CN111918959A - 里氏木霉突变株和蛋白质的制造方法 - Google Patents

里氏木霉突变株和蛋白质的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明是包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株和使用该突变株高产蛋白质的方法。

Description

里氏木霉突变株和蛋白质的制造方法
技术领域
本发明涉及蛋白质制造能力提高了的里氏木霉的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法。
背景技术
已知里氏木霉具有高的蛋白质制造能力，到目前为止已经进行了使用相同丝状菌的蛋白质的制造的研究。里氏木霉在蛋白质之中特别是制造被分类为糖化酶的纤维素酶的能力优异，例如为了进一步提高纤维素酶制造量，进行了控制纤维素酶制造的因子的过表达、缺失。非专利文献1中，在里氏木霉的控制纤维素酶的制造的因子之中，通过使作为抑制纤维素酶的制造的转录因子的Cre1的功能降低，获得了具有高的纤维素酶制造能力的里氏木霉的突变株。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Juliano P,Single nucleotide polymorphism analysis of aTrichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in Japan,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Volume 77,2013,Issue 3,P534-543
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，作为控制里氏木霉的蛋白质制造的因子之一的转录因子已经被阐明，但考虑这不过是控制机制的一部分。因此本发明中，以探索控制里氏木霉的蛋白质制造的新的因子，获得蛋白质制造能力被强化了的里氏木霉的突变株和提供使用该里氏木霉的突变株的蛋白质的制造方法为课题。
用于解决课题的手段
本发明者考虑，如果能够阐明到目前为止未知的蛋白质制造的控制因子，则能够进一步提高里氏木霉的蛋白质的制造量，因而进行了深入研究，结果发现，通过培养使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的里氏木霉的突变株，能够提高蛋白质制造性，从而完成了本发明。
即，本发明由以下(1)～(5)构成。
(1)里氏木霉的突变株，其中，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了。
(2)根据(1)所述的里氏木霉的突变株，其中，序列号2所示的氨基酸序列中的347位和348位的2个氨基酸残基缺失了。
(3)蛋白质的制造方法，其中，包括培养(1)或(2)所述的里氏木霉的突变株的工序。
(4)纤维素酶的制造方法，其中，包括培养(1)或(2)所述的里氏木霉的突变株的工序。
(5)糖的制造方法，是由含纤维素的生物质制造糖的方法，其中，包括以下工序：
工序a：培养包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株，制造纤维素酶的工序，
工序b：使用通过工序a得到的纤维素酶培养液，将所述生物质糖化的工序。
发明的效果
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉，与该多肽的功能未降低的里氏木霉相比，蛋白质的制造能力提高。另外，通过使用本发明的里氏木霉，能够高产蛋白质。进而，在所制造的蛋白质是纤维素酶的情况下，还得到纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
具体实施方式
本发明以通过在作为本来蛋白质的制造能力优异的微生物的里氏木霉的亲本株中导入突变而进一步提高蛋白质制造能力为特征。因此，本发明中使用的里氏木霉的亲本株不限于野生株，以蛋白质制造能力提高的方式进行了改良的里氏木霉的突变株也优选作为亲本株使用，例如，里氏木霉的突变株中，可以利用通过诱变剂、紫外线照射等施加了突变处理从而蛋白质的制造性提高了的突变株作为上述亲本株。作为上述亲本株使用的突变株的具体例，可列举作为里氏木霉来源的公知的突变株的QM6a株(NBRC31326)、QM9414株(NBRC31329)、PC-3-7株(ATCC66589)、QM9123株(NBRC31327)、RutC-30株(ATCC56765)、CL-847株(Enzyme.Microbiol.Technol.10，341-346(1988))、MCG77株(Biotechnol.Bioeng.Symp.8，89(1978))、MCG80株(Biotechnol.Bioeng.12，451-459(1982))和它们的派生菌株等。其中，QM6a株、QM9414株、QM9123株可以从NBRC(NITEBiological Resource Center)获得，PC-3-7株、RutC-30株可以从ATCC(American TypeCulture Collection)获得。
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(EGR50654)登记。包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Centerfor Biotechnology Information的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起95位～277位的氨基酸残基具有“Middle domain of eukaryotic initiation factor 4G(真核起始因子4G的中间结构域)”结构域(本说明书中也有时记载为MIF4G结构域)、从N末端侧起380位～485位的氨基酸残基具有MA-3结构域。已知MIF4G和MA-3这两个结构域具有与DNA或RNA结合的功能(Biochem.44,12265-12272(2005)，Mol.Cell.Biol.1,147-156(2007))。根据这些记载推定包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽至少具有与DNA和/或RNA结合的功能。
本发明中，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能的降低，表示编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列发生突变，从而该多肽的功能降低、或功能缺失的状态。另外，除了编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列以外的碱基序列发生突变，引起包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低或表达消失的情况，也包括在包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低中。碱基序列的突变由碱基的替换、缺失、插入、重复等引起。
作为编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号1所示的碱基序列。
作为使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的具体的方法，可列举MIF4G结构域和/或MA-3结构域的全部缺失、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的一部分缺失、MIF4G结构域与MA-3结构域的立体构型关系的变化、或导入使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽全部缺失那样的突变的方法。
MIF4G结构域和/或MA-3结构域的缺失是指该结构域全部消失、一部分消失、变成全部不同的氨基酸、变成一部分不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地，是指在序列号2所示的氨基酸序列中，与上述所示的MIF4G结构域或MA-3结构域的氨基酸序列的序列同一性变为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
MIF4G结构域与MA-3结构域的立体构型关系的变化，是通过在位于MIF4G结构域与MA-3结构域之间的氨基酸序列中引起氨基酸的缺失、替换或添加的突变进行的。MIF4G结构域、MA-3结构域虽然被称为蛋白质结构域，但蛋白质结构域是构成蛋白质的序列结构的一部分、具有功能的存在。在存在多个结构域的情况下，因为由多个结构域构成的立体结构构成蛋白质的立体结构的一部分，所以如果结构域彼此的立体构型变化，则蛋白质的立体结构变化，蛋白质的功能降低。例如，链球菌属所具有的链激酶具有α结构域、β结构域、γ结构域的共计3种结构域，α结构域与β结构域通过12个氨基酸残基连接，β结构域与γ结构域通过15个氨基酸残基连接，但Biochem.Biophys.Acta.9,1730-1737(2010)中显示，通过在位于α结构域与β结构域、β结构域与γ结构域之间的氨基酸序列发生氨基酸残基的替换、添加、缺失等突变，从而链激酶的活性降低或消失。关于结构域之间的氨基酸序列的替换，记载于该文献的Table.1和Table.2，关于结构域之间的氨基酸序列的缺失、添加分别记载于Table.5和Table.6中。
如上，已知即使在构成结构域的氨基酸序列自身不发生氨基酸的缺失、替换、或添加等突变的情况下，也会通过在位于2个结构域之间的氨基酸序列发生氨基酸的缺失、替换、或添加等突变，从而蛋白质的功能降低。本发明中，位于MIF4G结构域与MA-3结构域之间的氨基酸序列是指在序列号2的氨基酸序列中从N末端侧起278位～379位的氨基酸残基之间的区域。另外，本发明中，编码位于MIF4G结构域与MA-3结构域之间的氨基酸序列的碱基序列是指在序列号1所示的碱基序列中832位～1137位的碱基序列的区域。
本发明中，作为通过在位于MIF4G结构域与MA-3结构域之间的氨基酸序列中发生缺失、替换、或添加等突变，从而包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的具体例，可列举序列号1所示的碱基序列中1039位至1044位的任一碱基缺失的突变。该碱基缺失是在位于包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的MIF4G结构域与MA-3结构域之间的氨基酸序列中347位和348位的2个氨基酸残基的缺失。推测通过该突变，连接MIF4G结构域与MA-3结构域的氨基酸序列变短，MIF4G结构域与MA-3结构域的立体的构型关系变化。
因此，作为包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的优选方式，可列举序列号2所示的氨基酸序列中的347位和348位的2个氨基酸残基缺失的里氏木霉的突变株。其中，本说明书中“347位和348位的2个氨基酸残基缺失”，是指在序列号2所示的氨基酸序列中至少该2个氨基酸残基缺失，作为优选的方式，是347位和348位的2个氨基酸的缺失的方式；除了该2个氨基酸的缺失之外MIF4G结构域和/或MA-3结构域的全部缺失、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的一部分缺失的方式。
序列号2所示的氨基酸序列中的347位和348位的2个氨基酸残基的缺失、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的全部缺失、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的一部分缺失、包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的全部缺失，可以通过对编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过利用碱基的缺失、插入、替换等的移码、终止密码子突变来进行。
另外，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的表达量的降低或表达的消失通过编码序列号2所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变来进行。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域，作为包含参与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的转录的启动子和终止子的碱基序列的具体例，可列举序列号7所示的碱基序列。
上述基因的突变导入可以使用对于本领域技术人员来说公知的利用诱变剂或紫外线照射等的突变处理、使用选择标志物的同源重组等基因重组、或者利用转座子的突变等现有的基因突变方法。
本发明的里氏木霉的突变株与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低的里氏木霉相比蛋白质的制造能力提高。如果培养本发明的里氏木霉的突变株，则与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低的里氏木霉的培养液相比，蛋白质浓度增加。另外，在蛋白质是酶的情况下，酶的比活性增加。这里，蛋白质浓度的增加率、酶的比活性的增加率只要增加就不特别限定，优选为20％以上。
另外，本发明涉及蛋白质的制造方法，包括培养所述包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的工序。
培养工序的培养基组成只要形成里氏木霉能够制造蛋白质那样的培养基组成就不特别限制，可以采用木霉属丝状菌的公知的培养基组成。作为氮源，可使用例如，多聚胨、肉汁、CSL、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加用于制造蛋白质的诱导物质。
培养方法不特别限定，可以通过例如使用离心管、烧瓶、罐式发酵罐、罐等的液体培养、使用平板等的固体培养等进行培养。里氏木霉优选在需氧条件下培养，在这些培养方法中，特别优选在罐式发酵罐、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深部培养。通气量优选为0.1vvm～2.0vvm左右，更优选为0.3vvm～1.5vvm，特别优选为0.5vvm～1.0vvm。培养温度优选为25℃～35℃左右，更优选为25℃～31℃。培养中的pH条件优选为pH3.0～7.0，更优选为pH4.0～6.0。培养时间进行到在能生产蛋白质的条件下回收的量的蛋白质积累。通常为24小时～240小时左右，更优选为36小时～192小时。
本发明中制造的蛋白质不特别限制，能够有效地制造分泌到菌体外的蛋白质，其中优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，进一步优选为纤维素酶。
本发明中制造的纤维素酶包含各种水解酶，包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为具体例，可列举通过水解纤维素链来制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分开始水解的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、水解纤维寡糖和纤维二糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、以作用于半纤维素、特别是木聚糖为特征的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、水解木寡糖的β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等。如前所述，用于确认本发明的里氏木霉突变株的蛋白质制造能力的提高的纤维素酶的比活性的提高的确认，通过这些水解酶的比活性的任一者提高来确认。
β-葡糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应10分钟。接着加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
β-木糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应30分钟。接着，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
纤维二糖水解酶比活性通过以下的方法测定。首先，在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应60分钟。接着然后，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后，以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
在通过本发明制造纤维素酶的情况下，可以在培养基中添加纤维素和/或木聚糖作为诱导物质。另外，可以添加包含纤维素、木聚糖的生物质作为诱导物质。作为含有纤维素、木聚糖的生物质的具体例，可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物分类为裸子植物和被子植物，任一种都优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、栎树、白桦等。
另外，包含纤维素和/或木聚糖的诱导物质可以使用进行了前处理的。前处理方法不特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的手法。作为进行了这样的前处理的包含纤维素和/或木聚糖的物质，可以使用浆。
培养里氏木霉的突变体而得的培养液所包含的蛋白质进行回收的方法不特别限定，可以从培养液中除去里氏木霉的菌体，回收蛋白质。作为菌体的除去方法，可列举离心分离法、膜分离法、压滤法等为例。
另外，在不从培养里氏木霉的突变体而得的培养液除去菌体而制成蛋白质的溶解液利用的情况下，优选进行处理使得里氏木霉的菌体在培养液中不能生长。作为进行处理使得菌体不能生长的方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、UV处理等。
在蛋白质是酶的情况下，可以将如上所述除去菌体或进行处理使得菌体不生长而得的培养液直接作为酶液利用。
另外，在蛋白质是纤维素酶的情况下，可以使用该纤维素酶使含纤维素的生物质糖化，从而制造糖。
本发明中使用的含纤维素的生物质中，可以使用与作为上述的诱导剂记载的包含纤维素的生物质同样的生物质、或进行了前处理的生物质。
培养本发明的里氏木霉的突变株而得的纤维素酶，培养本发明的包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株而得的纤维素酶，与培养该多肽的功能未降低的里氏木霉而得的纤维素酶相比，特别是β-葡糖苷酶等的比活性高，因而能够有效地分解含纤维素的生物质，获得葡萄糖浓度高的糖化液，能够获得更多的糖。
糖化反应的条件不特别限定，但糖化反应的温度优选为25～60℃的范围，特别更优选为30～55℃的范围。糖化反应的时间优选为2小时～200小时的范围。糖化反应的pH优选为pH3.0～7.0的范围，进一步优选pH4.0～6.0的范围。在木霉属来源的纤维素酶的情况下，其反应最适pH为5.0。进而，由于在水解的过程中发生pH的变化，因此优选在反应液中添加缓冲液，或者使用酸、碱一边保持一定pH一边实施。
在从糖化液分离回收酶的情况下，将糖化液用超滤膜等过滤，根据需要作为过滤的前工序，也可以预先从糖化液中除去能够在非透过侧回收的固体成分。回收的酶可以再次用于糖化反应。
实施例
以下列举实施例具体说明本发明。
＜参考例1＞蛋白质浓度测定方法
使用蛋白质浓度测定试剂(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio-Rad制)。在恢复室温的蛋白质浓度测定试剂250μL中添加稀释了的丝状菌的培养液5μL，用酶标仪测定室温静置5分钟后的595nm的吸光度。作为标准品使用BSA，根据标准曲线计算出蛋白质浓度。
＜参考例2＞纤维素酶的比活性的测定方法
(β-葡糖苷酶比活性测定方法)
在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应10分钟。然后加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
(β-木糖苷酶比活性测定方法)
在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应30分钟。然后，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
(纤维二糖水解酶比活性测定方法)
在含有1mMp-硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应60分钟。然后，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1U，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
＜参考例3＞含纤维素的生物质的糖化试验
作为含纤维素的生物质，使用Arbocel(注册商标)B800(レッテンマイヤー社制)或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣。作为酶液，采集里氏木霉或里氏木霉的突变株的培养液1ml进行离心分离，回收除去菌体后的上清，进而用0.22μm的过滤器进行过滤，使用过滤而得的滤液。
(糖化反应)
作为糖化反应的缓冲液添加1M醋酸钠缓冲液100μL，作为杂菌的繁殖防止添加50g/L红霉素溶液2μL，作为糖化对象物分别添加Arbocel(注册商标)B800(レッテンマイヤー株式会社制)或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣0.1g，作为含纤维素的生物质使用Arbocel(注册商标)B800时，添加酶液450μL，在作为含纤维素的生物质使用甘蔗渣时，添加酶液400μL，用灭菌水定容至共计1mL，然后装入2mL管。在50℃的温度条件进行30小时糖化反应，回收将糖化物离心分离后的上清作为糖化液，添加回收的糖化液的10分之1量的1NNaOH溶液，使酶反应停止。用下述所示的UPLC测定反应停止后的糖化液中的葡萄糖浓度。
(葡萄糖浓度的测定)
关于葡萄糖，使用ACQUITY UPLC系统(Waters)，在以下条件下进行定量分析。以用葡萄糖的标准品制作的标准曲线为基础，进行定量分析。
柱：AQUITY UPLC BEH Amide1.7μm 2.1×100mm Column
分离法：HILIC
移动相：制成移动相A：80％乙腈、0.2％TEA水溶液，移动相B：30％乙腈、0.2％TEA水溶液，按照下述梯度。梯度制成达到与下述时间对应的混合比的线性梯度。
开始条件：(A99.90％、B0.10％)、开始2分后：(A96.70％、B3.30％)、开始3.5分后：(A95.00％、B5.00％)、开始3.55分后：(A99.90％、B0.10％)、开始6分后：(A99.90％、B0.10％)。
检测方法：ELSD(蒸发光散射检测器)
流速：0.3mL/min
温度：55℃。
＜实施例1＞包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉QM9414突变株I的制作
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株如下制作：作为包含编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因的DNA片段，制作了包含序列号3所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，从而制作包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到了具有包含在序列号1中1039位至1044位的碱基缺失、在序列号2中347位和348位的2个氨基酸残基缺失的氨基酸序列的多肽的里氏木霉的突变株。作为用于DNA片段导入的选择标志物，使用乙酰胺和能够分解乙酰胺的乙酰胺酶(AmdS)基因(amdS)。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包上述含序列号3所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，以将序列号4所示的合成的DNA片段用限制性酶AflII与KpnI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用按照常规方法从里氏木霉QM9414株提取出的基因组DNA、和序列号5和6所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与KpnI、MluI与SpeI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶PacI与SphI处理，用序列号3所示的得到的DNA片段转化里氏木霉QM9414株(NBRC#31329)。分子生物学的手法如Molecular cloning，laboratory manual，1St，2nd，3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene，61，165-176(1987)所记载的那样进行。将所得的里氏木霉突变株作为QM9414突变株I，在以下的实验中使用。
＜实施例2＞使用QM9414突变株I的蛋白质的制造试验
(烧瓶培养)
将实施例1中制作的QM9414突变株I的孢子用生理盐水稀释为1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表1所示的加入到50mL带挡板的烧瓶中的10mL的烧瓶培养基中，利用振荡培养机以28℃、120rpm的条件进行120小时培养。
表1
Figure BDA0002701215190000131
*5×マンデルス溶液包含7g/L(NH4)2SO4、10g/LKH2PO4、
2g/L CaCl2·2H2O、1.5g/L MgSO4·7H2O。
**10×酒石酸铵溶液包含92g/L酒石酸铵。
***微量元素溶液包含0.3g/L H3BO3、1.3g/L(NH4)6Mo7
O24·4H2O、5g/L FeCl3·6H2O、2g/L CuSO4·5H2O、
0.4g/L MnCl2·4H2O、10g/LZnC12。
(培养液的采集)
在培养开始120小时之后采集1mL培养液。将培养液在15000×g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液，在以下实验中使用。
(蛋白质浓度和纤维素酶的各种比活性的测定)
使用参考例1中记载的手法，测定培养开始第120小时的培养液中的蛋白质浓度，接着用参考例2中记载的方法测定纤维素酶的比活性。结果示于表2。
<实施例3>包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉QM9414突变株II的制作
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株如下制作：制作包含序列号8所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，从而制作包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到了在序列号1中在1206位和1207位之间插入了amdS、序列号2的功能降低了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号8所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用按照常规方法从里氏木霉QM9414株提取出的基因组DNA、和序列号9和10所示的寡聚DNA进行PCR，以将得到的扩增片段用限制性酶AflII与KpnI处理而得的DNA片段作为上游片段。另外，使用基因组DNA、和序列号11和12所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与KpnI、MluI与SpeI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号8所示的得到的DNA如实施例1所记载那样对里氏木霉QM9414株进行转化。以所得的里氏木霉突变株作为QM9414突变株II，在以下的实验中使用。
＜实施例4＞使用QM9414突变株II的蛋白质的制造试验
除了代替实施例1中制作的QM9414突变株I使用QM9414突变株II以外，通过与实施例2同样的操作、条件进行培养，测定培养液中所包含的蛋白质浓度、和纤维素酶的各种比活性。结果示于表2。
＜比较例1＞使用里氏木霉QM9414株的蛋白质的制造试验
除了代替实施例1中制作的QM9414突变株I使用里氏木霉QM9414株以外，通过与实施例2同样的操作、条件进行培养，测定培养液中所包含的蛋白质浓度和纤维素酶的各种比活性。结果示于表2。
表2
Figure BDA0002701215190000151
根据实施例2、实施例4和比较例1的结果，在以培养里氏木霉QM9414株而得的培养液中所含的蛋白质浓度作为1的情况下，QM9414突变株I的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.5、里氏木霉的突变株II的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.4。由这些结果可知，如果培养使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉，则与不降低该多肽的功能的情况相比，能够提高蛋白质的制造量。
关于纤维素酶的各种比活性，在以培养里氏木霉QM9414株而得的培养液的纤维素酶的各种比活性作为1的情况下，β-葡糖苷酶比活性为QM9414突变株I：1.3、QM9414突变株II：1.4，β-木糖苷酶比活性为里氏木霉突变株I：1.5、QM9414突变株II：1.5、纤维二糖水解酶比活性为QM9414突变株I：1.4、QM9414突变株II：1.3。由这些结果可知，培养使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉突变株而得的纤维素酶，与不使该多肽的功能降低的情况相比，不仅所生产的蛋白质的量提高，还获得了纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
＜实施例5＞使用QM9414突变株II的纤维素酶的糖化反应试验
使用实施例4中得到的QM9414突变株II的从培养开始第120小时的培养液，按照参考例3中记载的方法进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。作为含纤维素的生物质，使用Arbocel(注册商标)B800或粉末甘蔗渣。结果示于表3。
＜比较例2＞使用里氏木霉QM9414株的纤维素酶的糖化反应试验
除了使用比较例1中得到的里氏木霉QM9414株的从培养开始第120小时的培养液以外，通过与实施例5同样的操作、条件进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。结果示于表3。
表3
Figure BDA0002701215190000161
根据实施例5和比较例2的结果，Arbocel(注册商标)B800的糖化反应中，在以使用里氏木霉QM9414株的纤维素酶时的糖化液中所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用QM9414突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.8。另外，在甘蔗渣的糖化反应中，在以使用里氏木霉QM9414株的纤维素酶时的糖化液中所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用QM9414突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.4。由这些结果可知，如果使用使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的纤维素酶进行含纤维素的生物质的糖化反应，则与使用该多肽的功能未降低的里氏木霉的纤维素酶时相比，糖化液中的葡萄糖浓度提高，能够制造更多的糖。
Figure IDA0002701215230000011
Figure IDA0002701215230000021
Figure IDA0002701215230000031
Figure IDA0002701215230000041
Figure IDA0002701215230000051
Figure IDA0002701215230000061
Figure IDA0002701215230000071
Figure IDA0002701215230000081
Figure IDA0002701215230000091
Figure IDA0002701215230000101
Figure IDA0002701215230000111
Figure IDA0002701215230000121
Figure IDA0002701215230000131
Figure IDA0002701215230000141
Figure IDA0002701215230000151
Figure IDA0002701215230000161
Figure IDA0002701215230000171
Figure IDA0002701215230000181
Figure IDA0002701215230000191
Figure IDA0002701215230000201
Figure IDA0002701215230000211
Figure IDA0002701215230000221
Figure IDA0002701215230000231
Figure IDA0002701215230000241
Figure IDA0002701215230000251
Figure IDA0002701215230000261

Claims (5)

1.里氏木霉的突变株，其中，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了。
2.根据权利要求1所述的里氏木霉的突变株，其中，序列号2所示的氨基酸序列中的347位和348位的2个氨基酸残基缺失了。
3.蛋白质的制造方法，其中，包括培养权利要求1或2所述的里氏木霉的突变株的工序。
4.纤维素酶的制造方法，其中，包括培养权利要求1或2所述的里氏木霉的突变株的工序。
5.糖的制造方法，是由含纤维素的生物质制造糖的方法，其中，包括以下工序：
工序a：培养包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株，制造纤维素酶的工序，
工序b：使用通过工序a得到的纤维素酶培养液，将所述生物质糖化的工序。
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