KR100365492B1 - 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 - Google Patents
방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100365492B1 KR100365492B1 KR10-1998-0046971A KR19980046971A KR100365492B1 KR 100365492 B1 KR100365492 B1 KR 100365492B1 KR 19980046971 A KR19980046971 A KR 19980046971A KR 100365492 B1 KR100365492 B1 KR 100365492B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pnu212
- recombinant
- protective antigen
- bacillus brevis
- vector
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/08—Bacillus brevis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 바실러스 브레비스 47-5 균주의 돌연변이주인 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 47-5Q 균주를 방어항원 유전자가 도입된 pNU212-PA 벡터로 형질전환시켜 재조합 방어항원을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로 Welkos 등에 의해 보고된 방어항원유전자(pag)의 염기서열을 기초로 제작한 프라이머로 PCR을 행하고 PCR 산물을 pNU212 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pNU212-PA를 제조한 후 이 재조합 벡터로 바실러스 브레비스 47-5Q를 형질전환시켜 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)를 제조하고 이 재조합 균주의 배양액을 SDS-PAGE 분석 및 면역블럿팅하여 단백질 발현 여부 및 상기 발현된 단백질이 방어항원임을 확인하고 본 발명 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액으로부터 재조합 방어항원을 분리정제하지 않거나 또는 분리정제한 후 전기영동하여 분자량을 확인하고 웨스턴 블럿 및 면역블럿을 실시하여 방어항원임을 확인하며 표준균주 바실러스 안트레시스 ATCC14185의 배양액에서 분리한 방어항원과 본 발명 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA) 배양액에서 분리한 방어항원을 함께 정제하고 SDS-PAGE를 실시한 후 Procise protein sequencing system(Applied biosystem)을 이용하여 N-터미날 염기서열을 분석한 결과, 본 발명의 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)는 사람용 탄저 백신 주성분 및 탄저환자를 진단하는 항원으로 사용될 재조합 방어항원을 생산하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 재조합 탄저균 방어항원(protective antigen)에 관한 것이다. 더욱상세하게는, 본 발명은 탄저균 방어항원 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 이용하여 재조합 방어항원을 대량 제조하는 방법에 관한 것이다.
탄저균의 병원성은 크게 탄저균이 생산하는 외독소와 협막항원에 기인하며 이들은 각각 pXO1과 pXO2라는 라지 플라스미드(large plasmid)에 암호화되어 있다. 탄저균의 외독소는 방어항원(protective antigen;PA), 부종인자(edema factor;EF), 치사인자(lethal factor;LF)의 서로 다른 3종류의 단백질로 구성되며 이들은 독립적으로는 병원성을 나타내지 못하나 PA와 LF가 결합하면 치사독소(lethal toxin)로 작용하고 PA와 EF가 결합하면 부종독소(edema toxin)로 작용하게 된다. 이때 방어항원은 치사인자(LF)나 부종인자(EF)와 결합하여 이들이 세포내로 들어올 수 있도록 해주는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 탄저균의 감염과정에서 방어항체를유발하기 때문에 환자의 진단 뿐 아니라 사람에게 사용되고 있는 백신제의 주성분이기도 하다. 그러나 탄저균이 생산하는 이러한 외독소는 그 생산량이 극히 미량이어서 대량 생산을 위한 연구가 계속 진행되고 있다. 특히, 다른 벡터시스템을 이용한 방어항원 유전자의 발현에 관한 연구가 보고된 바 있고 현재까지E.coli,B. subtilis,Baculovirus를 이용한 재조합 단백질 생산에 관한 실험이 보고되었으며발현된 재조합 항원의 유용성이 어느정도 인정되었다.
본 발명자는 백신제조 및 환자의 진단에 유용한 방어항원을 대량으로 생산하기 위하여 방어항원 유전자를 PCR 방법에 의하여 증폭시켜 단백질 생산이 뛰어난 바실러스 브레비스-pNU212의 숙주-벡터시스템을 이용하여 대량 생산하고자 하였다. 본 발명자가 사용한 숙주세포는 바실러스 브레비스 47-5에서 유래된 우라실(uracil) 요구 돌연변이주로서 야생타입(wild type)인 47-5에 비해 형질전환률이 높고 플라스미드를 보다 안정하게 유지시키며 배양여액에서 프로테아제의 활성이 거의 없으며 일반 배지상에서 자랄때는 포자형성(sporulation)이 없다. 이들 바실러스 브레비스는 토양에서 분리한 비병원성의 균주로서 단백질 합성이 뛰어나며 배양액내로 단백질 분해효소가 전혀 분비되지 않기 때문에 생산된 단백질들이 배양액내에서 분해되지 않고 생물학적 활성을 그대로 유지하는 원형의 단백질을 분비하는 특성이 있으며 최적의 조건하에서 배양액내로 균체단백질의 2배 이상의 단백질을 생산한다. 본 발명의 벡터로 사용한 pNU212 벡터는 5개의 프로모터(promoter)와 2개의 리보솜 결합부위(ribosome binding site)를 가지므로 강력한 발현시스템을 가져 생산량이 작은 다른 단백질의 발현에 유용하게 이용되고있다. 상기 벡터에 삽입시킨 이종의 유전자는 세포벽(cell wall) 단백 신호 펩타이드(signal peptide) 다음에 직접 결합되면 다른 아미노산이 첨가되지 않은 원형의 단백질로서 분비되는 특성을 가지므로 이종단백질 발현에 있어 유용한 시스템으로 인정된다.
따라서 본 발명의 목적은 바실러스 브레비스 47-5 균주의 돌연변이주를 탄저균 방어항원 유전자를 포함하는 pNU212-PA 벡터로 형질전환시켜 재조합 방어항원을 대량 제조함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 방어항원 유전자를 포함하는 pNU212 벡터로 형질전환되어 재조합 방어항원을 생산하는 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방어항원을 생산하는 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q를 형질전환시키는 재조합 벡터 pNU212-PA를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 방어항원 유전자의 발현시스템으로 바실러스 브레비스-pNU212 시스템을 이용하여 재조합 방어항원을 대량 발현시키고 발현시킨 재조합 방어항원의 항원성이 유용한지를 조사하고 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양여액으로부터 방어항원만을 FPLC 방법에 의해 분리정제한 다음 이 분리정제한 재조합 방어항원과 탄저균 유래의 방어항원과의 아미노산 서열을 비교하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명하고자 한다.
도 1a는 T7 벡터 클로닝을 나타낸 전기영동 결과이다.
도 1b는 pNU212 벡터 라이게이션을 나타낸 전기영동 결과이다.
도 2는 방어항원 발현-분비 벡터 pNU212-PA의 구성을 나타낸 모형도이다.
도 3은 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)에 의한 방어항원의 시간경과에 따른 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)에 의해 분비된 방어항원의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 4b는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양 상청액내에 있는 방어항원의 면역블럿분석 결과를 나타낸다.
도 5a는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양 세포분해물내에 있는 방어항원의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 5b는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양 세포분해물내에 있는 방어항원의 면역블럿분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양 상청액을 면역블럿분석한 결과를 나타낸다.
도 6b는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양 상청액을 정제한 후 면역블럿분석한 결과를 나타낸다.
도 7a은 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)에 의해 분비된 방어항원의 각 정제단계에서의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 7b는 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)에 의해 분비된 방어항원의 각 정제단계에서의 면역블럿분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 Welkos 등에 의해 보고된 방어항원유전자(pag)의 염기서열을 기초로 제작한 프라이머로 PCR을 행하고 PCR 산물과 T벡터를 라이게이션시키고E.coli에 도입하여 배양한 후 인서트가 들어간 콜로니에서 플라스미드를 분리하는 단계; 상기 분리한 플라스미드를 제한효소로 처리한 후 pNU212 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pNU212-PA를 제조하고 이 재조합 벡터로 바실러스 브레비스 47-5Q를 형질전환시켜 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)를 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조한 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)를 배양하고 배양여액을 SDS-PAGE 분석 및 면역블럿팅하여 단백질 발현 여부 및 상기 발현된 단백질이 방어항원임을 확인하는 단계; 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 alkaline extraction 방법(Birboim과 Doly 법)으로 분리정제하는 단계; 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액을 분리정제하지 않고 방어항원의 단클론항체나 탄저환자혈청과 면역블럿팅을 실시하여 특이적 반응을 조사하는 단계; FPLC를 이용하여 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액중 재조합 방어항원을 분리정제하는 단계; 분리정제한 재조합 방어항원을 전기영동하여 분자량을 확인하고 웨스턴 블럿 및 면역블럿을 실시하여 방어항원임을 확인하는 단계; 표준균주 바실러스 안트레시스 ATCC14185의 배양액에서 분리한 방어항원과 상기 단계에서 분리정제한 본 발명의 재조합 방어항원을 SDS-PAGE를 실시한 후 Procise protein sequencing system(Applied biosystem)을 이용하여 N-터미날 염기서열을 분석하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 탄저균의 표준균주로는 바실러스 안트레시스 ATCC 14185(Bacillus anthracisATCC 14185)를 사용하였고, 단백질 발현을 위해 사용한 숙주세포인 바실러스 브레비스 47-5Q와 벡터인 pNU212는 일본의 동경 약학대학의 Hideo Yamagata 교수로부터 분양받아 사용하였고 바실러스 브레비스 47-5Q의 배양을 위해서는 T2U 배지를 이용하였으며 단백질 발현 실험에서는 5PY 배지를 사용하여 30℃에서 4일간 배양하였다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 단계별로 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다.
제 1단계; 프라이머의 제작 및 PCR 반응
프라이머의 선정은 Welkos 등에 의해 보고된pag염기서열을 기초로 하여 만들었으며 pag-1은 5'-ATTGGATCCGAAGTTAAACAGGAG-3'(24mer)로BamHI 부위를, pag-2는 5'-AGAGTCGACTTATCCTATCTCATAG-3'(25mer)로SalI 부위를 삽입하였다. 유전자 증폭을 위해서는 Perkin-Elmer사의 PCR Reagent kit를 사용하였으며, template로는 하기 제4단계의 바실러스 안트레시스 ATCC 14185로부터 추출한 플라스미드인 pX01를 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 5분 동안 전처리한 후 95℃에서 1분, 58℃에서 90초, 72℃에서 90초로 30사이클 반응시킨 후 72℃에서 10분간 마지막 신장(extension)하였다. PCR 산물을 확인하기 위하여 도 1a에 나타낸 바와 같이 1% 겔 농도로 70V에서 전기영동하여 EtBr로 염색하여 DNA 밴드를 확인한 후 T 벡터에 라이게이션하고E.coliNova Blue에 도입하여 형질전환하였다. 50㎍/mL의 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 플레이팅한 후 37℃에서 하룻밤 배양한 후 생성된콜로니중 인서트(insert)가 들어간 콜로니를 찾아 플라스미드를 분리하여 제한효소인SalI,BamHI으로 절단하여 전기영동상에서 용출하였다. 이 결과를 도 1b에 나타냈다.
제 2 단계; 재조합 벡터 pNU212-PA 제작 및 바실러스 브레비스 47-5Q 형질전환
본 단계에서는 도 2에 나타낸 모형도와 같이 pNU212 벡터를BamHI/XhoI으로 절단한 후BamHI/SalI으로 처리한 PCR 산물과 16℃에서 하룻밤 라이게이션을 실시한 후 트리스-PEG 방법에 의하여 숙주인 바실러스 브레비스 47-5Q내로 형질전환시켰다. 즉, T2U 배지 5mL에서 37℃의 온도로 하룻밤 배양한 균액을 동일 배지 5mL에 100배 희석하여 접종한 후 5 ~ 6시간 흔들어 주면서 배양하였다. OD660값이 1.9 정도로 자란 균을 4,000g, 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 후 50mM 트리스·HCl(pH 7.5) 5mL로 펠렛(pellet)을 세척한 후 5mL의 50mM 트리스·HCl(pH 8.5)에 부유시킨 다음 37℃에서 천천히 흔들어 주면서 60분간 배양한 다음 세포를 회수한 후 MTP 1mL로 세척하였다. 다시 원심분리하여 세포를 회수한 후 0.5mL의 MTP에 펠렛을 부유시켰다. TE 50μL에 녹인 플라스미드를 균액에 첨가한 후 잘 섞은 다음 1.5mL의 PEG 용액을 가하여 천천히 흔들면서 잘 섞어주었다. 상온에서 서서히 흔들면서 2분 동안 방치한 후 5mL의 MTP를 가하여 잘 혼합하였다. 상온에서 10분동안 4,000g에서 원심하여 균체를 회수한 후 20mM MgCl2가 함유된 T2U 배지 1mL에 부유시킨 후 30℃에서 1시간 배양하고 0.1㎍/mL 에리스로마이신을 가한 후 30℃에서 4시간 흔들면서 배양하였다. 선택항생제인 에리스로마이신(erythromycin;Em)이 10㎍/mL로 들어있는T2U 배지에 0.1 ~ 0.2mL의 균액을 도말하여 30℃에서 3 ~ 5 일간 콜로니 형성을 관찰하였다.
본 단계에서 형질전환된 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)는 1998년 9월 29일 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 부설 유전자은행에 기탁번호 KCTC0525BP로 기탁하였다.
제 3 단계: 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 단백질 발현
본 단계에서는 Em이 첨가된 T2U 아가상에 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)를 배양하여 형성된 콜로니를 선별하여 T2U-Em 브로스에서 배양한 후 플라스미드를 분리하고 제한효소처리하여 방어항원 유전자가 삽입되었음을 먼저 확인하고 이 균주의 단백질 발현을 알아보기 위하여 5PY 배지에서 4일간 배양한 후 배양액과 균체를 SDS-PAGE 및 면역블럿팅(immunoblotting)을 실시하여 발현된 단백질이 방어항원임을 확인하였다. 면역블럿팅을 실시할 때 방어항원에 대한 마우스 단클론항체(USAMRⅡD R2131)를 1:10,000으로 희석하여 1차 항체로 사용하였으며 고트안티-마우스 IgG AP conjugate를 1:5,000배 희석하여 2차 항체로 사용하여 기질인 NBT/BCIP로 발색시켰다. 실험결과, 바실러스 브레비스(pNU212-PA) 배양여액과 균체의 라이사이트를 각각 10% SDS-PAGE를 실시하였을 때 방어항원의 분자량인 83kDa의 위치에서 밴드를 형성하였고(도 4a, 도 5a) 이를 PVDF 막으로 트랜스퍼(transfer)하여 방어항원에 대한 단일클론항체와의 면역블럿팅을 실시한 결과, 특이적인 반응을 보였다(도 4b, 도 5b). 배양 4일 후 배양액 내에서의 단백질 생산량은 대략 300㎍/mL이였다. 시간경과에 따른 균의 배양곡선, PA의 생산량및 pH 변화는 도 3에 나타낸 바와 같이 배양일별로 배양액내 방어항원의 생산량은 평균적으로 배양여액 전체 단백질의 15%에 달하였으며 배양 7일 정도 까지는 비교적 안정된 형태를 유지하였다.
제 4단계: 플라스미드 DNA 분리정제
탄저균의 라지 플라스미드인 pXO1을 분리하기 위하여 kado와 Liu 방법을 사용하였다. 즉, BHI 브로스 25mL에 균을 접종하여 37℃, 셰이킹 인큐베이터(Shaking Incubator)에서 18시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 침전시켰다. Ebuffer(0.04M Tris·Hydroxide, 0.002M EDTA, 15% 슈크로스 pH 7.9) 1mL을 가하여 균을 부유시킨 다음 라이시스 버퍼(0.05M 트리스·하이드로사이드에 슈크로스를 15%(w/v) 농도로 녹인 액에 SDS 3g, 3N NaOH 5mL을 가하여 전체 용량을 100mL로 맞춘다.) 2mL을 가하여 잘 섞어준 후 60℃ 워터배스(water bath)에서 30분간 방치하였다. 프로네이즈(2mg/mL, 2M 트리스 버퍼, pH 7.0)를 0.5mL 첨가하고 다시 37℃ 워터배스에서 20분간 반응시키고 여기에 페놀-크로로포름(1:1, v/v) 6mL을 가하여 추출하였다. 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 액층을 40 ㎕정도 취해 트래킹 염색 10 ㎕와 혼합한 후 0.7% 아가로스 겔로 70V에서 120분간 전기영동하여 플라스미드를 확인하였다. PCR의 주형을 사용하기 위해 이 추출물을 다시 페놀-크로로포름으로 추출한 후 0.7 용량의 이소프로판올로 DNA를 침전시켜 적당량의 TE에 녹여 사용하였다. 또한 바실러스 브레비스의 pNU212 플라스미드와 재조합 플라스미드의 분리는 Birnboim과 Doly의 방법을 따라 수행하였다. 삽입된 유전자의 염기서열 분석을 위하여 ABI PRISM TM 377 DNA 시퀀서(perkin-Elmer)를 사용하였다.
제 5단계: 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA) 배양액의 분리정제전의 특이적 반응조사
재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액(도 6a) 또는 분리정제 방어항원(도 6b)을 단클론항체나 탄저 환자혈청과 면역블럿팅을 실시하였다. 실험결과, 도 6a와 도 6b에 나타낸 바와 같이 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액내의 방어항원과 정제된 방어항원 모두 특이적인 항원성이 있음을 알 수 있다.
제 6단계: 재조합 방어항원 분리정제
재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)의 배양액을 원심분리하여 상청액을 모은 후 암모니움 설페이트를 70% 농도로 가하여 천천히 녹였다. 다 녹인 후 이를 원심분리하여 상등액을 버리고 소량의 트리스 버퍼(20mM Tris, 1mM EDTA, 2mM 2-머캅토에탄올, pH 8.0에 녹이고 동일 버퍼에서 하룻밤 투석하였다. 투석한 배양 농축액을 먼저 음이온 교환 칼럼인 Hiload Q sepharose column chromatography를 실시하였다. 20mM 트리스 버퍼 pH 8.0로 평형화시킨 칼럼에 로딩한 후 동일 완충액으로 용출시켜 미흡착된 단백질을 제거한 후 완충액의 NaCl 농도를 0 ~ 1M로 직선구배를 걸어 흡착된 단백질을 용출시켰다. 용출된 분획들을 전기영동하여 방어항원이 함유된 분획만을 모아 다시 phenyl Sepharose High performance column을 이용한 hydrophobic interaction 크로마토그라피를 실시하고 전기영동하여 단일 밴드를 보이는 분획만을 회수하였다. 실험결과, FPLC를 이용하여 실시한 Hiload Q 세파로스 이온교환은 0 ~ 1 NaCl의 그래디언트(gradient)를 주었을 때 0.15 ~ 0.17M NaCl 농도에서 방어항원이 용출되었다.
제 7단계: 전기영동 및 웨스턴 블럿
상기 6단계의 FPLC 분획중의 방어항원을 확인하기 위하여 피크부분을 10% SDS-PAGE를 걸어 분자량을 확인하였다. 100V에서 2시간 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(coomassie brilliant blue R-250)으로 염색한 후 탈색용액(destaining solution)으로 탈색하여 밴드 위치를 확인하였다. 또 웨스턴 블럿을 실시하여 PVDF 단백질 시퀀싱 막(protein sequencing membrane)에 옮기고 방어항원에 대한 단일클론 항체로 반응시켜 방어항원임을 확인하였다. 전기영동 결과, 83kDa의 방어항원밴드를 확인하였으며 웨스턴블럿팅 결과 단클론항체(Monoclonal antibody)와 특이적으로 반응하였으며 방어항원이 함유된 분획들을 모아 다시 농축한 후 다시 hydrophobic interaction chromatography를 실시하여 단일 밴드로 정제하였다. 정제과정별로 SDS-PAGE 및 면역블럿팅을 실시한 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같았다.
제 8단계; 분리정제한 방어항원의 N-터미날 시퀀싱
재조합균주인 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)로부터 생산된 PA의 N-터미날 시퀀스를 확인하기 위하여 표준균주인 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) ATCC14185의 배양여액과 함께 FPLC를 통해 방어항원를 정제하였다. 정제된 항원을 SDS-PAGE를 실시한 후 PVDF 프로테인 시퀀스 막으로 옮겨 N-말단의 아미노산 서열을 알아보았다. N-말단 서열을 기초과학지원연구소에 의뢰하여 Procise protein sequencing system(Applied biosystem)을 이용하여 분석하였다. 실험결과,재조합 균주의 N-터미날 시퀀스는 Ala-Gly-Ser-Glu-Val-Lys-Gln-GLu-Asn-Arg로 밝혀졌으며 이는 표준균주의 시퀀스에 비해 Ala-Gly-Ser의 3종의 아미노산이 추가된 것이다. 이들 3개의 아미노산은 PCR로 증폭시킨 PA 유전자를 클로닝하기 위해 만들어준 제한효소 부위와 pNU212 벡터내의 시그널펩타이드에서 유래된 것으로 방어항원의 혈청학적 반응에는 별다른 영향을 미치지 않았다.
본 발명은 상기 단계별로 설명한 바와 같이 본 발명의 재조합 균주 바실러스 브레비스 47-5Q(pNU212-PA)가 생산하는 재조합 방어항원은 탄저환자를 진단하는 항원으로 효과가 있고 대량 생산이 가능한 뛰어난 효과가 있으므로 탄저진단용 항원제조 및 탄저성분 백신제개발을 위한 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (1)
- Bacillus anthracisATCC14185 유래하고 하기의 염기서열을 갖는 프라이머로 증폭된 방어항원 유전자를 pNU212 벡터에 삽입시켜서 구축된 재조합 벡터 pNU212-PA가 도입된 형질전환체 바실러스 브레비스 pNU212-PA(기탁번호 KCTC0525BP)를 배양하여 탄저균의 재조합 방어항원을 생산함을 특징으로 하는 방어항원의 제조방법:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-1998-0046971A KR100365492B1 (ko) | 1998-11-03 | 1998-11-03 | 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-1998-0046971A KR100365492B1 (ko) | 1998-11-03 | 1998-11-03 | 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20000031104A KR20000031104A (ko) | 2000-06-05 |
| KR100365492B1 true KR100365492B1 (ko) | 2003-12-01 |
Family
ID=19557018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-1998-0046971A KR100365492B1 (ko) | 1998-11-03 | 1998-11-03 | 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100365492B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100955470B1 (ko) | 2008-01-09 | 2010-04-30 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | 탄저 방어 항원의 제조 방법 |
-
1998
- 1998-11-03 KR KR10-1998-0046971A patent/KR100365492B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20000031104A (ko) | 2000-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yanouri et al. | Cloning and sequencing of the cell division gene pbpB, which encodes penicillin-binding protein 2B in Bacillus subtilis | |
| US6066473A (en) | Introduction of DNA into bacillus strains by conjugation | |
| HU193504B (en) | Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens | |
| JPH06502548A (ja) | 特にコリネバクテリア中で用いることのできる蛋白質の発現および分泌系 | |
| KR100518953B1 (ko) | 포자 외막단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법 | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| JP2001503641A (ja) | バシラス細胞のサーファクチン突然変異株におけるポリペプチドの製造方法 | |
| US4954618A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| IE62833B1 (en) | Bacillus thuringiensis and bacillus cereus recombinant transformation | |
| CN113461789B (zh) | 一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用 | |
| US5082773A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| EP0293391A1 (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g | |
| US5312901A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| US8158387B2 (en) | Method for cell surface display of target proteins using FadL of E. coli | |
| JPS62163694A (ja) | 宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法 | |
| KR100365492B1 (ko) | 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법 | |
| KR100407835B1 (ko) | 니트릴히드라타제(NitrileHydratase)유전자발현을위한조절유전자 | |
| EP0256553B1 (en) | Gene encoding insecticidal protein and production of said protein using said gene | |
| US5229492A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| ES2285095T3 (es) | Procedimiento para la introduccion selectiva de un enlace doble en un entramado de esteroide. | |
| CN111944027B (zh) | mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用 | |
| CA2567501A1 (en) | An expression system comprising operably linked rgg gene and gtfg promoter | |
| RU2701337C1 (ru) | Штамм бактерий Escherichia Coli - продуцент рекомбинантного внеклеточного домена белка GP | |
| US20050042756A1 (en) | Intergenic and intragenic integration sites for foreign gene expression in recombinant S. gordonii strains |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |