CN106086150A - 一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法 - Google Patents

一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，先利用超微粉碎技术将黄姜粉碎成细颗粒，再通过中空纤维膜截留得到皂苷溶液，利用单酶水解或混合酶水解，初步将50‑70％的皂苷转化为皂素；接下来加入黄芪提取液、低聚异麦芽糖和金银花药液等可以促进益生菌生长的物质，接入一定量植物乳杆菌，利用生物转化对酶解未完全转化的皂苷进行二次转化，最终将70‑85％的皂苷转化为皂素；本过程采用酶结合微生物转化的方法，通过二次转化，提高了黄姜的利用率，降低了原材料成本，同时避免使用酸水解，较少了酸带来的污染，降低了废水中BOD和COD含量，属于环境友好型生产技术。

Description

一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法
技术领域
本发明涉及黄姜皂素生产技术领域，具体为一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法。
背景技术
黄姜皂素(Diosgenin)，又称薯蓣皂苷元，是300多种甾体激素类药物的基础原材料，有“药用黄金”的美称。黄姜皂素是从黄姜的根茎中提取出来的。黄姜又名盾叶薯蓣，是世界上薯蓣皂苷(元)含量最高的物种，也是目前最好的激素类药源植物。
目前工业生产中，常采用酸水解法发进行皂素的提取，该方法虽然便于操作，易于大规模生产，但是酸水解带来废水中较高的BOD和COD，对环境的带来很大的威胁，不符合当下环境友好型生产的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用清洁的生产方法替代污染较大的传统酸水解法的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)采用超微粉碎机将黄姜磨成粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液离心得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为5-7％的混合液，按每100ml混合液中加入0.5-2.0g的固定化果胶酶、固定化纤维素酶、固定化半纤维素酶中的一种或一种以上的混合物，调整pH为4-5后，于40-50℃下进行初步降解6-7h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.01-0.05mg黄芪提取液、1-3g金银花药液、1-3g低聚异麦芽糖、0.5-1g(NH4)2SO4、0.005-0.010ml吐温80及0.1-0.3g醋酸钠得到发酵培养基，将培养基pH调整至6.0-7.0，灭菌冷却后按发酵培养基3％-9％的接种量接入植物乳杆菌，在33-40℃下发酵培养12-36h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
3)将发酵结束后的发酵液调pH至6.0-7.0，离心得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取1-3h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
所述步骤1)超微粉碎机采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末。
所述步骤2)中悬浮液离心转速为3000-5000r/min，离心时间为10-15min。
所述步骤2)中过滤采用改性聚砜中空纤维膜来实现，其中膜外径为450-600μm，截留相对分子量为3000-10000，水通量为80-100L/h/㎡。
所述步骤2)固定化果胶酶制备采用明胶法即配制质量浓度为10-20％的明胶作为载体，再向10mL载体中加入1-3mL质量浓度为3-10％的戊二醛作为交联剂和载体质量3-10％的果胶酶混合，凝固后置于4℃保温5h得到固定化果胶酶。
所述步骤2)固定化纤维素酶的制备：将1-2g脱乙酰度为80-90％的球状壳聚糖溶解到30-60mL质量浓度为1-3％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1-3％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取8.0-10.0g的壳聚糖载体向其中加入1-3mL质量浓度为3-5％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量15-25％的纤维素酶液得到固定化纤维素酶。
所述步骤2)固定化半纤维素酶的制备：将1-2g脱乙酰度为80-90％的球状壳聚糖溶解到30-60mL质量浓度为1-3％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1-3％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取6.0-8.0g的壳聚糖载体向其中加入1-3mL质量浓度为4-6％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量10-15％的半纤维素酶液得到固定化半纤维素酶。
所述步骤2)黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量3-5倍的水浸泡，煮沸后用文火持续10-30min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在3000-5000r/min离心10-15min，取上清，于121℃灭菌得到。
所述步骤2)金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡0.5-1h，煎煮30-50min后过滤2-3次，将滤液合并后再煎煮1-3次，混匀调药液pH至6.0-7.0，于121℃灭菌得到。
所述步骤2)中混合液和培养基pH的调节，均使用0.5-1.5mol/L的NaOH溶液；
所述步骤3)中发酵结束后，发酵液pH的调节使用0.75-1.0mol/L的NaOH溶液；离心条件为转速5000-7000r/min，离心时间10-15min；沉淀物烘干条件为50-80℃。
与现有技术相比，本技术具有以下优势：
先利用超微粉碎技术将黄姜粉碎成细颗粒，再通过中空纤维膜截留得到皂苷溶液，利用单酶水解或混合酶水解解，初步将50-70％的皂苷转化为皂素；接下来加入黄芪提取液、低聚异麦芽糖和金银花药液等可以促进益生菌生长的物质，接入一定量植物乳杆菌，利用生物转化对酶解未完全转化的皂苷进行二次转化，最终将70-85％的皂苷转化为皂素。本过程采用酶结合微生物转化的方法，通过二次转化，提高了黄姜的利用率，降低了原材料成本，同时避免使用酸水解，较少了酸带来的污染，降低了废水中BOD和COD含量，属于环境友好型生产技术。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
1)采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液在转速为3000r/min离心15min得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为5％的混合液，按每100ml混合液中加入1.5g的固定化果胶酶，采用1mol/L的NaOH溶液调整pH为4后，于45℃下进行初步降解6.5h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.01mg黄芪提取液、2g金银花药液、1g低聚异麦芽糖、0.5g(NH4)2SO4、0.005ml吐温80及0.1g醋酸钠得到发酵培养基，采用0.5mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至6.0，灭菌冷却后按发酵培养基6％的接种量接入植物乳杆菌，在33℃下发酵培养36h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
其中中空纤维过虑膜采用改性聚砜中空纤维过虑膜，膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡；
固定化果胶酶制备采用明胶法即配制质量浓度为10％的明胶作为载体，再向10mL载体中加入1mL质量浓度5％的戊二醛作为交联剂和载体质量6％的果胶酶混合，凝固后置于4℃保温5h得到固定化果胶酶；
黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量3倍的水浸泡，煮沸后用文火持续10min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在3000r/min离心15min，取上清，于121℃灭菌得到；
金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡0.5h，煎煮30min后过滤2次，将滤液合并后再煎煮1次，混匀调药液pH至6.0，于121℃灭菌得到。
3)采用0.75mol/L的NaOH溶液调节发酵液的pH至6.0，在转速为5000r/min离心15min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀在50℃烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取1h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
实施例2：
1)采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液在转速为4000r/min离心12min得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为7％的混合液，按每100ml混合液中加入1g的固定化纤维素酶，采用0.5mol/L的NaOH溶液调整pH为4.5后，于40℃下进行初步降解7h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.03mg黄芪提取液、1g金银花药液、3g低聚异麦芽糖、1g(NH4)2SO4、0.01ml吐温80及0.2g醋酸钠得到发酵培养基，采用1mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至6.5，灭菌冷却后按发酵培养基3％的接种量接入植物乳杆菌，在36℃下发酵培养24h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
其中中空纤维过虑膜采用改性聚砜中空纤维过虑膜，膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡；
固定化纤维素酶的制备：将1g脱乙酰度为80％的球状壳聚糖溶解到30mL质量浓度为1％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为2％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取9.0g的壳聚糖载体向其中加入1mL质量浓度5％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量20％的纤维素酶液得到固定化纤维素酶。
黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量4倍的水浸泡，煮沸后用文火持续20min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在4000r/min离心13min，取上清，于121℃灭菌得到；
金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡1h，煎煮40min后过滤3次，将滤液合并后再煎煮2次，混匀调药液pH至6.5，于121℃灭菌得到；
3)采用0.8mol/L的NaOH溶液调节发酵液的pH至6.5，在转速为7000r/min离心10min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀在70℃烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取2h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
实施例3：
1)采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液在转速为4600r/min离心11min得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为6％的混合液，按每100ml混合液中加入0.5g的固定化半纤维素酶，采用0.8mol/L的NaOH溶液调整pH为5后，于42℃下进行初步降解7h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.05mg黄芪提取液、1.5g金银花药液、2g低聚异麦芽糖、0.8g(NH4)2SO4、0.006ml吐温80及0.15g醋酸钠得到发酵培养基，采用1.5mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至7.0，灭菌冷却后按发酵培养基9％的接种量接入植物乳杆菌，在40℃下发酵培养12h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
其中中空纤维过虑膜采用改性聚砜中空纤维过虑膜，膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡；
固定化半纤维素酶的制备：将1.3g脱乙酰度为83％的球状壳聚糖溶解到40mL质量浓度为2.5％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1.5％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取6.0g的壳聚糖载体向其中加入1mL质量浓度6％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量10％的半纤维素酶液得到固定化半纤维素酶；
黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量5倍的水浸泡，煮沸后用文火持续30min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在5000r/min离心10min，取上清，于121℃灭菌得到；
金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡1h，煎煮50min后过滤3次，将滤液合并后再煎煮3次，混匀调药液pH至7.0，于121℃灭菌得到。
3)采用1.0mol/L的NaOH溶液调节发酵液的pH至7.0，在转速为6000r/min离心13min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀在80℃烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取3h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
实施例4：
1)采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液在转速为5000r/min离心10min得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为5.5％的混合液，按每100ml混合液中加入2.0g的固定化果胶酶与固定化纤维素酶的混合物，采用1.2mol/L的NaOH溶液调整pH为4.2后，于50℃下进行初步降解6h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.02mg黄芪提取液、3g金银花药液、1.5g低聚异麦芽糖、0.6g(NH4)2SO4、0.008ml吐温80及0.25g醋酸钠得到发酵培养基，采用0.8mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至6.0，灭菌冷却后按发酵培养基5％的接种量接入植物乳杆菌，在38℃下发酵培养18h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
其中中空纤维过虑膜采用改性聚砜中空纤维过虑膜，膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡；
固定化果胶酶制备采用明胶法即配制质量浓度为15％的明胶作为载体，再向10mL载体中加入3mL质量浓度3％的戊二醛作为交联剂和载体质量3％的果胶酶混合，凝固后置于4℃保温5h得到固定化果胶酶；
固定化纤维素酶的制备：将1.5g脱乙酰度为85％的球状壳聚糖溶解到45mL质量浓度为2％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取8.0g的壳聚糖载体向其中加入2mL质量浓度4％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量15％的纤维素酶液得到固定化纤维素酶；
黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量3.5倍的水浸泡，煮沸后用文火持续25min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在3500r/min离心14min，取上清，于121℃灭菌得到；
金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡0.8h，煎煮45min后过滤2次，将滤液合并后再煎煮3次，混匀调药液pH至6.0，于121℃灭菌得到。
3)采用0.9mol/L的NaOH溶液调节发酵液的pH至6.0，在转速为5500r/min离心14min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀在60℃烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取1h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
实施例5：
1)采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液在转速为3800r/min离心14min得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为6.5％的混合液，按每100ml混合液中加入1.8g的固定化果胶酶、固定化纤维素酶和固定化半纤维素酶的混合物，采用1.5mol/L的NaOH溶液调整pH为4.8后，于48℃下进行初步降解6h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.04mg黄芪提取液、2.5g金银花药液、2.5g低聚异麦芽糖、0.9g(NH4)2SO4、0.009ml吐温80及0.3g醋酸钠得到发酵培养基，采用1.2mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至7.0，灭菌冷却后按发酵培养基8％的接种量接入植物乳杆菌，在34℃下发酵培养30h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
其中中空纤维过虑膜采用改性聚砜中空纤维过虑膜，膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡；
固定化果胶酶制备采用明胶法即制质量浓度为20％的明胶作为载体，再向10mL载体中加入2mL质量浓度10％的戊二醛作为交联剂和载体质量10％的果胶酶混合，凝固后置于4℃保温5h得到固定化果胶酶；
固定化纤维素酶的制备：将2g脱乙酰度为90％的球状壳聚糖溶解到60mL质量浓度为3％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为3％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取10.0g的壳聚糖载体向其中加入3mL质量浓度3％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量25％的纤维素酶液得到固定化纤维素酶；
固定化半纤维素酶的制备：将1.8g脱乙酰度为88％的球状壳聚糖溶解到50mL质量浓度为1.5％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为2.5％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取8.0g的壳聚糖载体向其中加入3mL质量浓度4％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量15％的半纤维素酶液得到固定化半纤维素酶；
黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量4.5倍的水浸泡，煮沸后用文火持续15min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在4500r/min离心12min，取上清，于121℃灭菌得到；
金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡0.5h，煎煮35min后过滤2次，将滤液合并后再煎煮2次，混匀调药液pH至7.0，于121℃灭菌得到；
3)采用0.85mol/L的NaOH溶液调节发酵液的pH至7.0，在转速为6500r/min离心12min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀在70℃烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取3h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。

Claims (10)

1.一种利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：
1)采用超微粉碎机将黄姜磨成粉末，然后将黄姜粉末加入足量的水中，静置，待产生沉淀分层，即上清液，悬浊液和沉淀共三层；倒出上清液，将悬浊液和沉淀进行振荡混匀，得到悬浮液；
2)将悬浮液离心得到悬浮液清液和沉淀层，利用中空纤维超滤膜对悬浮液清液进行过滤，得到黄姜皂苷保留液；将保留液与悬浮液沉淀混合，并调整得到固形物含量为5-7％的混合液，按每100ml混合液中加入0.5-2.0g的固定化果胶酶、固定化纤维素酶、固定化半纤维素酶中的一种或一种以上的混合物，调整pH为4-5后，于40-50℃下进行初步降解6-7h，向初步降解后的混合液中分别按照每100ml加入0.01-0.05mg黄芪提取液、1-3g金银花药液、1-3g低聚异麦芽糖、0.5-1g(NH4)2SO4、0.005-0.010ml吐温80及0.1-0.3g醋酸钠得到发酵培养基，将培养基pH调整至6.0-7.0，灭菌冷却后按发酵培养基3％-9％的接种量接入植物乳杆菌，在33-40℃下发酵培养12-36h进行生物转化，将黄姜皂苷转化为黄姜皂素得发酵液；
3)将发酵结束后的发酵液调pH至6.0-7.0，离心得到上清液和沉淀，倒掉上清液，将沉淀烘干至固形物，再将固形物置于索氏抽提仪中，以60-90沸程石油醚为萃取剂进行索氏提取1-3h，再通过浓缩结晶得到黄姜皂素。
2.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤1)超微粉碎机采用HMB-715型重压研磨式超微粉碎机，对初始颗粒度为10-20目的黄姜粉末进行粉碎制成1000-1500目的黄姜粉末。
3.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)中悬浮液离心转速为3000-5000r/min，离心时间为10-15min；
所述步骤2)中过滤采用改性聚砜中空纤维膜来实现，其中膜外径为450～600μm，截留相对分子量为3000～10000，水通量为80～100L/h/㎡。
4.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)固定化果胶酶制备采用明胶法即配制质量浓度为10-20％的明胶作为载体，再向10mL载体中加入1-3mL质量浓度为3-10％的戊二醛作为交联剂和载体质量3-10％的果胶酶混合，凝固后置于4℃保温5h得到固定化果胶酶。
5.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)固定化纤维素酶的制备：将1-2g脱乙酰度为80-90％的球状壳聚糖溶解到30-60mL质量浓度为1-3％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1-3％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取8.0-10.0g的壳聚糖载体，向其中加入1-3mL质量浓度为3-5％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量15-25％的纤维素酶液得到固定化纤维素酶。
6.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)固定化半纤维素酶的制备：将1-2g脱乙酰度为80-90％的球状壳聚糖溶解到30-60mL质量浓度为1-3％的乙酸溶液中得壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液注入到过量的质量浓度为1-3％三聚磷酸钠溶液中静置后冲洗多余的三聚磷酸钠制得壳聚糖载体，取6.0-8.0g的壳聚糖载体向其中加入1-3mL质量浓度为4-6％，pH＝10.0的戊二醛和载体质量10-15％的半纤维素酶液得到固定化半纤维素酶。
7.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)黄芪提取液的制备方法为：向烘干后的黄芪粉中加入其质量3-5倍的水浸泡，煮沸后用文火持续10-30min，经过两次过滤，合并滤液加热浓缩，将浓缩液在3000-5000r/min离心10-15min，取上清，于121℃灭菌得到。
8.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)金银花药液的制备方法如下：将金银花加入足量水中浸泡0.5-1h，煎煮30-50min后过滤2-3次，将滤液合并后再煎煮1-3次，混匀调药液pH至6.0-7.0，于121℃灭菌得到。
9.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤2)中混合液和培养基pH的调节，均使用0.5-1.5mol/L的NaOH溶液。
10.根据权利要求1所述的利用酶结合微生物转化生产黄姜皂素的方法，其特征在于：所述步骤3)中发酵结束后，发酵液pH的调节使用0.75-1.0mol/L的NaOH溶液；离心条件为转速5000-7000r/min，离心时间10-15min；沉淀物烘干条件为50-80℃。
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