CN111944027A - mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用”。本发明鉴定了一个新的参与母细胞裂解的苏云金芽胞杆菌基因mclX，mclX基因缺失可完全阻断母细胞裂解，并且不影响芽胞形成和Cry1Ac蛋白的产量，GFP定位在细胞质中。mclX的缺失影响母细胞裂解关键水解酶CwlC的转录和蛋白形成。本发明表明MclX是母细胞裂解途径的关键因子，其编码基因的缺失可实现细胞壁对杀虫晶体的包裹，对于构建高持效性的苏云金芽胞杆菌工程菌有重要帮助，具有较大的应用前景。

Description

mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性菌属蜡样芽胞杆菌家族(B.cereus group)。(Bacillus cereus group，Bc)(Vilas-Boas GT,Peruca AP,Arantes OM(2007)Biology and taxonomy of Bacillus cereus,Bacillus anthracis,and Bacillus thuringiensis.Can J Microbiol 53(6):673-687doi:10.1139/W07-029)。Bt最显著的特征是其在形成芽胞的过程中会在同一母细胞中产生一个或多个伴胞晶体(Vilas-Boas G T, Peruca A P,Arantes O M.Biology and taxonomy of Bacilluscereus,Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis[J].Can J Microbiol.,2007,53(6):673-687.)。伴胞晶体主要由具潜在杀虫活性的杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystal Proteins，ICPs,又称 delta内毒素)Cry和Cyt蛋白组成(Bravo A,Likitvivatanavong S,Gill S S,et al.Bacillus thuringiensis:A story of asuccessful bioinsecticide[J].Insect Biochem Mol Biol., 2011,41(7):423-431；Vilas-Boas G T,Peruca A P,Arantes O M.Biology and taxonomy of Bacilluscereus,Bacillus anthracis,and Bacillus thuringiensis[J].Can J Microbiol.,2007,53(6):673-687.)Bt制剂杀虫谱广、对人畜无害、不污染环境，是世界上应用最广、产量最大的生物杀虫剂。但是，与传统的化学农药相比，Bt制剂在田间应用稳定性差、持效期短、杀虫效率相对较低，成为制约其进一步推广应用的瓶颈(Talkhan F.N., Abo-AssyH.H.,Azzam M.M.,Abdel-Razek A.S.Activity of delta-endotoxin protein crystalsin Bacillus thuringiensis mutants when influenced by UV treatments.Archivesof Phytopathology and Plant Protection,2013,46(11):1346-1358.)。复杂的田间环境密切影响Bt制剂的应用，如温度、雨水、阳光辐射等均影响Bt制剂的应用稳定性，尤其是阳光中的紫外辐射(Ultraviolet,简称UV)被认为是最关键的影响因素(Morlot C., UeharaT.,Marquis K.A.,Bernhardt T.G.,Rudner D.Z.A highly coordinated cell walldegradation machine governs spore morphogenesis in Bacillus subtilis.GenesDev, 2010,24(4):411-422.)。Bt制剂中发挥杀虫活性的主要有效成分为杀虫晶体蛋白，当其暴露在阳光中的紫外辐射下时，氨基酸被氧化、色氨酸与组氨酸残基被破坏、以及产生自由基等，造成了晶体蛋白的失活，从而丧失杀虫活性(Pozsgay M.,Fast P.,Kaplan H.,Carey P.R.The effect of sunlight on the protein crystals from Bacillusthuringiensis var. kurstaki HD1 and NRD12:a Raman spectroscopic study.Journalof Invertebr Pathol, 1987,50(3):246-253.)。σ^k缺失可以阻止母细胞裂解，但是Cry蛋白产量会受影响，过量表达Cry1Ba不影响其杀虫活性，晶体在母细胞的包裹下有效降低了对紫外线的敏感度(Bravo A,Agaisse H,Salamitou S and Lereclus D.1996.Analysisof crylAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis.MolGenet Genomics.250:734-741；Zhou CM,Peng Q,Du LX,Shu CL,Zhang J,SongFP.2014.Screening of cry-type promoters with strong activity and applicationin Cry protein encapsulation in a sigK mutant[J]. Appl MicrobiolBiotechnol.98:7901–7909.)，证明可以通过构建细胞壁不裂解菌株，避免晶体蛋白失活。

在许多细菌中，细胞的形状是由细胞壁决定的，细胞壁抵抗内部的膨胀压力，由两层或三层肽聚糖组成，肽聚糖是一种网状结构，主要是由肽聚糖的聚合物形成，由N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基肟酸交替组成的糖链组成，糖链由连接在N-乙酰氨基肟酸上的短茎肽交联而成。除此之外，磷脂和脂磷壁酸以及其他大分子组分如多糖，聚谷氨酸或蛋白质也是其主要成分(Uehara T,Parzych K R,Dinh T,et al.Daughter cell separation iscontrolled by cytokinetic ring-activated cell wall hydrolysis[J].EMBOJOURNAL,2010, 29(8):1412-1422.)。根据肽聚糖水解酶作用于细胞壁肽聚糖内共价键的位点将其分为三类，分别为糖苷酶、酰胺酶和肽酶。糖苷酶包括水解N-乙酰葡糖胺酶、溶菌酶和裂解糖基转移酶 (Vollmer W,Joris B,Charlier P,Foster S.Bacterialpeptidoglycan (murein)hydrolases[J].FEMS Microbiology Reviews,2008c,32(2):259-286)，它们主要负责水解糖链中Glc NAc和Mur NAc之间的β-1,4糖苷键；酰胺酶一般由N-端催化结构域(catalytic domain)和C-端细胞壁结合结构域(cell wall bindingdomain)组成 (Mehta KK,et al.Characterization of Ami BA2446,a novelbacteriolytic enzyme active against Bacillus species[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013a,79(19) 5899-5906)，主要负责胞壁酸和连接肽N-末端的L-丙氨酸之间酰胺键的水解(Young R. Bacteriophage lysis:mechanism and regulation[J].Microbiological Reviews,1992, 56(3):430-481)；肽酶可分为羧肽酶和内肽酶，其中水解移除短肽链C-末端氨基酸的酶为羧肽酶，水解短肽链内部氨基酸之间酰胺键的酶为内肽酶。DD-肽酶剪切两个氨基酸之间的肽键，LD-肽酶水解L-和D-氨基酸(或L-和D-氨基酸)之间的肽键(Shockman GD,

JV.Chapter 7 Microbial peptidoglycan(murein)hydrolases[J].New Comprehensive Biochemistry,1994,27:131-166；Smith TJ,Blackman SA,Foster SJ.Autolysins of Bacillus subtilis:multiple enzymes withmultiple functions[J].Microbiology,2000,146(2):249-262.)。肽聚糖水解酶可参与细胞壁生长的调控，肽聚糖的翻转，子细胞的分裂、细胞自溶或在芽胞形成和萌发的过程中专一的切割肽聚糖。

在Bs中，主要的细胞壁水解酶是CwlB(也称为LytC)，CwlC和CwlH。CwlB是在对数生长末期产生的营养期主要水解酶，它也出现在芽胞期(Foster SJ.1992.Analysis of theautolysins of Bacillus subtilis 168during vegetative growth anddifferentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis.JBacteriol174:464–470.， Herbold DR,Glaser L.1975.Bacillus subtilisN-acetylmuramic acid L-alanine amidase. The J Biol Chem250:1676-1682.)。由σ^k控制的CwlC(Kuroda A,Asami Y,Sekiguchi J. 1993.Molecular cloning of a sporulationspecific cell wall hydrolase gene of Bacillus subtilis.J Bacteriol175:6260–6268.)和CwlH(Nugroho FA,Yamamoto H,Kobayashi Y, SekiguchiJ.1999.Characterization of a new sigma-K-dependent peptidoglycan hydrolasegene that plays a role in Bacillus subtilis mother cell lysis.J Bacteriol181:6230–6237.)是芽胞期特有的水解酶。在cwlB，cwlC和cwlH三个基因中，两两基因缺失使细胞不能正常裂解，三个基因同时缺失会阻断母细胞的裂解，单个基因缺失并没有影响母细胞裂解(Nugroho FA,Yamamoto H,Kobayashi Y,Sekiguchi J.1999. Characterizationof a new sigma-K-dependent peptidoglycan hydrolase gene that plays a role inBacillus subtilis mother cell lysis.J Bacteriol181:6230–6237.，Smith TJ,Foster SJ.1995.Characterization of the involvement of two compensatoryautolysins in mother cell lysis during sporulation of Bacillus subtilis 168.JBacteriol177:3855–3862.)。在Bt中，之前有研究发现参与Bt母细胞裂解的水解酶B.thuringiensis CwlB基因缺失后能够显著延缓母细胞的裂解(Yang J,Peng Q,Chen Z,Deng C,Shu C,Zhang J,Huang D,Song F.2013.Transcriptional regulation andcharacteristics of a novel N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase gene involvedin Bacillus thuringiensis mother cell lysis.J Bacteriol195:2887–2897.)，B.thuringiensis CwlC基因缺失后能够完全阻断母细胞的裂解(Chen X,Gao T,Peng Q,et al.The Novel Cell Wall Hydrolase CwlC from,Bacillus thuringiensis,isEssential for Mother Cell Lysis[J].Applied and Environmental Microbiology,2018:AEM.02640-17.)。

发明内容

本发明鉴定一个新的基因mclX，mclX基因能阻断芽胞杆菌母细胞裂解，为构建细胞壁包裹晶体的Bt制剂、增强制剂的持效性提供新的改良策略。

MclX蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码MclX蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

MclX蛋白在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用。

所述应用为使苏云金芽胞杆菌菌株中缺失编码MclX蛋白的基因。

所述编码MclX蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

上述应用构建得到的缺失编码MclX蛋白的基因的苏云金芽胞杆菌突变株。

所述的突变株，命名为HD(ΔmclX)，其原始菌株为B.thuringiensis HD73。

本发明菌株为B.thuringiensis HD73中的一种新蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。突变体HD(ΔmclX)表型显示mclX基因缺失后母细胞不裂解，并且发现在芽胞期(T₆时期后)受GerE的负调控。MclX定位于细胞质内。另外有趣的是，在mclX缺失菌株中，没有检测到CwlC蛋白。在该突变体HD(ΔmclX) 中转入cwlC基因，突变体HD(ΔmclX)细胞中没有检测到CwlC。本发明为苏云金芽胞杆菌工程菌的构建提供了理论基础，为工程菌的应用增效提供新的改良方式。

本发明的苏云金芽胞杆菌基因mclX参与母细胞裂解，mclX基因缺失可完全阻断母细胞裂解，并且不影响芽胞形成和Cry1Ac蛋白的产量，GFP定位在细胞质中。mclX的缺失影响母细胞裂解关键水解酶CwlC的转录和蛋白形成。本发明表明MclX是母细胞裂解途径的关键因子，其编码基因的缺失可实现细胞壁对杀虫晶体的包裹，对于构建高持效性的苏云金芽胞杆菌工程菌有重要帮助，具有较大的应用前景。

本发明的基因mclX能阻断芽胞杆菌母细胞裂解，还可以构建mclX基因缺失的细胞壁包裹晶体的Bt制剂、增强制剂的持效性提供新的改良策略。

附图说明

图1光学显微镜观察母细胞的裂解情况

(A)光学显微镜观察B.thuringiensi HD73野生型、突变体HD(ΔmclX)以及恢复突变体 HD(ΔmclX::mclX)在T₁₇、T₂₄时期的细胞形态。菌体均培养在30℃，220rpm培养箱中。标尺为5μM。

(B)光学显微镜观察B.thuringiensis突变体HD(ΔmclX)菌株在培养至3天，5天的细胞形态。菌株均培养在SSM培养基，30℃，220rpm条件中。标尺，为5μM。

图2 mclX启动子的转录调控

(A)B.thuringiensis HD73 mclX基因序列。图中显示B.thuringiensis HD732542-2544 基因在基因组位置中的图谱，从基因组染色体上敲除的mclX基因缺失区域及mclX基因启动子转录方向被标示出来。867-bp的序列被注释，省略部分用点表示。HD73_2542基因的终止密码子以及HD73_2543基因的起始密码子和终止密码子分别用单划线及双划线表示出来。

(B)Bt MclX蛋白在蜡样芽胞杆菌族中的进化关系分析。通过NCBI BlastP和MEGA分析Bt MclX 蛋白在Bc族中的进化关系。

(C)mclX启动子的转录调控。β-galactosidase活性测定用来比较mclX基因启动子在不同菌株HD73、HD(ΔgerE)和HD(ΔsigK)中的转录活性。菌株均培养在SSM培养基中，30℃， 220rpm；T₀是对数生长期结束，T_n是T₀后的第n个小时；每个值表示三次独立重复的平均值，误差线表示标准误差。

图3 B.thuringenisis HD73野生型和突变体HD(ΔmclX)菌体芽胞形成率和晶体产量产量的比较

(A)B.thuringenisis HD73野生型和突变体HD(ΔmclX)菌体芽胞形成率比较。误差线表示标准误差。

(B)B.thuringenisis HD73野生型、突变体HD(ΔmclX)以及恢复菌株HD(ΔmclX::mclX) 芽胞形成率比较。误差线表示标准误差。

图4 HD(pHT-gfp-mclX)菌株在T₁₀、T₁₄、T₂₀时期的CLSM观察图像。菌株培养在SSM培养基， 30℃，220rpm条件下。

图5突变体HD(ΔmclX)中cwlC基因的转录及突变体HD(ΔcwlC)中mclX基因的转录

(A)β-galactosidase活性测定用来比较cwlC基因启动子在HD73野生型及突变体(ΔmclX) 中的转录活性。

(B)β-galactosidase活性测定用来比较mclX基因启动子在HD73野生型及突变体(ΔcwlC) 中的转录活性。

图6 western blot检测cwlC基因在突变体HD(ΔmclX)中的表达

B.thuringenisis HD73野生型及突变体HD(ΔmclX)不同时期菌体中CwlC含量。菌株均培养在SSM培养基中，30℃，220rpm；从T₁₀开始，每隔2h取样2ml，离心收集菌体。

图7激光共聚焦显微镜观察cwlC在突变体HD(ΔmclX)的表达

HDΔmclX(pHT-gfp-cwlC)菌株以及HDΔmclX(pHT-cwlC-gfp)在T₁₄时期的CLSM观察图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

材料与方法

1.细菌菌株，质粒与培养条件

本研究用到的菌株和质粒均列在表1中。苏云金芽胞杆菌Kurstaki HD73(文章中都称为HD73)及其衍生菌株通常培养在30℃条件下Luria–Bertani(LB)培养基中((1％tryptone，0.5％yeast extract，1％NaCl，固体LB培养基需要补充1.5％琼脂)。检测启动子活性及表型观察时，选用Schaeffer’s sporulation medium(SSM；8g nutrient broth,0.12g MgSO₄,1g KCl,0.5mM NaOH,1mM Ca(NO₃)₂,0.01μM MnCl₂,1μM FeSO₄ per literbroth)(Schaeffer P,Millet J,Aubert JP.1965.Catabolic repression of bacterialsporulation.Proc Natl Acad Sci U S A54:704–711.)。此外，大肠杆菌 (Escherichiacoli,简称E.coli)BL21用作蛋白克隆的宿主菌株，E.coliET12567用作为质粒DNA去甲基化(Hoffmann F,Schmidt M,Rinas U.2000.Simple technique for simultaneous on-lineestimation of biomass and acetate from base consumption and conductivitymeasurements in high-cell density cultures of Escherichia coli. BiotechnolBioeng70:358–361.,Wang G,Zhang J,Song F,Wu J,Feng S,Huang D.2006. EngineeredBacillus thuringiensis GO33A with broad insecticidal activity againstlepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol72:924–930.)用于苏云金芽胞杆菌生长时所需的抗生素和使用浓度：红霉素5μg/ml、卡那霉素50μg/ml。用于大肠杆菌的生长时所需的抗生素和使用浓度：氨苄青霉素100μg/ml。

表1本研究运用到的菌株和质粒

^a抗生素抗性如下所示：ErmR，红霉素抗性；AmpR，氨苄青霉素抗性。

上述菌株或质粒，本申请人的实验室均有保存，可以对外公开发放。

2.DNA的操作

Taq DNA polymerase(BioMed,北京,中国)and PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa Biotechnology Corporation,北京,中国)用于PCR的扩增。AxyPrep PCR CleanupKit(Axygen Biotechnology Corporation,北京,中国)用于PCR扩增片段的纯化。用于PCR模板的B. thuringiensis基因组DNA从煮沸10分钟后的菌液上清中获得。限制性内切酶和T4 DNA ligase(TaKaRa Biotechnology Corporation,北京,中国)按照制造商说明书使用。寡聚核苷酸引物(见表2)在Sangon Biotech(北京,中国)合成。AxygenPlasmidMiniprep Kit (Axygen Biotechnology Corporation,北京,中国)用于提取E.coli中的质粒DNA。热击法用于质粒转化E.coli(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,Molecular cloning:a laboratory manual,1989,Cold Spring Harbor LaboratoryPress:Cold Spring Harbor, NY.)；电击法用于质粒转化B.thuringiensis(Lereclus D,Arantes O,Chaufaux J,Lecadet M.1989.Transformation and expression of a cloneddelta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis.FEMS Microbiol Lett51:211–217.)。

3.菌株构建

用同源重组的方法构建mclX基因缺失突变体。具体方法如下：以B.thuringiensisHD73 基因组DNA为模板，mclX-1和mclX-2为引物，通过PCR扩增出mclX基因上游725bp大小的片段 (mclX片段A)，其中12bp与mclX基因5′端重叠；以B.thuringiensis HD73基因组DNA为模板，mclX-5和mclX-6为引物，PCR扩增出mclX基因下游大小为677bp的片段(mclX片段B)，该片段距离mclX基因3′端4bp；以引物mclX-3和mclX-4扩增卡那霉素抗性基因，通过PCR扩增出1473bp大小的Km序列(片段K)。通过重叠PCR扩增全序列AKB，PMAD载体用Smal1和EcoR1 酶切，与AKB序列进行同源重组连接，随后热激转化转化大肠杆菌DH5а，PCR鉴定阳性菌落；提取质粒，转入ET菌中大量扩增；最后电击转化B.thuringiensis HD73，鉴定阳性菌落。通过同源重组的方法进行mclX基因缺失突变体的筛选。(Yang J,Peng Q,Chen Z,DengC,Shu C,Zhang J,Huang D,Song F.2013.Transcriptional regulation andcharacteristics of a novel N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase gene involvedin Bacillus thuringiensis mother cell lysis.J Bacteriol195:2887–2897.)以mclX-1和mclX-6为引物进行鉴定，最终筛选获得突变体菌株HD(ΔmclX)。

为鉴定mclX基因的转录活性，构建mclX基因的报告载体。以B.thuringiensisHD73菌株基因组为模板，P2543-S/P2543-As为引物，扩增mclX基因的启动子区，扩增完成后，将目的片段和载体分别进行双酶切。通过菌落PCR鉴定以及酶切鉴定，表明P_mclX-lacZ重组载体构建成功，且测序正确。经过Solution I连接酶连接，获得重组质粒pETmclX，将其热激转化E.coli ET中去甲基化。鉴定正确后，将该质粒通过电击转化进Bt HD73野生菌株及突变体HD(ΔgerE)中，最终获得含有重组质粒pHTPmclX的HD73(pHTPmclX)和HD(ΔgerE)(pHTPmclX)菌株。

为进一步确定MclX功能，构建了突变体HD(ΔmclX)的恢复菌株HD(ΔmclX：：ΔmclX)。构建方法如下：以B.thuringiensis HD73基因组为模板和HFmclX-F/HFmclX-R为引物，通过 PCR扩增出mclX基因的启动子及编码区(998bp)。将扩增后的DNA片段与pHT315载体同时进行PstI和BamHI双酶切，通过SolutionI连接，获得重组质粒pHTHFmclX。将菌落PCR验证正确的菌落进行酶切验证，酶切正确表明重组载体pHTHFmclX构建成功后。将该重组质粒电击转化入HD(ΔmclX)突变体菌株中，以获得恢复突变体菌株HD(ΔmclX：：ΔmclX)。

为检测MclX体外生物学功能，构建MclX蛋白表达菌株，具体方法如下：以Bt HD73菌株基因组为模板，设计引物protein-2543-S/protein-2543-As，在 protein-2543-S/protein-2543-As的3’端和5’端分别加上Pst I与BamHI酶切位点，扩增mclX基因的编码区。Pst I与BamHI双酶切pET21b与mclX目的片段，经过Solution I 连接酶连接，获得重组质粒pETmclX。将该重组质粒热激转化E.coliBL21中进行蛋白表达。

为探究MclX的亚细胞定位，构建mclX与gfp融合表达载体pHT-gfp-mclX)。PCR扩增基因mclX的启动子区、编码区(共999bp)以及大小为714bp的GFP片段，利用重叠PCR，将这三个片段按照mclX promotor、gfp gene+linker和mclX ORF的顺序重叠成为一个长度为1821bp的DNA片段。再将EcoRI/BamHI酶切后的pHT315载体与重叠后的片段进行连接，获得重组菌株HD(pHT-gfp-mclX)。

4.β-galactosidase活性测定实验

在指定的时间范围内每隔1h收集培养在SSM中的B.thuringiensis细胞，用来测定不同时间点B.thuringiensis细胞中的β-galactosidase活性，详细方法参照文献(MilletJH,Experiments in molecular genetics,1972,Cold Spring Harbor Press:ColdSpring Harbor,NY.)。所有数据均进行至少3次的独立重复实验。

5.MclX蛋白表达及纯化

E.coli BL21(pETmclX)菌株用作蛋白表达。MclX蛋白纯化方法参考文献(Yang J,Peng Q,Chen Z,Deng C,Shu C,Zhang J,Huang D,Song F.2013.Transcriptionalregulation and characteristics of a novel N-acetylmuramoyl-L-alanine amidasegene involved in Bacillus thuringiensis mother cell lysis.JBacteriol195:2887–2897.)进行。具体方法如下：先将E.coli BL21(pETmclX)菌株进行活化，再将其按1％接菌量转接至含200μl Amp 的200ml LB培养基。在37℃，,220rpm条件下培养至OD₆₀₀(600nm处光密度)为0.5左右，加入终浓度为0.5mM IPTG，在18℃,150rpm条件下诱导表达过夜12h。次日将菌液收集在50ml离心管中，4℃，8000r/min离心5min，弃上清。重复离心收集菌体，最后用50mmol/L Tris-HCl悬浮沉淀；将菌体置于冰上超声破碎(70％功率，超3s停5s，净超声时间6min)。 4℃，12000r/min离心15min，分别取上清和沉淀SDS-PAGE检测。含有大量MclX-His蛋白的上清经镍离子螯合柱，将MclX-His蛋白通过螯合作用留在柱子上，而非特异性结合的的杂蛋白用50mM咪唑缓冲液(50mM imidazole,1M NaCl,20Mm Tris-HCl)洗脱除去。最终，MclX-His蛋白250mM咪唑缓冲液(250mM imidazole,1M NaCl,20MmTris-HCl) 洗脱并收集起来。

6.聚光共聚焦显微镜观察

为探究MclX蛋白的亚细胞定位，将含有重组质粒的pHT-gfp-mclX的B.thuringiensis HD73菌株培养在SSM培养基中，在指定的时间点取1ml的菌液收集菌体。收集的菌体细胞用去离子水洗涤3次后悬在50μl去离子水中。随后，1μl悬起的细胞加入适量的细胞膜染液FM4-64(100μM；Thermo Scientific,United States ofAmerica)在冰上染色1min。染色后的样品用聚光共聚焦显微镜(Leica TCS SL；LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany) 进行观察。同时为了确定CwlC在突变体HD(ΔmclX)中的表达情况，将菌株HD(ΔmclX) (pHT-gfp-cwlC)培养在SSM中，在指定时间点取样进行激光共聚焦观察。

7.Cry1Ac晶体蛋白定量

B.thuringiensis HD73野生株(含cry1Ac基因)、HD(ΔmclX)突变体菌株以及HD(ΔmclX::mclX)恢复菌株在SSM培养基30℃条件下培养至T₂₀及T₃₀时期。随后离心8000×g，4℃10min收集菌体，并经冷冻干燥直至成冻干粉末。在每个样品中加入适当体积的ddH2O重悬，使每个样品生物量浓度(mg/ml)相同。准备含200μg石英砂(直径为0.1mm)的2 ml离心管，加入细胞细胞重悬液并破碎。离心12000×g，4℃5min，取上清液，作为总蛋白样品。进而通过SDS-PAGE(4％聚丙烯酰胺浓缩胶，10％聚丙烯酰胺分离胶)和考马斯亮蓝染色来检测Cry蛋白的产量。

8.光学显微镜观察和芽胞形成率实验

野生菌株HD73和突变体菌株HD(ΔmclX)在100ml SSM培养基中和30℃220rpm条件下培养。在指定的时间点分别取出1ml菌液进行离心，将收集的菌体悬在适量的去离子水中。每个样品取1μl用BX61光学显微镜(Olympus Corporation，Japan)进行观察。芽胞形成率的实验方法参考文献(Yang J,Peng Q,Chen Z,Deng C,Shu C,Zhang J,Huang D,SongF.2013.Transcriptional regulation and characteristics of a novel N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase gene involved in Bacillus thuringiensismother cell lysis.J Bacteriol195:2887–2897.，Zhang Z,Yang M,Peng Q,Wang G,Zheng Q, Zhang J,Song F.2014.Transcription of the lysine-2,3-aminomutase genein the kam locus of Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki HD73 is controlledby both 54 and K factors.J Bacteriol196:2934–2943.)进行。

9.蛋白印迹实验(western blot)

首先10％SDS-PAGE进行蛋白分离。随后进行转膜：将PVDF膜浸泡于甲醇中，轻摇5min，再转至Transfer Buffer缓慢摇动10min，将SDS-PAGE胶置于PVDF膜上，利用eBlotProtein Transfer System转膜10min。取出PVDF膜，放入装有Blocking Buffer的盒子中，室温摇动2h。倒掉溶液，加入20ml Blocking Buffer，加入1μl相应抗体，摇动2h。倒掉溶液，加入20ml Blocking Buffer，摇动5min。重复3次。加入20ml新鲜Blocking Buffer，并加入2μl二抗，室温摇动2h。倒掉溶液，加入TBST，摇动5min，洗膜三次。显色。

10.进化关系分析

通过NCBI的BLAST，获得mclX在Bc族9个种群的同源基因序列，采用MEGA的NJ法(P-distance法)进行进化关系分析。

结果与分析

1.mclX基因缺失可阻断母细胞的裂解

为研究mclX基因功能，我们利用同源重组的方法将卡那霉素抗性基因替换mclX基因，得到mclX基因缺失突变体HD(ΔmclX)。mclX基因缺失不影响细胞的生长(数据未显示)。通过光学显微镜观察了野生菌株HD73和突变体菌株HD(ΔmclX)不同时期的细胞形态，观察结果发现，野生型菌株HD73在T₁₇时期时细胞有少量裂解，在T₂₄时期时细胞大部分都裂解，而突变体菌株HD(ΔmclX)的母细胞一直未裂解。而后构建了突变体HD(ΔmclX)的恢复株HD(ΔmclX::mclX)，其在T₁₇时期时细胞有少量裂解，在T₂₄时期时大部分都裂解，与野生型细胞形态保持一致。为了进一步确定其表型，我们继续观察突变体HD(ΔmclX)的细胞形态，发现其在第3天、第5天细胞也没有发生裂解(图1)。

实验结果表明，mclX基因缺失后菌株不发生裂解，表明其在母细胞裂解中起着重要作用。

2.mclX基因序列和转录调控分析

首先对B.thuringiensis HD73基因组中基因编号为HD73_2543的基因开放阅读框进行分析(图1)。基因HD73_2543大小为660-bp，经过生物信息学分析，得知其无已知结构域及跨膜结构。将HD73_2543暂时命名为mclX(mother cell lysis X)(图2中A)。通过NCBI的BLAST，获得mclX在Bc族9个种群的同源基因序列，采用MEGA的NJ法(P-distance法) 进行进化关系分析，结果发现mclX在Bc族的9个种群广泛存在，且序列相似性高度保守(图 2中B)。

为验证mclX基因是否受GerE、SigK的转录调控，构建了mclX基因与lacZ的融合载体 pHTPmclX，分别转化入野生型HD73及突变体HD(ΔgerE)HD(ΔsigK)，获得含有重组质粒pHTPmclX的HD(PmclX-lacZ)、HDΔgerE(PmclX-lacZ)和HDΔsigK(PmclX-lacZ)菌株。通过β-galactosides活性测定分析，得知PmclX在T₆时期已有转录活性，T12时转录活性最高(图2中C)。该结果表明mclX基因是在芽胞期进行表达。HD(ΔgerE)(PmclX-lacZ) 菌株的β-galactosides分析结果显示，其整体活性明显高于在HD73野生株中的转录活性，这表明mclX基因受GerE的负调控；而在HD(ΔsigK)突变体中无转录活性，表明mclX基因受σ^K的正调控.

3.mclX基因的缺失不影响芽胞形成率和晶体蛋白产量。

为探究mclX基因的缺失能否影响Bt的Cry蛋白产量，选取了野生株HD73及突变株HD (ΔmclX)T₂₀及T₃₀时期的菌体，进行了总蛋白定量分析。实验结果表明，位于大小约130kDa 的Cry蛋白产量未有明显差异(图3中A)。同时为了确定mclX基因的缺失对Bt芽胞形成的影响进行了芽胞形成率实验，选取了T24时间点的菌体进行稀释涂板，实验结果表明，mclX 基因的缺失没有影响芽胞的形成(图3中B)。因此，mclX基因的缺失不会影响Cry蛋白产量及芽胞的形成。

4.MclX的亚细胞定位

为进一步确定MclX蛋白功能，探究其在细胞中的亚细胞定位，构建mclX与gfp融合表达载体pHT-gfp-mclX。随后将该质粒电击转化入B.thuringiensis HD73细胞中，获得菌株HD(pHT-gfp-mclX)。将其培养在SSM培养基，30℃，220rpm条件下，取T₁₀、T₁₄、T₂₀时期样品，gfp基因表达的绿色荧光蛋白(GFP)用来指示MclX的表达情况。通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察，在T10、T14时期时细胞未发生裂解，GFP指示位置定位于胞质中；在T20 时期大部分细胞发生裂解，GFP指示的绿色荧光信号随着细胞的裂解而流出，且在释放的晶体和芽胞中没有发现绿色荧光信号(图4)。结果观察表明，MclX定位于细胞质中，在晶体和芽胞中不表达。

5.mclX基因的缺失影响CwlC的产量(在野生型菌株HD73，含有cwlC基因)

突变体HD(ΔmclX)的母细胞不裂解，而CwlC是本实验室发现的母细胞裂解关键水解酶，缺失突变也会导致母细胞不裂解，突变体HD(ΔmclX)中cwlC的表达与蛋白合成是否受到影响？为研究cwlC基因在突变体HD(ΔmclX)的转录情况，将cwlC启动子连接lacZ 构建表达载体PcwlC-lacZ电击转化入突变体HD(ΔmclX)中，获得菌株突变体HDΔmclX (PcwlC-lacZ)。通过β-galactosides活性测定分析，与野生型相比，cwlC在HD(ΔmclX) 突变体中的转录活性降低，表明MclX对cwlC的转录有促进作用(图5中A)。有趣的是，我们也在HD(ΔcwlC)突变体中测定了mclX启动子的转录活性，结果发现在突变体中mclX启动子的转录活性反而升高。为进一步探究cwlC基因在突变体HD(ΔmclX)的表达情况，将野生型HD73和突变体HD(ΔmclX)菌株分别培养在SSM培养基中，从T₁₀开始到T₂₄，每隔2h 取2ml菌体，离心收集。将细胞破碎后，通过蛋白免疫印迹来确定野生型HD73和突变体HD (ΔmclX)细胞中是否有CwlC蛋白。结果显示，在野生型HD73中检测到CwlC，然而在突变体HD(ΔmclX)细胞中没有检测到CwlC(图6)。

另外，为进一步验证此结论，我们将质粒pHT-gfp-cwlC转化入突变体HD(ΔmclX)中，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)来观察CwlC在突变体HD(ΔmclX)中的表达情况，结果显示，没有观察到绿色荧光信号(图7)，表明CwlC没有在突变体HD(ΔmclX)中表达。

以上结果表明，mclX基因的缺失影响了CwlC蛋白的表达。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用

<141> 2020-08-20

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

Met Ala Arg Lys Lys Gln Pro Lys Tyr Asn Val Gly Asp Ile Val Val

1 5 10 15

Ile Thr Leu Tyr Gly Thr Val Gly Lys Ile Thr Asn Met Lys Val Leu

20 25 30

Asp Gly Val Tyr Val Tyr Glu Val Asn Asn His Asp Gly Phe Tyr Val

35 40 45

Glu Gln Thr Leu Gln His Val Thr Glu Gln Asp Met Lys Lys Gly Asp

50 55 60

Thr Glu Trp Ile Glu Leu Asn Tyr Asn Phe Thr Phe Gly Asp Leu Val

65 70 75 80

Gln Val Thr Gly Tyr Asp Lys Asp Val Phe Arg Ile Val Gly Phe Arg

85 90 95

Thr Glu Val Trp Arg Tyr Lys Asn Asp Ala Trp Glu Asp Thr Ile Tyr

100 105 110

Glu Leu Ser Arg Ile Thr Asp Gly Glu Trp Leu Glu Ala Asp Glu Ser

115 120 125

Asp Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ala Gln Thr Ala Asn Ala Ile Leu Lys

130 135 140

Lys Met Lys Gln Asp Lys Ala Gly Met Asn Lys Leu Asp Leu Gly Lys

145 150 155 160

Leu Lys Ser Ile Asn Asn Ser Lys Lys Val Ser Val Lys Thr Asn Arg

165 170 175

Gln Glu Ile Ile Asp Gly Leu Leu Asp Ile Tyr Asn Asp Tyr Gln Leu

180 185 190

Leu Phe Asp Thr Phe Lys Asp Glu Glu Tyr Lys Ile Val Met Asp Val

195 200 205

Val His Asn Tyr Leu Val Lys Leu Thr Glu Lys Lys

210 215 220

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

atggcaagaa aaaaacaacc taaatacaac gtaggggaca tagtcgtgat tacgctatat 60

ggaaccgttg ggaaaatcac aaatatgaag gttttagatg gagtttatgt atacgaagtc 120

aataatcacg atggatttta cgtagagcaa acattgcagc acgttacaga gcaagatatg 180

aaaaagggcg atacggagtg gattgaatta aattataatt tcacgtttgg tgatcttgtg 240

caagtaactg gatatgataa agatgttttc cgtattgttg gttttcgtac agaagtatgg 300

agatataaga atgacgcatg ggaagataca atttatgaat tgtcacggat tacggatggt 360

gaatggttag aagcggatga atcagattta acgttactcg ccaatgctca aacggcaaat 420

gcaattttga agaaaatgaa acaagataaa gcaggtatga ataaattaga tttaggaaag 480

ttaaagtcaa ttaacaactc gaaaaaagtg agtgttaaga cgaatcgtca agaaatcatt 540

gatggattac ttgacattta taacgattat caattattgt tcgatacatt taaagatgaa 600

gaatataaaa ttgtaatgga tgttgttcat aattatttag ttaaattgac agagaaaaaa 660

tag 663

Claims (6)

1.MclX蛋白在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用，所述MclX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，为使苏云金芽胞杆菌菌株中缺失编码MclX蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的应用，所述编码MclX蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求2所述的应用构建得到的缺失编码MclX蛋白的基因的苏云金芽胞杆菌突变株。

5.根据权利要求4所述的苏云金芽胞杆菌突变株，所述编码MclX蛋白的基因序列如SEQID NO：2所示。

6.根据权利要求5所述的苏云金芽胞杆菌突变株，命名为HD(ΔmclX)，其原始菌株为B.thuringiensis HD73。

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