CN111920869B - 协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方、制备方法及用途。一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，其组成包括:黄芪、人参、熟地、当归、白芍、川芎，所述的黄芪的重量份数为18‑20份，所述的人参的重量份数为10‑15份，所述的熟地的重量份数为12‑15份，所述的当归的重量份数为10‑12份，所述的白芍的重量份数为8‑12份，所述的川芎的重量份数10‑12份。本发明用于协同化疗药物治疗荷瘤小鼠。

Description

协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方、制备方法及用途。
背景技术
黑色素瘤为来源于黑色素细胞的一种恶性肿瘤，是临床上常见的皮肤肿瘤，可发生于黑色素细胞存在的任何解剖部位，且呈高度恶化性、易转移性、预后性差等生物学特性。白种人是黑色素瘤高发人群，我国虽然不属于黑色素瘤高发国家，但近年来我国黑色素瘤每年新增病例约2万例，且呈逐年上升的趋势。黑色素瘤死亡率占皮肤恶性肿瘤的第一位，5年生存率不足5％，给患者健康和社会经济带来巨大的影响。目前，晚期黑色素瘤多采用免疫治疗和靶向治疗两种手段，而且联合治疗是肿瘤治疗未来发展的方向，如免疫治疗与靶向治疗联合、多种免疫药物联合、多种靶向药物联合、免疫治疗与其他药物联合、靶向治疗与其他药物联合等。
环磷酰胺属于氮芥类抗肿瘤药物，体外无活性，其体内代谢产物与细胞DNA发生烷化作用，从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。环磷酰胺是广谱抗肿瘤药物，对恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病等均有效，且是目前应用的各种免疫抑制剂中作用最强、应用最多的药物之一。然而环磷酰胺发挥抗肿瘤作用的同时也会对正常组织细胞造成一定的损害作用，如骨髓抑制、出血性膀胱炎、心脏毒性、胃肠道反应、免疫力低下等。目前针对肿瘤放化疗产生的毒副作用多推崇中西药联合治疗，一方面中西医结合治疗具有很好的协同作用，另一方面中医根据症状开具方剂，可降低西药的毒副反应，增强机体免疫力，提高机体抗肿瘤的能力。
目前已有很多研究表明升白汤能够缓解恶性肿瘤放化疗后所致的白细胞减少症，如益气升白汤治疗非小细胞肺癌化疗后白细胞减少症【向薇,谢雨洮,张惠.益气升白汤治疗非小细胞肺癌化疗后白细胞减少症的临床疗效.现代肿瘤医学,2019,27(12):2117-2121.】、扶正升白汤治疗乳腺癌化疗后白细胞减少症【董万斌,席江伟,刘斌,苏心镜.扶正升白汤治疗乳腺癌术后化疗不良反应的临床效果观察.中国妇幼保健,2016,31(14):2827-2829.】等，目前对升白汤的研究多集中在对恶性肿瘤化疗后所致白细胞减少症的治疗作用，虽然升白汤研究较多，但由于中药汤剂疗效标准不一致、医生经验的不同各升白汤成分也不尽相同。
虽然有很多研究表明升白汤能够缓解多种恶性肿瘤化疗后所致的白细胞减少症，但到目前为止，尚未有报道称升白汤能够协同环磷酰胺具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够协同环磷酰胺抗肿瘤活性的中药组合物，并防治环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞减少症，该发明涉及协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方、制备方法及用途。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，其组成包括:黄芪、人参、熟地、当归、白芍、川芎，所述的黄芪的重量份数为18-20份，所述的人参的重量份数为10-15份，所述的熟地的重量份数为12-15份，所述的当归的重量份数为10-12份，所述的白芍的重量份数为8-12份，所述的川芎的重量份数10-12份。
所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为20份，所述的人参的重量份数为15份，所述的熟地的重量份数为15份，所述的当归的重量份数为12份，所述的白芍的重量份数为12份，所述的川芎的重量份数12份。
所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为18份，所述的人参的重量份数为10份，所述的熟地的重量份数为12份，所述的当归的重量份数为10份，所述的白芍的重量份数为8份，所述的川芎的重量份数10份。
所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为20份，所述的人参的重量份数为15份，所述的熟地的重量份数为15份，所述的当归的重量份数为12份，所述的白芍的重量份数为12份，所述的川芎的重量份数8份。
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的制备方法，其制备方法为：按照上述比例配比取68-86份生药，第一煎，1200mL水浸泡30min，继续煎煮90min，煎出180-220mL药液；第二煎，加入900mL水，继续煎煮90min，煎出约220-230mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物。
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，中药组合物形成抗肿瘤药物汤剂，药物制剂包含中药组合物，还包含药学的辅料。
所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，所述的肿瘤选自黑色素瘤、肝癌或肠癌；所述肿瘤为黑色素瘤。
所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，所述的药物制剂是以除环磷酰胺外所述的中药组合物作为唯一活性成分。
有益效果
1.本发明的升白汤成分依据本院医生多年临床经验总结所治，不仅能够协同环磷酰胺增强其抗肿瘤活性，而且还升高环磷酰胺化疗所致的白细胞减少，为临床化疗提供新方向。
2.本发明采用的黄芪具有补中益气、健脾益肺、托毒生肌的功效；人参具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津止渴，安神益智之功效；熟地具有补血养阴，填精益髓之功效；当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效；白芍具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效；川芎具有活血行气，祛风止痛之功效。
3.本发明构建了黑色素瘤小鼠模型，该中药组合物经灌胃给药后能够协同环磷酰胺对黑色素瘤具有抗肿瘤作用，并能够防治环磷酰胺所致的白细胞减少症，可用于肿瘤化疗药物的协同给药，应用前景广阔；为临床治疗提供了依据。
附图说明
附图1是本产品各组小鼠血清中白细胞计数比较图。
附图2是本产品肿瘤组织病理学HE染色检测结果图。
附图3是本产品各组肿瘤组织中NF-кB表达的比较图。
附图4是本产品TUNEL染色检测细胞凋亡结果图。
ˉ
附图1中各组小鼠血清中白细胞计数比较(n＝10，X±S)。
附图2中a.Model组肿瘤组织病理学结果；b.SBDL+CTX组肿瘤组织病理学结果；c.CTX组肿瘤组织病理学结果；d.SBDH+CTX组肿瘤组织病理学结果。
附图3中a.Model组肿瘤组织NF-кB表达结果；b.CTX组肿瘤组织NF-кB表达结果；c.SBDL+CTX组肿瘤组织NF-кB表达结果；d.SBDH+CTX组肿瘤组织NF-кB表达结果。
附图4中a.Model组肿瘤组织细胞凋亡结果；b.CTX组肿瘤组织细胞凋亡结果；c.SBDL+CTX组肿瘤组织细胞凋亡结果；d.SBDH+CTX组肿瘤组织细胞凋亡表达结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，其组成包括:黄芪、人参、熟地、当归、白芍、川芎，所述的黄芪的重量份数为18-20份，所述的人参的重量份数为10-15份，所述的熟地的重量份数为12-15份，所述的当归的重量份数为10-12份，所述的白芍的重量份数为8-12份，所述的川芎的重量份数10-12份。
实施例2
实施例1所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为20份，所述的人参的重量份数为15份，所述的熟地的重量份数为15份，所述的当归的重量份数为12份，所述的白芍的重量份数为12份，所述的川芎的重量份数12份。
实施例3
实施例1所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为18份，所述的人参的重量份数为10份，所述的熟地的重量份数为12份，所述的当归的重量份数为10份，所述的白芍的重量份数为8份，所述的川芎的重量份数10份。
实施例4
实施例1所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方，所述的黄芪的重量份数为20份，所述的人参的重量份数为15份，所述的熟地的重量份数为15份，所述的当归的重量份数为12份，所述的白芍的重量份数为12份，所述的川芎的重量份数8份。
实施例5
所述中药组合物剂量计算方法，小鼠与人剂量换算：以升白汤人临床用量210g/人/天，按照体表面积换算为小鼠的等效剂量为10.66g/kg，即0.213g/20g小鼠。每只小鼠灌胃量0.2mL，折算后生药的浓度是1.1g/mL。设计升白汤低剂量组：10.66g/kg(生药浓度1.1g/mL)，升白汤高剂量组：31.98g/kg(生药浓度3.3g/mL)。
实施例6
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的制备方法，其制备方法为按照上述比例配比取68-86份生药，第一煎，1200mL(没过药面)水浸泡30min，继续煎煮90min，煎出180-220mL药液；第二煎，加入900mL水，继续煎煮90min，煎出约220-230mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物，命名为升白汤(SBD)。
实施例7
一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，中药组合物形成抗肿瘤药物汤剂，药物制剂包含中药组合物，还包含药学上可接受的辅料。
实施例8
实施例7所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，所述的肿瘤选自黑色素瘤、肝癌或肠癌；所述肿瘤为黑色素瘤。
实施例9
实施例7所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，所述的药物制剂是以除环磷酰胺外所述的中药组合物作为唯一活性成分。
实施例10
实施例6所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的制备方法，其制备方法为按照上述比例配比取68-86份生药，第一煎，1200mL(没过药面)水浸泡30min，继续煎煮90min，煎出200mL药液；第二煎，加入900mL水，继续煎煮90min，煎出约225mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物，命名为升白汤(SBD)。
本发明的中药组合物可以用于协同环磷酰胺抗肿瘤，并弥补其所致的白细胞减少症。根据本发明优选的技术方案，本发明的中药组合物能够协同环磷酰胺抗肿瘤，并能提高环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞数量减少。
实施例11
上述实施例所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的用途，
本发明的中药组合物用于协同环磷酰胺抗肿瘤活性。所述的肿瘤选自黑色素瘤、肝癌或肠癌；所述的中药组合物有包括以下组分的原料药制成：黄芪、人参、熟地、当归、白芍和川芎；所述的中药组合物为水提物。
根据本发明的用途，所述中药组合物由以下重量份数中药原料药组成：黄芪18-20份，人参10-15份，熟地12-15份，当归10-12份，白芍8-12份，川芎10-12份。本发明中优选原料药重量份为黄芪20份，人参15份，熟地15份，当归12份，白芍12份，川芎8份。
所述中药组合物剂量计算方法，小鼠与人剂量换算：以升白汤人临床用量210g/人/天，按照体表面积换算为小鼠的等效剂量为10.66g/kg，即0.213g/20g小鼠。每只小鼠灌胃量0.2mL，折算后生药的浓度是1.1g/mL。设计升白汤低剂量组：10.66g/kg(生药浓度1.1g/mL)，升白汤高剂量组：31.98g/kg(生药浓度3.3g/mL)。
根据本发明的用途，所述中药组合物采用以下方法制备：第一煎，1200mL(没过药面)水浸泡30min，继续煎煮90min，煎出约200mL药液；第二煎，加入900mL水，继续煎煮90min，煎出约225mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物，命名为升白汤(SBD)。
本发明中，所述肿瘤选为黑色素瘤。所述高剂量中药组合物联合选磷酰胺组给药10天后能够明显升高血液中白细胞数量；与对照组相比，中药组合物联合磷酰胺组能够明显降低肿瘤质量以及血清中炎性因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平；
根据本发明的用途，所述药物制剂是以除环磷酰胺外所述中药组合物作为唯一活性成分。
实施例12
上述实施例所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的制备方法，中药组合物组成：黄芪20克，人参15克，熟地15克，当归12克，白芍12克，川芎8克，共82g生药。
小鼠与人剂量换算：以中药组合物人临床用量210g/人/天，按照体表面积换算为小鼠的等效剂量为10.66g/kg，即0.213g/20g小鼠；每只小鼠灌胃量0.2mL，折算后生药的浓度是1.1g/mL；设计中药组合物低剂量组：10.66g/kg(生药浓度1.1g/mL)，中药组合物高剂量组：31.98g/kg(生药浓度3.3g/mL)。
中药组合物煎煮法配制：第一煎，1200mL(没过药面)水浸泡30min，继续煎煮90min，煎出约200mL药液；第二煎，加入900mL水，继续煎煮90min，煎出约225mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物，命名为升白汤(SBD)。
实施例13
上述实施例所述的一种协同化疗药物治疗荷瘤小鼠的中药组方的制备方法，实验材料：
1.实验试剂
环磷酰胺，200mg/支，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；小鼠黑色素瘤细胞B16F10，实验室保存；FBS、RPMI1640细胞培养液，索莱宝，购自苏州中化药品工业有限公司；苏木精染色液，购自无锡市江原实业技贸总公司；伊红染液(醇溶性)，购自珠海贝索生物技术有限公司；中性树胶，购自中国上海懿洋仪器有限公司；大鼠白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒，购自上海蓝基生物科技有限公司；NF-кB抗体，购自博士德；甲醛、乙醇、二甲苯，购自天津市凯通化学试剂有限公司。
实验仪器
酶标仪，BioTek SYNERGY H1；CO2培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；生物显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；全自动组织脱水仪，天津爱华医疗器械有限公司；包埋仪，天津爱华医疗器械有限公司；切片机，德国SLEE；光学显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司。
细胞株
小鼠黑色素瘤细胞B16F10，实验室保存；
1.4实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号SCXK(鲁)20140007。
所有动物按要求进行检疫，检疫期间,观察动物的活动、饮食等表现，动物在试验前需检查合格，检疫合格的动物方可用于试验。
实验动物饲养管理的环境条件：室温20～26℃，日温差≤4℃，相对湿度40～70％，明暗交替时间为12/12h。动物饲养于标准小鼠盒中，每笼5只。
检疫期及实验期，自由摄食、饮水。饲料为SPF级大小鼠生长繁育饲料，由江苏省协同医药生物工程有限公司生产。饮用水是经过高温消毒的城市自来水。
2.动物模型的构建
2.1小鼠黑色素瘤细胞B16F10复苏、传代与收集
细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中，反复摇动使其融化，用75％消毒乙醇消毒冻存管表面，将其转移至超净工作台中。将冻存管中的细胞悬液转移至无菌离心管中，加入RPMI1640细胞培养液，1000rpm离心5min，弃上清。用10％FBS-RPMI1640细胞培养液重悬细胞，反复吹打后，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
细胞传代：细胞生长至对数生长期时，贴壁生长的B16F10细胞平铺面积达到瓶底80-90％，弃去培养基。用PBS清洗三遍，加入0.25％的胰酶消化细胞3min，用10％FBS-RPMI1640细胞培养液终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，加入含10％FBS-RPMI1640细胞培养液重悬细胞，吹打均匀，按1:3的比例稀释细胞悬液，分装于3个细胞培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
细胞收集：培养24h后，弃去培养基，用PBS清洗三遍后用0.25％胰酶消化细胞，用含10％FBS-RPMI1640细胞培养液终止消化后1000rpm离心5min，弃上清，加入RPMI1640细胞培养液吹打均匀，细胞计数器计数，调整细胞浓度至5x105个/mL。
2.2黑色素瘤小鼠模型的构建、分组、给药及取材
C57BL/6小鼠适应性喂养5d后，每只小鼠背部正中线靠下接种注射黑色素瘤细胞悬液0.1mL。次日将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型(Model)组、环磷酰胺(CTX)组、升白汤低剂量与环磷酰胺合用(SBDL+CTX)组、升白汤高剂量与环磷酰胺合用(SBDH+CTX)组，Model组灌胃给予等体积蒸馏水；CTX组腹腔注射50mg/kg CTX；合用组在每日腹腔注射CTX的同时，每日灌胃对应剂量升白汤，给药体积为0.1mL/10g.bw，连续给药三周。
给药期间，每5d眼眶取血，检测白细胞浓度。
末次给药后第2天摘眼球取血，离心取血清-80℃冻存；脱臼处死荷瘤小鼠，剥离瘤体称重，计算肿瘤的抑制率，肿瘤抑制率＝(1-各给药组肿瘤质量/模型组肿瘤质量)×100％。将肿瘤组织用4％多聚甲醛溶液固定备用。
3.实验方法
3.1ELISA法检测血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α含量
保存于-80℃冰箱的血清样品按照如下步骤进行ELISA检测血清IL-6、IFN-γ和TNF-α含量。
1)使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50μL于反应孔内。
3)加入稀释好后的标准品50μL于反应孔、加入待测样品50μL于反应孔内。立即加入50μL的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5)每孔加入80μL的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7)每孔加入底物A、B各50μL，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8)取出酶标板，迅速加入50μL终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9)在450nm波长处测定各孔的OD值。
10)根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线，计算样品中各因子的量。
3.2组织病理学检查
各组肿瘤组织用4％多聚甲醛中固定后，依次进行常规脱水、石蜡包埋、切片烤片(5μm)、HE染色。显微镜下(×100)观察组织病理变化并拍照。
3.3免疫组化法检测相关蛋白的表达
采用免疫组化法对每组肿瘤组织中核转录因子-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)蛋白表达水平进行测定，免疫组化(IHC)染色后摄片，所摄的图像视野中出现的黄色或淡黄色染色颗粒则为阳性信号。
3.4TUNEL染色检测细胞凋亡
各组肿瘤组织石蜡切片脱蜡、水合，乙醇水合，处理好后浸入磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K工作液，室温混合作用30min。浸置PBS中漂洗，浸入封闭液，室温下10min，PBS漂洗，滤纸吸干，加TdT酶反应液，于37℃中避光湿润60min，荧光胶封片，镜下观察，激发波长450～500nm，发射波长515～565nm。计算5个高倍镜下(×200)凋亡细胞数，每百个细胞中的凋亡细胞数表示凋亡指数，每组取平均值。
3.5数据统计处理方法
所有实验数据以均数
Figure GDA0003471188040000121
即
Figure GDA0003471188040000122
表示，SPSS统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05判定为有显著性差异。
实验结果
本发明利用黑色素瘤细胞B16F10构建了小鼠黑色素瘤模型，通过上述实验评估了中药组合物是否能够协同环联酰胺具有抗肿瘤活性，实验结果如下所述：
4.1中药组合物联合环磷酰胺对小鼠血液中白细胞的影响
血常规检测结果显示：与模型组相比，CTX组小鼠血液中白细胞数量明显减少，且有显著性差异(P＜0.01)，与CTX组相比，SBDL+CTX组、SBDH+CTX组小鼠血液中白细胞数量有所上升，其中SBDL+CTX组在给药20d时白细胞数量上升明显(P＜0.01)，SBDH+CTX组在给药10d时呈现出明显差异(P＜0.05)，见附图1。
4.2中药组合物联合环磷酰胺对小鼠肿瘤大小的影响
实验结果显示：与模型组相比，给药组小鼠肿瘤重量明显减小，且有显著性差异(P＜0.05)，CTX组、SBDL+CTX组、SBDH+CTX组抑瘤效果明显，抑瘤率分别为65.24％、74.39％、85.98％，其中SBDH+CTX组抑瘤效果最好，见表1，各组小鼠抑瘤率比较(n＝10，
Figure GDA0003471188040000131
)。
表1
Figure GDA0003471188040000132
注：与模型组相比，*P＜0.05
4.3升白汤联合环磷酰胺对小鼠血清中炎症因子含量的影响
ELISA结果显示：与模型组相比，CTX组、SBDL+CTX组、SBDH+CTX组小鼠血清中IL-6含量明显减小，且有显著性差异(P＜0.01)，其中SBDH+CTX组炎性因子含量最低，效果最好。IFN-γ、TNF-α结果与IL-6类似，见表2各组小鼠血清中炎症因子含量比较(n＝10，
Figure GDA0003471188040000133
)。
表2
Figure GDA0003471188040000134
注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
4.4组织病理学检测结果
对于HE染色镜下观察可见，模型组瘤体细胞由大量瘤细胞和少量胶原纤维组成，瘤细胞排列较密集，呈梭形、圆形或不规则形，可见大量核分裂现象，瘤组织内有大量散在的大小不等的、含黑色素的瘤细胞；CTX组、SBDL+CTX组、SBDH+CTX组较模型组瘤细胞数量明显减少，细胞萎缩，组织内胶原纤维明显增多，核分裂现象减少，且瘤组织结构改变程度为SBDH+CTX组大于SBDL+CTX组大于CTX组，见附图2。
4.5免疫组化法检测肿瘤组织中核转录因子-кB(NF-кB)蛋白表达结果
染色后镜下观察，各组均可见NF-кB强弱不同的阳性表达，且主要在胞浆中表达；在各组中模型组阳性表达最弱，CTX组较模型组相比，阳性表达量明显增强；SBDL+CTX组和SBDH+CTX组与CTX组相比阳性表达进一步增强，且SBDH+CTX组阳性表达率强于SBDL+CTX组，见附图3。
4.6TUNEL检测各组细胞凋亡结果
TUNEL染色后镜下观察，可见阳性因子主要在胞核中表达，模型组中阳性表达较弱，可见凋亡细胞量较少；CTX组、SBDL+CTX组、SBDH+CTX组较模型组细胞凋亡明显增多，且这三组中细胞凋亡呈逐渐增强的趋势，而且SBDH+CTX组肿瘤组织出现大面积细胞凋亡，见附图4。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种协同化疗药物治疗荷黑色素瘤小鼠的中药组合物，该中药组合物由下述重量份的原料制成: 黄芪、人参、熟地、当归、白芍、川芎，其特征是：所述的黄芪的重量份数为18-20份，所述的人参的重量份数为10-15份，所述的熟地的重量份数为12-15份，所述的当归的重量份数为10-12份，所述的白芍的重量份数为8-12份，所述的川芎的重量份数10-12份；
其制备方法为：按照上述比例配比取68-86份生药，第一煎，1200 mL水浸泡30 min，继续煎煮90 min，煎出180-220 mL药液；第二煎，加入900 mL水，继续煎煮90 min，煎出约220-230 mL药液，混合第一煎及第二煎药液，浓缩，干燥，得到所述中药组合物。
2.根据权利要求1所述的一种协同化疗药物治疗荷黑色素瘤小鼠的中药组合物，其特征是: 所述的黄芪的重量份数为20份，所述的人参的重量份数为15份，所述的熟地的重量份数为15份，所述的当归的重量份数为12份，所述的白芍的重量份数为12份，所述的川芎的重量份数12份。
3.根据权利要求1所述的一种协同化疗药物治疗荷黑色素瘤小鼠的中药组合物，其特征是:所述的黄芪的重量份数为18份，所述的人参的重量份数为10份，所述的熟地的重量份数为12份，所述的当归的重量份数为10份，所述的白芍的重量份数为8份，所述的川芎的重量份数10份。
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