CN111925947A - 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法 - Google Patents

一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111925947A
CN111925947A CN202010822554.5A CN202010822554A CN111925947A CN 111925947 A CN111925947 A CN 111925947A CN 202010822554 A CN202010822554 A CN 202010822554A CN 111925947 A CN111925947 A CN 111925947A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
fermentation
tank
culture medium
fermentation tank
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010822554.5A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Jinzhu Ecological Agricultural Technology Co ltd
Original Assignee
Sichuan Jinzhu Ecological Agricultural Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Jinzhu Ecological Agricultural Technology Co ltd filed Critical Sichuan Jinzhu Ecological Agricultural Technology Co ltd
Priority to CN202010822554.5A priority Critical patent/CN111925947A/zh
Publication of CN111925947A publication Critical patent/CN111925947A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，公开了一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，通过斜面种子培养、摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养、发酵液预处理、密闭封存后得到撕裂蜡孔菌孢子液。通过斜面种子培养，得到丰茂的气生菌丝；通过摇瓶种子培养得到舒展、细长，无成团结块现象的菌丝；通过种子罐培养提升菌体的浓度；再通过发酵罐培养继续提升菌丝体的浓度；待发酵完成时，对发酵液进行预处理，以促进被囊孢子的释放，得预处理发酵液，再对预处理发酵液进行分装密封存放后得到撕裂蜡孔菌孢子液，方便存储，更有利于田间喷洒使用；并且培养菌丝过程中，外观无结块、减少结球或呈结成丝状的现象，产品质量高。

Description

一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，特别涉及一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备 方法。
背景技术
我国化肥农药的使用量位居世界各国之首，高量的化肥农药投入带来了一 系列环境、生态及食品安全问题。在现代集约化农业生产中，需要大量频繁施 用农药防治作物病害。但长期、大量施用农药造成了一系列生产、环境和健康 问题，如病菌耐药性增强，药效降低，用药量增大，环境和农产品的农药残留 量增加，影响食品安全，危害人类健康等。
真菌病害占作物病害的70％～80％。目前，病害防治的主要手段是选育高 抗品种，加强田间管理和施用化学农药为主。但是，具有育种周期较长，费用 高昂；田间管理需要生产者较高的操作水平，消耗大量劳力的缺陷；而大量施 用化学农药产生上述一系列生产、环境和健康问题。因此，研制安全、无毒、 高效的生物农药十分必要。
生防菌主要通过分泌抗菌物质，与病原菌竞争营养空间，杀灭或抑制病原 微生物，或诱导植物获得抗性，提高植物自身免疫力，达到少施或不施农药； 促生菌能分泌促生物质如生长素类，促进植物生长，活化土壤难溶性养分，如 溶磷、解钾，提高养分有效性，达到减施化肥之目的。故筛选高效生防菌、促 生菌或兼具两种功能的微生物菌株并建立相应配套的生产技术是一项亟待创新 的工作，也是目前农业科研与应用的热点之一。
近年来，人们发现的生防菌主要为细菌，真菌相对较少。在已发现的生防 菌中，具有抗菌谱广、高效、适应性强的菌株不多，亟待筛选出更多的广谱、 高效、适应性强的菌株，应用于农业生产。目前，人们所发现的生防真菌主要 包括木霉菌属、毛壳菌属、菌根真菌属和腐霉属，它们通过分泌抗菌物质，产 生溶菌和重寄生作用，诱导植物产生抗性等多种途径拮抗病菌。
撕裂蜡孔菌是一种广谱微生物杀菌剂，是植物致病真菌的天敌，其活性成 分主要是撕裂蜡孔菌被囊孢子；其属于卵菌纲、霜霉目、腐霉科、腐霉属，暂 发现有120多个小种。作用特点在于其系列分泌物不但对多种致病真菌具有很 强的寄生及抗生作用，而且可以促进植物生长，使植株茁壮；同时卵孢子状态 稳定性好、更易耐受逆境。但是现有的撕裂蜡孔菌不易存储，不方便田间喷洒 使用，而且现有技术在培养菌丝过程中，容易结块、结球或呈结成索状，从而 影响菌丝体的总产量，最终导致孢子数达不到标准，严重影响产品质量。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方 法，所制得的撕裂蜡孔菌孢子液方便存储，能够减少贮藏运输成本，更有利于 田间喷洒使用；并且培养菌丝过程中，外观无结块、结球或呈结成索状的现象， 产品质量高。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，具体包括：
菌种选择，选用撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)菌株，于2015年4月28 日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCCNo.10485；
斜面种子培养，在无菌条件下将所述菌株涂布接种于斜面培养基上，得斜 面菌丝；
摇瓶种子培养，在无菌条件下，挖取生长成熟的斜面菌丝，接种于摇瓶培 养基中，再置于恒温培养振荡器上，振荡频率为200-260rpm，培养温度为 22-30℃，培养48-90小时后得摇瓶种子液；
种子罐培养，将摇瓶种子液种入种子罐培养基中，得种子罐种子液；
发酵罐培养，将种子罐种子液压入发酵罐培养基中，得发酵罐菌丝体；
发酵液预处理，待发酵罐菌丝体发酵完毕后，对发酵罐内的发酵液进行预 处理，以促进撕裂蜡孔菌被囊孢子的释放，得预处理发酵液；
密闭封存，将预处理发酵液进行分装密封存放后4个月以上得到撕裂蜡孔 菌孢子液。
在本发明中，首先通过斜面种子培养，得到丰茂的气生菌丝；再通过摇瓶 种子培养得到舒展、细长，无成团结块现象的菌丝；其中，摇瓶种子培养步骤 的各种控制措施是经过大量创造性试验研究出的较为理想的控制措施；再通过 种子罐培养提升菌体的浓度；再通过发酵罐培养继续提升菌丝体的浓度；待发 酵完成时，对发酵液进行预处理，以促进被囊孢子的释放，得预处理发酵液， 再对预处理发酵液进行分装密封存放后得到撕裂蜡孔菌孢子液，方便存储，能 够减少贮藏运输成本，更有利于田间喷洒使用；并且培养菌丝过程中，外观无 结块、结球或呈结成索状的现象，产品质量高。
进一步地，斜面种子培养步骤中，培养温度为22-30℃，培养时间为7-10 天；
种子罐培养步骤中，振荡频率为120-200rpm，通气量为1:0.8-2.0vvm，罐 压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为60-90小时；
发酵罐培养步骤中，振荡频率为60-140rpm，通气量为1:0.2-0.8vvm，罐压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为110-170小时。在本发明中，上述 步骤为20t发酵罐中的培养条件的限定；从斜面菌种培养到发酵罐培养步骤中 所限定的各种控制措施是经过大量创造性试验研究出的较为理想的控制措施， 提升菌丝体的总产量，最后获得孢子数达到标准，并且质量高的撕裂蜡孔菌孢 子液。
进一步地，斜面种子培养步骤中，斜面培养基可以通过购买得到，也可以 通过以下步骤制得：
将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；
将20g葡萄糖和20g琼脂粉同时溶于上述滤液中加热搅拌；
待琼脂粉充分膨化溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；
将定容后的1000ml溶液分装于若干支试管中，每支试管装量10ml-15ml， 塞住各个试管的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后，得到所述斜面培养基。在 本发明中，待制得的斜面培养基的琼脂凝固后，将空白斜面置于37℃培养箱中 培养2～3天，确认无污染后，在无菌条件下将菌种涂布接种于斜面上，置 22-30℃的培养箱中培养7～10天，即完成了斜面孢子的制备，得到丰茂的气生 菌丝。
进一步地，摇瓶种子培养步骤中，摇瓶培养基可以通过购买得到，也可以 通过以下步骤制得：
将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；
将20g葡萄糖溶于上述滤液中加热搅拌；
待葡萄糖溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；
将定容后的1000ml溶液分装于若干三角瓶中，每瓶装量100-150ml，塞住 各个三角瓶的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述摇瓶培养基。在本发 明中，用接种铲挖取生长成熟、大小约10mm×20mm的斜面菌丝，接种于摇 瓶培养基中培养得到舒展、细长，无成团结块现象的菌丝。
进一步地，种子罐培养步骤中，种子罐培养基可以通过购买得到，也可以 通过以下步骤制得：
将6kg葡萄糖、12kg马铃薯、9kg黄豆粉和100L水置于种子罐中，搅拌 至物料充分混匀后用水定容至250L；
加入0.12L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述种 子罐培养基。在本发明中，可以采用火焰接种法或者压差接种法，将1000ml 的摇瓶种子液种入种子罐培养基中培养以提升菌体的浓度。
进一步地，发酵罐培养步骤中，发酵罐培养基可以通过购买得到，也可以 通过以下步骤制得：
将240kg葡萄糖、180kg黄豆粉、1.5kg磷酸氢二钾、7.2kg磷酸二氢钾、 3.0kg硫酸镁、0.012kg生物素、0.012kg泛酸钙、0.024kg氯化钴置于配料池中， 加入适量水搅拌均匀；
将上述混合均匀的物料送入发酵罐中，同时投入240kg马铃薯至发酵罐中， 用水定容至10500L，自然pH；
加入3.6L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后制得发酵罐培 养基。
更进一步地，上述物料混合均匀后，启动料泵将物料泵入12000L不锈钢 发酵罐中，分三次注入适量自来水冲洗配料池直至干净，冲洗液全部泵入发酵 罐，同时将240kg马铃薯直接投入发酵罐中，用饮用水定容至约10500L，加入 3.6L泡敌后密闭罐口，用饱和蒸汽，120～124℃、灭菌30min；控制消后体积 为12000L左右，制得发酵罐培养基，然后通过无菌管道转种，移种管道灭菌 压力0.15～0.20MPa，时间60分钟；将种子罐培养液约300L压入发酵罐中， 用于提升菌丝体的浓度。
进一步地，发酵液预处理步骤中，待发酵罐菌丝体发酵完毕后，按发酵液 体积的5-10％的比例加入氯化钠进行搅拌，从而促进被囊孢子的释放，同时氯 化钠能够作为孢子保护剂；启动搅拌频率100rpm左右，搅拌30分钟左右，待 氯化钠溶液混合均匀后制得预处理发酵液。
进一步地，密闭封存步骤中，将获得的预处理发酵液分装后，放入密闭阴 凉处存放，存放4个月后开始取样计数，计数合格后即得撕裂蜡孔菌孢子液。 在本发明中，采用200L的HDPE塑料桶，每桶装量不超过75％，直至分装完 为止。
进一步地，密封封存步骤中，采用血球计数板进行计数，计数要相当准确、 可信度要高，因此，计数时，每个样品重复计数2-3次。被囊的撕裂蜡孔菌游 动孢子至少在400万个以上。在本发明中，血球计数板被用以对人体内红、白 血球进行显微计数之用，也常用于计算细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是 一种常用的生物学工具；撕裂蜡孔菌被囊孢子的大小较酵母菌略小，正好可以 利用血球计数板进行计数。
本发明的有益效果在于：相比于现有技术，在本发明中，首先通过斜面种 子培养，得到丰茂的气生菌丝；再通过摇瓶种子培养得到舒展、细长，无成团 结块现象的菌丝；其中，摇瓶种子培养步骤的各种控制措施是经过大量创造性 试验研究出的较为理想的控制措施；再通过种子罐培养提升菌体的浓度；再通 过发酵罐培养继续提升菌丝体的浓度；待发酵完成时，对发酵液进行预处理， 以促进被囊孢子的释放，得预处理发酵液，再对预处理发酵液进行分装密封存 放后得到撕裂蜡孔菌孢子液，方便存储，能够减少贮藏运输成本，更有利于田 间喷洒使用；并且培养菌丝过程中，外观无结块、结球或呈结成索状的现象，产品质量高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，包括有以下步骤：
步骤1，菌种选择，选用撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)菌株，于2015年 4月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCCNo.10485；
步骤2，斜面种子培养：
将200g马铃薯洗净切片后用适量去离子水煮沸30分钟，用双层纱布过滤， 取滤液待用；
称取20g葡萄糖及20g琼脂粉，同时溶于上述滤液中，加热搅拌,待琼脂 粉充分膨化溶解后再用去离子水定容至1000ml，自然pH，分装于Φ 25-34mm*290mm的试管中，每支试管装量10ml-15ml，塞上松紧适度的棉塞， 再用单层纱布和牛皮纸扎紧，置于蒸汽灭菌器内，灭菌温度121℃、灭菌时间 30min，灭菌完毕，制成斜面培养基；
待琼脂凝固后，将空白斜面置于37℃培养箱中培养2-3天，确认无污染后， 在无菌条件下将菌种涂布接种于斜面培养基上，置培养箱中培养，培养温度为 22-30℃，培养时间为7-10天，即完成了斜面种子的制备；
通过上述步骤制得的成熟斜面外观：白色、絮状、气生菌丝丰茂，背面呈 浅褐色，无水溶性色素。
步骤3，
将200g马铃薯洗净切片后用适量饮用水煮沸30分钟、用双层纱布过滤， 取滤液待用；
称取20g葡萄糖溶于上述滤液中，加热搅拌,待溶解后再用饮用水定容至 1000ml，自然pH，分装于500ml三角瓶中，每瓶装量100-150ml，塞上松紧适 度的绒布片纱布塞，再用牛皮纸扎紧，置于蒸汽灭菌器内，121℃、灭菌30min， 灭菌完毕，制成摇瓶培养基；
在无菌条件下，用接种铲挖取生长成熟、大小约10mm×20mm的斜面菌 丝，接种于摇瓶培养基中，置于振荡频率为200-260rpm的恒温培养振荡器上， 培养温度为22-30℃，培养时间为48-90h；
通过上述步骤制得的摇瓶种子：镜检无杂菌，菌丝舒展、细长，无成团结 块现象，菌丝染色深，菌体浓度不低于2％，即可转种。
步骤4，
将6kg葡萄糖、12kg马铃薯、9kg冷轧黄豆粉置于盛有约100L饮用水的 500L不锈钢种子罐中，搅拌20分钟至物料充分混匀后用饮用水定容至250L， 加入0.12L泡敌后密闭罐口，用饱和蒸汽灭菌30min，温度120～124℃，控制 消后体积为300L左右。
采用火焰接种法或者压差接种法，将1000ml的摇瓶种子液种入种子罐中， 培养温度22-30℃，振动频率120-200rpm，通气量1:0.8-2.0vvm，罐压0.05MPa， 培养时间60-90h。
通过上述步骤制得的种子罐种子：镜检无杂菌，菌丝舒展、细长，菌丝染 色深，菌体浓度不低于4％，即可转种。
步骤5，
将240kg葡萄糖、180kg冷榨黄豆粉、1.5kg磷酸氢二钾、7.2kg磷酸二氢 钾、3.0kg硫酸镁、12g生物素、12g泛酸钙、24g氯化钴，置于配料池中，加 入适量饮用水，启动搅拌15分钟以上，使物料混合均匀后，启动料泵将物料泵 入12000L不锈钢发酵罐中，分三次注入适量自来水冲洗配料池直至干净，冲 洗液全部泵入发酵罐，同时将240kg马铃薯直接投入发酵罐中，用饮用定容至 10500L，自然pH，最后，加入3.6L泡敌后密闭罐口，用饱和蒸汽灭菌30min， 温度120～124℃，控制消后体积为12000L。
移种管道灭菌：灭菌压力0.15～0.20MPa，时间60分钟。
通过无菌管道转种，将种子罐培养液约300L压入20t的发酵罐中，培养温 度22-30℃，振动频率60-140rpm，通气量1:0.2-0.8vvm，罐压0.05MPa，培养 时间110～170h。
质控点1(发酵放罐控制指标)：菌丝体为主要的放罐依据，菌丝体量不 再增长或增长缓慢，并结合发酵液pH值、残糖量和菌丝状况确定放罐，发酵 罐内具体生长情况见实验二。
步骤6，
发酵完毕，停止搅拌并关闭空气流量，待无泡沫后确认发酵液体积；再按 发酵液体积的5-10％的比例加入氯化钠，以促进被囊孢子的释放，同时也可作 为孢子保护剂；启动搅拌100rpm左右，搅拌30分钟左右，待氯化钠溶解混合 均匀后即可进行分装。
步骤7，
将步骤6获得的预处理发酵液，直接进行分装，200L的HDPE塑料桶，每 桶装量不超过75％，直至分装完为止。密闭阴凉处存放，4个月后开始取样计 数，被囊的撕裂蜡孔菌游动孢子至少在400万个以上即为合格。
本发明采用血球计数板计数：血球计数板被用以对人体内红、白血球进行 显微计数之用，也常用于计算细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常用 的生物学工具。撕裂蜡孔菌被囊孢子的大小较酵母菌略小，正好可以利用血球 计数板进行计数。
质控点2(被囊孢子成熟及计数指标)：成熟的被囊孢子应为单个的游动 孢子，但在计数时，往往会发现有数个孢子堆叠呈葡萄状或呈串珠状，这种情 况，实际是孢子还在泡囊中，并未完全释放出来，也可理解为孢子未成熟，应 再存放一段时间后重新计数。
被囊孢子作为本发明的制备方法中的一个至关重要的指标，计数要相当准 确、可信度要高。所以，计数时，每个样品要求重复计数2-3次(每次数值不 应相差过大，否则应重新计数)，并按公式计算出每毫升菌液所含的被囊孢子 数量。
公式所用血球计数板型号为：XB.K.25(上海求精生化试剂仪器有限公式、 0.10mm1/100mm2)，对应的计算公式为(16×25型)：
被囊孢子个数/mL＝100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍 数。
在本实施例中，选择了血球计数板计数法计数，是为了减小误差，要求每 个样品重复计数2-3次，然后取其平均值。虽然现有的孢子计数方法除了血球 计数板计数外，还有梯度稀释平皿培养计数法。但是后者操作步骤复杂一些且 用时略长，虽然准确性稍好，误差也小一些，但经试验，此法不能应用于撕裂 蜡孔菌被囊孢子的计数，因为撕裂蜡孔菌发酵液经预处理再经3～4个月的存放 后已可能含有其他杂菌，用梯度稀释平皿培养计数法培养时细菌肯定先于撕裂 蜡孔菌被囊孢子生长，同时撕裂蜡孔菌被囊孢子主要寄生于致病真菌。
本发明的撕裂蜡孔菌孢子液从斜面菌种培养到发酵罐培养，都是一个增殖 扩大培养的过程，所需要的东西是菌丝体，即初级代谢产物。发酵罐配置有搅 拌系统。现有的摇瓶培养虽然也是在振荡器上培养但摇瓶内的菌丝在培养过程 中极易结块、结球或呈结成索状，导致压差接种堵塞影响接种量，更重要的是， 上述三种异常菌丝接种后在种子罐和发酵罐培养时，同样也会结块、结球或呈 结成索状、甚至更严重，从而影响菌丝体的总产量，最终导致孢子数达不到标 准，严重影响产品质量。
因此发明人经过多种试验设计、反复试验，采取上述各种控制措施，最后 获得了比较理想的摇瓶种子培养菌丝：外观无结块、结球或呈结成索状的现象， 均匀、略有挂壁；镜检无杂菌、菌丝粗壮、有交叉但无相互缠绕的现象、染色 深、活力强。
实验一
实验目的：考察撕裂蜡孔发酵菌丝体预处理液存放相应时间后的被囊孢子 产生情况。
实验材料：生物显微镜、血球计数板、计数器、存放相应时间的菌丝体处 理液(180101、180102、180103)等。
方法及步骤：
1，按工艺要求对发酵菌丝体进行预处理，搅拌均匀后分装；
2，密封贮藏：将每一批发酵菌丝体预处理液，分别分装于HDPE材质的储 存瓶中，每一批各分装3瓶，分别为N1、N2、N3；注明批号、日期等后密闭， 置同一阴凉处存放，本次试验2次。
3，计数及结果(N×106个)
计算公式：被囊孢子个数/ml＝80个小方格细胞总数/100×400×10000 ×稀释倍数
表1：发酵菌丝体预处理液的被囊孢子个数的第一次计数结果
批号 存放时间 N1 N2 N3 平均值
180101 133天 4.42 4.28 4.60 4.43
180102 129天 4.18 4.46 4.58 4.30
180103 125天 4.52 4.16 4.28 4.35
表2：发酵菌丝体预处理液的被囊孢子个数的第二次计数结果
批号 存放时间 N1 N2 N3 平均值
180101 122天 4.26 4.38 4.50 4.38
180102 118天 4.30 4.12 4.08 4.16
180103 113天 3.92 4.08 3.88 3.96
实验一的分析与结论
计数结果表明，发酵菌丝体预处理液存放时间不同，释放的被囊孢子数也 存在差异，但存放4个月左右的时间，被囊孢子数基本能达到4百万个且批间 差异越来越小，存放时间越长，孢子数相对会多一些。
实验二
实验目的；探究发酵罐内生长情况(为了方便实验，采用500L发酵罐)
实验条件及结果：如表3-5所示，当菌丝体量不再增长或增长缓慢，并结 合如下发酵液pH值、残糖量和菌丝状况即可确定放罐。
表3：第一批菌丝体在发酵罐内的生产情况
Figure BDA0002633842130000121
表4：第二批菌丝体在发酵罐内的生产情况
Figure BDA0002633842130000131
表5：为第三批菌丝体在发酵罐内的生产情况
Figure BDA0002633842130000141
在具体的实施中，现有的发酵罐中试放大存在诸多困难和问题，首先是设 备设施的配套，其次是工艺线路与单元设备的选型及匹配，第三是工艺过程在 发酵罐上的实施(放大)。
与20t发酵罐配套的设备需有：500L种子罐及其转种管道、蒸汽产量5t/h 的蒸汽锅炉、空气产量15m3/min的空气压缩机、冷却系统、配料池以及相应 的污水处理系统等等。
工艺线路与单元设备的选型及匹配：根据配套的设备设施设计工艺线路， 要考虑发酵罐的材质与型号、搅拌桨的型式与安装方法、通气量的大小与分布， 发酵罐的装量、搅拌及通气效果、传热传质系数等等。只有适应特定设备设施 的工艺线路，才是比较好的选择。当然，还需同时考虑缩短工序简化操作、降 低成本提高收率。
工艺过程在发酵罐上的实施(放大)：匹配的工艺线路设计只是中试放大 的第一步，还需要根据经验公式估算出与装量相对应的转速及通气量，根据发 酵液粘度等特质选择与其相对应的经验公式。需要根据发酵罐现场的情况比如 泡沫情况、液面的高低与翻腾情况等，结合试验，判断发酵条件是否合适。
在本发明中，发酵过程中空气流量及转速的调控如下：
撕裂蜡孔菌的发酵生产过程为有氧发酵，上述实验二中，我们在500L发 酵罐上，非常成功地实现了其放大生产，要将500L发酵罐的成功经验移植到 20t发酵罐上，需要利用经验公式初步估算其所需的条件，具体如下：
1、空气流量的推算
经验公式①：
Figure BDA0002633842130000151
VVM1----500L发酵罐的空气流量 D1----500L发酵罐的直径
VVM2----20t发酵罐的空气流量 D2----20t发酵罐的直径
示例一
500L发酵罐的空气流量VVM1＝1:1.2vvm、D1＝900mm、D2＝2200mm,代 入经验公式①计算，
VVM2＝VVM1×(D1/D2)2/3
＝1.2×(900/2200)2/3
＝0.66
≈0.7vvm。
因此本发明的发酵罐内的空气流量为1:0.7左右较为合适。
2、发酵罐转速的推算
经验公式②：N2＝N1*(VVM1*V1*D2 2/VVM2*V2*D1 2)0.23*(d1/d2)0.54
N1----500L发酵罐的转速 VVM1----500L发酵罐的空气流量
V1----500L发酵罐的装料体积 D1----500L发酵罐的直径
d1----500L发酵罐的搅拌桨桨径
N2----20t发酵罐的转速 VVM1----20tL发酵罐的空气流量
V1----20t发酵罐的装料体积 D1----20t发酵罐的直径
d1----20t发酵罐的搅拌桨桨径
示例二
500L发酵罐的空气流量VVM1＝1:1.2vvm、罐径D1＝900mm、装量V1＝350L、 转速N1＝150rpm、桨径d1＝250mm；
20t发酵罐VVM1＝1:0.7vvm、罐径D1＝2200mm、装量V1＝12000L、桨径 d2＝670mm；
代入经验公式②计算，
N2＝150rpm×(1.22vvm×350L×22002/0.7vvm×12000L×9002)0.23×(250/670)0.54＝150rpm×0.2990.23×0.370.54
＝67rpm
≈70rpm
在实际使用中，需要根据发酵罐现场的情况比如泡沫情况、液面的高低与翻腾 情况等，结合试验，判断发酵条件是否合适；以70rpm为基准，在现场根据情 况，可以提升转速至140，或者降低至60，从而得到发酵罐转速范围为 60-140rpm。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。

Claims (10)

1.一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，包括：
斜面种子培养，在无菌条件下将撕裂蜡孔菌菌株涂布接种于斜面培养基上，得斜面菌丝；
摇瓶种子培养，在无菌条件下，挖取生长成熟的斜面菌丝，接种于摇瓶培养基中，再置于恒温培养振荡器上，振荡频率为200-260rpm，培养温度为22-30℃，培养48-90小时后得摇瓶种子液；
种子罐培养，将摇瓶种子液种入种子罐培养基中，得种子罐种子液；
发酵罐培养，将种子罐种子液压入发酵罐培养基中，得发酵罐菌丝体；
发酵液预处理，待发酵罐菌丝体发酵完毕后，对发酵罐内的发酵液进行预处理，以促进撕裂蜡孔菌被囊孢子的释放，得预处理发酵液；
密闭封存，将预处理发酵液进行分装密封存放4个月以上后得到撕裂蜡孔菌孢子液。
2.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，斜面种子培养步骤中，培养温度为22-30℃，培养时间为7-10天；
种子罐培养步骤中，振荡频率为120-200rpm，通气量为1:0.8-2.0vvm，罐压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为60-90小时；
发酵罐培养步骤中，振荡频率为60-140rpm，通气量为1:0.2-0.8vvm，罐压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为110-170小时。
3.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，斜面种子培养步骤中，斜面培养基通过以下步骤制得：
将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；
将20g葡萄糖和20g琼脂粉同时溶于上述滤液中加热搅拌；
待琼脂粉充分膨化溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；
将定容后的1000ml溶液分装于若干支试管中，每支试管装量10ml-15ml，塞住各个试管的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后，得到所述斜面培养基。
4.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，摇瓶种子培养步骤中，摇瓶培养基通过以下步骤制得：
将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；
将20g葡萄糖溶于上述滤液中加热搅拌；
待葡萄糖溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；
将定容后的1000ml溶液分装于若干三角瓶中，每瓶装量100-150ml，塞住各个三角瓶的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述摇瓶培养基。
5.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，种子罐培养步骤中，种子罐培养基通过以下步骤制得：
将6kg葡萄糖、12kg马铃薯、9kg黄豆粉和100L水置于种子罐中，搅拌至物料充分混匀后用水定容至250L；
加入0.12L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述种子罐培养基。
6.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，发酵罐培养步骤中，发酵罐培养基通过以下步骤制得：
将240kg葡萄糖、180kg黄豆粉、1.5kg磷酸氢二钾、7.2kg磷酸二氢钾、3.0kg硫酸镁、0.012kg生物素、0.012kg泛酸钙、0.024kg氯化钴置于配料池中，加入适量水搅拌均匀；
将上述混合均匀的物料送入发酵罐中，同时投入240kg马铃薯至发酵罐中，用水定容至10500L，自然pH；
加入3.6L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后制得发酵罐培养基。
7.根据权利要求6所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，将配料池中的物料混合均匀后，启动料泵将物料泵入12000L发酵罐中，分三次注入适量水冲洗配料池直至干净，冲洗液全部泵入发酵罐，同时将240kg马铃薯直接投入发酵罐中，用水定容至10500L，加入3.6L泡敌后密闭罐口，用饱和蒸汽灭菌30min，温度120～124℃；控制消后体积为12000L，制得发酵罐培养基。
8.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，发酵液预处理步骤中，待发酵罐菌丝体发酵完毕后，按发酵液体积的5-10％的比例加入氯化钠进行搅拌，从而促进被囊孢子的释放，同时氯化钠能够作为孢子保护剂，待氯化钠溶液混合均匀后制得预处理发酵液。
9.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法，其特征在于，密闭封存步骤中，将获得的预处理发酵液分装后，放入密闭阴凉处存放，存放4个月后开始取样计数，计数合格后即得撕裂蜡孔菌孢子液。
10.根据权利要求9所述的热固性形状记忆聚氨酯弹性体的制备方法，其特征在于，密封封存步骤中，采用血球计数板进行计数，计数时，每个样品重复计数2-3次。
CN202010822554.5A 2020-08-14 2020-08-14 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法 Pending CN111925947A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010822554.5A CN111925947A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010822554.5A CN111925947A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111925947A true CN111925947A (zh) 2020-11-13

Family

ID=73311916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010822554.5A Pending CN111925947A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111925947A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101990398A (zh) * 2008-04-07 2011-03-23 拜耳作物科学有限公司 稳定的含有孢子的水性制剂
US20180273894A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences Method for preparing a degradable material
CN106318876B (zh) * 2015-07-07 2019-10-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株撕裂蜡孔菌及其培养方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101990398A (zh) * 2008-04-07 2011-03-23 拜耳作物科学有限公司 稳定的含有孢子的水性制剂
CN106318876B (zh) * 2015-07-07 2019-10-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株撕裂蜡孔菌及其培养方法和应用
US20180273894A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences Method for preparing a degradable material

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
白如霞等: "撕裂蜡孔菌对黄瓜蔓枯病的防治作用及促生增产效果", 《中国农业科学》 *
邵国兵等: "撕裂蜡孔菌的发酵优化及其开放式发酵", 《食品研究与开发》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104012298B (zh) 食用菌液体种深层发酵成套制种工艺及其培养基配方
CN106011022B (zh) 一种玫瑰黄链霉菌固体发酵培养基及其制备和发酵方法
CN107711891B (zh) 一种防治枸杞根腐病死树的方法
CN102972205A (zh) 一种食用菌和药用菌固体菌种液化的方法及其使用方法
CN103194410B (zh) 一种胶冻样类芽孢杆菌以及利用其生产复合微生物菌剂的方法
CN103484421A (zh) 一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法
CN103146624A (zh) 一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺
CN107523524A (zh) 一种防治番茄黄萎病的复合菌剂及其制备方法和应用
CN105481486B (zh) 利用秸秆和滤泥生产木霉生物有机肥的方法及获得的产品
CN101984827B (zh) 助植物生长菌剂及其制备方法
CN103525748B (zh) 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法
CN103614445B (zh) 一种利用菌体蛋白替代部分酵母粉的金霉素发酵生产方法
CN106010975A (zh) 一种生产蜜环菌种的方法
CN107384824A (zh) 秸秆快腐剂
CN103333851A (zh) 一种哈茨木霉固体发酵生产分生孢子的方法
CN102219567B (zh) 一种以沼液为基础培养基发酵生产生物有机肥的方法
CN101195807A (zh) 木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法
CN102399702A (zh) 一种黑曲霉及其应用及发酵制备柠檬酸的方法
CN108383653A (zh) 一种使用秸秆制备肥料的方法及生物有机肥料
CN107746810A (zh) 一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法
CN103881930A (zh) 一种白僵菌的固体培养基以及白僵菌的培养方法
CN111925947A (zh) 一种撕裂蜡孔菌孢子液的制备方法
CN111925948B (zh) 一种撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法及应用
CN102648714B (zh) 液体发酵制备生物农药的方法
CN115181706A (zh) 一种畜禽粪便堆肥的微生物菌剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201113