(5)b中，沉淀按料液比1：(2-8)g/mL与提取剂混合，充分混匀后，于10-20℃，30-60kHz，300-500W下超声提取10-20min，离心；所述步骤(5)中提取剂由正己烷、乙酸乙酯、正戊烷按(4-8)：(1-3)：(0.5-2)比例混合而成；
所述步骤(6)中减压浓缩、减压干燥固体按料液比1：(2-5)g/mL与溶剂混合，所述步骤(6)中溶剂由正己烷、甲苯、氯仿按(5-9):(0.5-3):(0.5-2)比例混合而成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中米曲霉孢子悬浮液制作方法为：市售米曲霉孢子粉接种于PDA斜面培养基5-10d后，用生理盐水冲洗斜面至盛有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，并于50-100r/min，10-20℃下，振荡摇匀30-60min，得孢子悬浮液。
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