CN111920809A

CN111920809A - 苯噻啶及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN111920809A
Application number: CN202010922771.1A
Authority: CN
Inventors: 刘康栋; 董子钢; 何鑫宇; 赵继敏; 江亚南
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN111920809B

Abstract

本发明公开苯噻啶及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是苯噻啶及苯噻啶苹果酸盐（分子式:C₂₃H₂₇NO₅S，分子量:429.53，CAS号：5189‑11‑7）在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。本申请通过实验证实苯噻啶苹果酸盐用于食管鳞状细胞癌细胞（KYSE150细胞、KYSE450细胞）时，能够起到抑制食管鳞状细胞癌细胞生长和转化的作用，且苯噻啶苹果酸盐能够抑制食管鳞状细胞癌细胞或增殖和转化的适宜浓度为2.5μM‑20μM。

Description

苯噻啶及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及苯噻啶及其盐在制备肿瘤中预防和治疗的应用。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)的统计，每年有超过1400万新确诊癌症病人，并有800万死亡病例与癌症相关。全球范围内发病率排名前10的癌症有肺癌(13%)、乳腺癌(11.9%)、结肠直肠癌(9.7%)、前列腺癌(8%)、胃癌(6.8%)、肝癌(5.5%)、宫颈癌(3.7%)、食管癌(3.2%)、膀胱癌(3%)和非霍奇金淋巴瘤(2.7%)。全球范围内，每年约有140万上消化道恶性肿瘤（食管癌和胃癌）新发病例，死亡约112万人，仅次于肺癌。在上消化道恶性肿瘤新发病例中，74.36%发生在欠发达地区，44.60%发生在中国。上消化道恶性肿瘤的发病率和死亡率随年龄增长而增加，男性高于女性，欠发达地区高于发达地区。中国是食管癌和的高发区。在中国，食管癌发病率与死亡率存在地区差异，农村地区高于城市地区。食管癌高发区为河北省磁县、河南省林州市、山西省阳城县、山东省肥城市、江苏省扬中市和淮安市楚州区。

食管癌居世界癌症死因顺位的第6位。2012年全球约有45.6万食管癌新发病例和40万死亡病例，其中发展中国家的发病和死亡病例均占全球的80%以上。（Torre LA, BrayF, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin,2015, 65(2):87-108.）食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）是食管癌的两个主要组织学类型。ESCC是发展中国家最常见的亚型，但在美国和其他西方国家食管癌主要是EAC。近年来，尽管食管癌早期诊断、早期发现技术有了很大进步，标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，但大多数临床中晚期病人的整体生存率仍无明显改善，提示了仅强调肿瘤早期发现和治疗而忽视肿瘤预防，结果收效甚微。

化学药物治疗是肿瘤治疗的传统方法之一，在肿瘤治疗中占有重要的地位。目前，临床常用的抗肿瘤药物存在疗效欠佳，毒副作用大等缺点,而研发新的抗肿瘤药物具有耗时长、投入大等问题。近年来有研究发现，大量临床安全性明确且已被广泛应用于临床的非抗肿瘤药物也可能具有抗肿瘤作用，如黄芪、雷公藤、二甲双胍、阿司匹林等。

苯噻啶及其盐主要用于典型和非典型性偏头痛，能减轻症状及发作次数，疗效显著，但对偏头痛急性发作无即刻缓解作用。也可试用于红斑性肢痛症、血管神经性水肿、慢性荨麻疹以及房性和室性早搏等。本品毒性小，可长期服用。该药在抑制食管癌增殖生长的作用方面目前无报道，也无相关的专利申请。

发明内容

本发明的目的在于提供苯噻啶及其盐在医药技术领域中的新用途，即苯噻啶苹果酸盐在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是其用作食管癌的治疗和预防药物。

基于上述目的，本发明采取如下述技术方案：

本发明涉及一种FDA批准药物苯噻啶苹果酸盐，分子式:C₂₃H₂₇NO₅S ，分子量: 429.53，CAS号：5189-11-7，其结构式如下，为直接购买普通市售产品，

。

所述抗肿瘤药物包括苯噻啶，苯噻啶在药学上可接受的盐、酯或它们的组合或与其他化合物、药物的组合物。

“抗肿瘤药物”可应用于预防肿瘤发生、治疗肿瘤、预防肿瘤复发。所述抗肿瘤药物包括霜剂、片剂、胶囊、丸剂、可分散粉剂、粒剂、栓剂、糖浆剂、配剂、锭剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。所述抗肿瘤药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾或吸入。

进一步的，苯噻啶苹果酸盐在浓度为2.5μM -20 μM 时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150和/或KYSE450的增殖及克隆形成的数量和大小。

苯噻啶苹果酸盐在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用，在20 mg/kg/天-100 mg/kg/天，能够抑制人源肿瘤异种移植瘤的生长。

其中，苯噻啶，苯噻啶在药学上可接受的盐、酯或它们的组合，人每天的合适剂量范围为0-30 mg/kg/天，动物为相应的换算剂量。

总之，当用以治疗肿瘤病人时，苯噻啶苹果酸盐或其药用盐是以占总组合物重量的约0.5%至约90%的浓度，即以足以提供所需单位剂量的量存在。

苯噻啶苹果酸盐作为一种止痛药物已经应用于临床，不需要进行临床安全评估，具有很好的应用前景。在体外对食管癌药物处理，通过影响食管癌生长情况来对苯噻啶苹果酸盐在食管癌、以及其他肿瘤中的应用进行判定。结果表明，适当浓度的苯噻啶苹果酸盐对于食管癌增殖以及克隆形成的数量及大小有抑制作用，为该药物在食管癌、以及其他肿瘤的治疗和预防中提供了新的思路和参考借鉴的可能性。

附图说明

图1为苯噻啶苹果酸盐在对食管鳞癌细胞抑制作用，其中，苯噻啶苹果酸盐在浓度范围为:0-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线；

图2为苯噻啶苹果酸盐在对食管鳞癌细胞抑制作用，其中，苯噻啶苹果酸盐在浓度范围为:0-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE450的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线；

图3为苯噻啶苹果酸盐抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低。图中为对加药以及对照组克隆数量的统计结果。

图4为苯噻啶苹果酸盐抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤的生长。患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠加药处理28天，小鼠肿瘤块拍照对比结果。

图5为苯噻啶苹果酸盐抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤的生长。患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠加药处理28天，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果。

图6为苯噻啶苹果酸盐抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤的生长。患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠加药处理28天，小鼠体内肿瘤体积统计结果。

图1至6中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1.材料

1.1细胞与试剂

食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室，本发明使用了1例人食管癌组织标本，编号为EG20。患者来源于河南省肿瘤医院，男性，46岁，病例分期T2N0M0II，中分化。

苯噻啶苹果酸盐粉末美国ABMOLE

青霉素华北制药股份有限公司

链霉素山东鲁抗医药股份有限公司

RPMI-1640 培养基以色列 Biological Industries 公司

DMEM 培养基以色列 Biological Industries 公司

0.25%胰酶上海碧云天生物科技有限公司

无血清细胞冻存液苏州新赛美生物科技有限公司

DAPI 北京索莱宝科技有限公司

琼脂粉美国 B&D 公司

PBS 粉末北京索莱宝科技有限公司

BME 粉末美国 SIGMA-ALDRICH

L-谷氨酰胺北京索莱宝科技有限公司

NaHCO₃天津市凯通化学试剂有限公司

多聚甲醛粉天津市光复精细化工研究所

胎牛血清美国 BI 公司

0.4％戊巴比妥钠国药集团化学试剂有限公司

1.2仪器与器材：

1.5ml 离心管美国 Axygen 公司

15ml 离心管美国 Corning 公司

96 孔细胞培养板无锡耐思生物科技有限公司

10 cm 细胞培养皿无锡耐思生物科技有限公司

15 cm 细胞培养皿美国 Thermo Fisher Scientific 公司

一次性移液管广州洁特生物过滤股份有限公司

In Cell Analyzer 6000 美国 GE 公司

移液器美国 Gilson 公司

干燥 CO₂培养箱上海一恒科学仪器有限公司

高速低温离心机德国 Eppendorf 公司

真空抽吸泵海门市其林贝尔仪器制造有限公司

倒置显微镜德国 Carl Zeiss Jena 公司

雪花制冰机日本 SANYO 公司

Mili-Q 纯水仪美国 Millipore 公司

1.3实验动物

4-5周龄的SCID小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，并饲养于昼夜12 h交替的恒温恒压环境中。小鼠体重约为18-20 g时，方可进行实验。实验动物饲养于郑州大学癌症化学预防河南省协同创新中心的动物设施内，在恒温(25—27)、恒湿(45%—50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级）饲养室条件下饲养，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。

2方法

细胞悬液的制备：显微镜下观察细胞生长状态，当细胞状态良好，且细胞数量符合实验要求时，抽掉原来的培养基，用1×PBS洗2次，尽量洗去残留的完全培养基以免影响消化，每个10 cm 培养板中加入1 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养板，放入培养箱进行消化，消化结束后，显微镜下观察细胞，当细胞变圆时，轻轻拍打培养板边缘使细胞脱落，加入5 mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞呈单细胞状态，将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000 rpm离心3 min，抽去上清，向细胞沉淀中加入12 mL完全培养基，轻轻吹打使细胞分散均匀；

细胞计数：取干净的计数杯，加入19.5 mL计数液，抽取0.5 mL细胞悬液加入其中，轻轻吹打使细胞分散均匀，计数仪计数。重复计3次，求平均值，因计数前细胞悬液被稀释了40倍，故平均值乘以40即为细胞浓度；

2.1 细胞增殖实验：

实验过程为：将KYSE150细胞（3000个/每孔）；KYSE450（5000个/每孔）细胞接种于96孔板进行培养（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM，37℃，5%CO₂），16小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度苯噻啶苹果酸盐（苯噻啶苹果酸盐在培养基中的终浓度分别为0、2.5µM、5µM、10µM、20 µM），加入含药培养基培养0 h、24 h、48 h、72h、96 h后取出，用100 μl的1×PBS洗两次，100 μl的4%多聚甲醛室温固定30min后，100 μl的1×PBS洗两次，加入100 μl的DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）溶液，37℃孵育30min后，用In Cell Analyzer 6000机器拍板，统计细胞数。实验结果如图1至2所示。

2.2 软琼脂克隆形成实验：

实验过程为：将BME培养基（含10% FBS和 0.5%琼脂）铺于6孔板，3ml/每孔，待培养基凝固后，铺入混悬有KYSE150细胞（8000个/每孔）或KYSE450细胞的（8000个/每孔）上层胶（1ml的含药培养基，培养基为BME培养基，培养基中含10%FBS和0.33%的琼脂，培养基中的药物终浓度分别为0μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 µM），37℃、5%CO₂培养14天，待克隆形成后取出，利用IN Cell Analyzer 3000进行克隆计数，评价其对食管鳞癌细胞克隆形成能力的影响，结果如图3所示。

2.3 人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

食管鳞癌组织选取标准为：手术前未接受过任何放疗或者化疗治疗的病人的新鲜肿瘤组织，编号EG20，中分化，来自河南省肿瘤医院，在肿瘤组织离体后的90 min内，置于无血清的1640培养基中冷藏运送至实验室。在进行组织接种前，肿瘤组织需要用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥钠使其进入麻醉状态后，将组织切成10-15 mm³的小块，用镊子种植于小鼠颈背部皮下，等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。约3-5天后小鼠颈背部伤口愈合后，每隔固定时间测量一次小鼠肿瘤体积，待肿瘤体积达到1000 mm³时，处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下（第2代）。当移植瘤被稳定传至3代后，则证明食管癌移植瘤模型成功建立。

2.4苯噻啶苹果酸盐抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长

接种一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组组分8只以上。3组小鼠分别灌胃生理盐水，20 mg/kg/天苯噻啶苹果酸盐，100 mg/kg/天苯噻啶苹果酸盐（苯噻啶苹果酸盐溶于生理盐水制成所需药物浓度）。每4天记录小鼠肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右（约28 天），终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照，结果如图4至6所示。

实验结果

细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验结果表明，如图1、2、3所示，随着苯噻啶苹果酸盐浓度的增加，对食管鳞癌细胞增殖能力和软琼脂克隆形成能力的抑制作用增强。具体地，从图1中可以看出，当苯噻啶苹果酸盐浓度为10μM、20μM时，，在培养72h、96h后对KYSE150细胞增殖能力的抑制作用显著；从图2中可以看出，当苯噻啶苹果酸盐浓度为20μM时，在培养72h、96h后对KYSE450细胞增殖能力的抑制作用显著；并且随着处理时间延长，这种影响更加显著。从图3可以看出，苯噻啶苹果酸盐浓度为2.5μM 、5μM、10μM、20μM时，对于KYSE150细胞的克隆形成抑制作用显著，苯噻啶苹果酸盐在10μM、20μM时，对于KYSE450细胞的克隆形成抑制作用显著。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

苯噻啶苹果酸盐抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长，如图4所示小鼠肿瘤图片可观察到高剂量苯噻啶苹果酸盐组(100mg/kg)以及低剂量苯噻啶苹果酸盐组（20mg/kg）与对照组相比得到明显抑制。如图5所示，与对照组相比，苯噻啶苹果酸盐高剂量组 (100mg/kg)以及低剂量苯噻啶苹果酸盐组（20mg/kg）小鼠肿瘤重量下降显著。图6可观察到苯噻啶苹果酸盐高剂量组 (100mg/kg)以及低剂量苯噻啶苹果酸盐组（20mg/kg）的肿瘤体积和对照组相比得到明显的抑制。

综上可以看出：本发明经研究发现苯噻啶苹果酸盐能够抑制食管鳞癌KYSE150，KYSE450细胞增殖，克隆的形成。苯噻啶苹果酸盐能够抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤（EG20）生长。提示苯噻啶苹果酸盐可预防和治疗食管癌等肿瘤。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims

1.苯噻啶及其苹果酸盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，苯噻啶及其苹果酸盐在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，苯噻啶及其苹果酸盐在浓度为2.5μM~20μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，苯噻啶及其苹果酸盐在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，苯噻啶及其苹果酸盐在浓度20mg/kg—100mg/kg时能抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。