CN111912984A - 一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用 - Google Patents

一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用，属于兽医生物诊断制品的生产和技术领域。该试纸条包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白。样本稀释液含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v；重组蛋白MGF360的序列如SEQ ID NO:4；重组蛋白CD2v的序列如SEQ ID NO:2。采用本发明试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体，可用于非洲猪瘟感染的早期检测，且特异性强，灵敏度高，稳定性好。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其 应用
技术领域
本发明属于兽医生物诊断制品的生产和技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疫病。
ASFV是一种复杂的、有囊膜的、双股DNA病毒，直径170～190kb，具有末端交联和反转重复区，其编码151-167种蛋白，成熟的病毒粒子包含有约50 多种结构蛋白。
ASFV主要经呼吸道和消化道途径侵入猪体，猪体应答感染，除了血清中产生特异性的IgG抗体外，在呼吸道与消化道黏膜还可产生特异性的sIgA抗体。 sIgA抗体主要存在于呼吸道分泌液、唾液、泪液、乳汁、胃肠分泌液和泌尿生殖道分泌液中，是机体黏膜免疫的主要抗体，也是病原体侵入后最先产生的免疫反应，常用作疾病感染早期诊断的检测指标。因此，猪感染ASFV后，其黏膜表面分泌的特异性sIgA抗体是作早期诊断的理想靶标。
目前针对ASFV防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变得至关重要。传统的诊断检测非洲猪瘟病毒抗体的方法有间接免疫荧光(IFA)、和酶联免疫法(ELISA)。其中IFA的敏感性偏低，需要荧光操作人员和荧光显微镜，成本高昂，限制了在现场快速检测中的应用。ELISA以抗原抗体特异性反应为原理检测动物是否具有非洲猪瘟病毒抗体，具有灵敏度高，特异性强等优点，但操作较为繁琐，耗时较长，加之需要酶标仪、恒温箱等设备，在基层养殖场难以展开实时检测。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，可用于非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的快速、高特异性、高灵敏度的定性检测。
本发明的第二个目的是提供配合该检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的样本稀释液。
本发明的第三个目的是提供以非诊断为目的的检测非洲猪瘟病毒CD2v和 MGF360黏膜抗体的方法，该方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的紫外光发射器，可以及时的，方便的，在现场得到结果。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白；所述非洲猪瘟阳性血清是将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360免疫兔子后所得。
在本发明中，所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白是将非洲猪瘟阳性血清采用protein G纯化试剂盒纯化后所得蛋白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11 的保藏号为：CCTCCNO：C201526。
在本发明中，所述试纸条还包括样品垫，所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液浸泡处理后所得。
本发明还提供配合所述试纸条使用的样本稀释液，含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；所述重组蛋白MGF360的序列如SEQ ID NO:4所示；所述重组蛋白CD2v的序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，将量子点微球分别与重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白 CD2v；然后将量子点微球标记的重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液按照体积比1:10-20混合，得到样本稀释液。
在本发明中，所述量子点微球与重组蛋白MGF360的质量比为3-5:1，所述量子点微球与重组蛋白CD2v的质量比为3-5:1；所述PBS缓冲液含有0.2-1.0％的酪蛋白和0.1-0.3％的Tween-20。
本发明还提供一种以非诊断为目的的采用所述试纸条和所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜抗体的方法：将拭子样品加入样本稀释液中孵育后，滴加在试纸条的样品垫，反应后，采用紫外光发射器检测C线和T线。
在本发明中，所述拭子样品包括口拭子、鼻拭子、肛拭子和肺泡灌洗液。
通过量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360与拭子样品中对应的特异性非洲猪瘟黏膜抗体sIgA结合，检测线处包被的抗猪SC蛋白单克隆抗体捕获量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360与特异性非洲猪瘟黏膜抗体sIgA的复合物，质控线处包被的非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白捕获过剩的量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360，并通过量子点微球发光显色。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，由于量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，因此使用量子点微球作为标记物制作的试纸条批次间差异较小；
2.本发明检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，制备方法简单，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的市场前景和较大的经济收益。
3.采用本发明试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体，可用于非洲猪瘟感染的早期检测，且特异性强，灵敏度高，稳定性好。
4.采用本发明试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体，检测方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的紫外光发射器，可以及时的，方便的，在现场得到结果。
5.采用本发明试纸条和样本稀释液，可用于鉴别动物所产生的非洲猪瘟抗体是源于非洲猪瘟基因缺失株产生的抗体还是野毒感染后所产生的抗体。
附图说明
图1是本发明实施例1重组蛋白CD2v的表达鉴定图，其中泳道1是纯化后的重组蛋白CD2v，泳道2是纯化后的重组蛋白CD2v和非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。
图2是本发明实施例1重组蛋白MGF360的表达鉴定图，其中泳道1是纯化后的重组蛋白MGF360，泳道2是纯化后的重组蛋白MGF360和非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。
图3是本发明检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的结构示意图，其中，1-检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，2-底板，3-样品垫、4-硝酸纤维素膜，7-吸水垫，5-检测线，6-质控线。
图4是本发明检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的剖面图。
图5是本发明检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的俯视图。
图6是非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定图，其中泳道1 是非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白，M为蛋白maker。
图7敏感性图。
图8特异性图，ASFV是非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子、PRRS是猪繁殖呼吸综合症病毒黏膜抗体阳性样品，PEDV是猪流行性腹泻病毒黏膜抗体阳性样品，PCV是猪圆环病毒黏膜抗体阳性样品，APP是猪胸膜肺炎放线杆菌黏膜抗体阳性样品，SIV是猪流感病毒黏膜抗体阳性样品。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的优选实施方式进行详细说明。此外需要理解的是，以下的实施例仅是为了对本发明作进一步说明，帮助理解。而不是用于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围不受任何实施例形式上的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，皆为常规方法。
本发明中：MES、EDC、NHS、Tween-20、蔗糖、弗氏完全佐剂、硫柳汞购自Sigma；Tris-HCl、酪蛋白购自OXOID公司；小牛血清购自Gibco；玻璃纤维膜购自Ahlstrom；硝酸纤维素膜购自Sartorius；超声波仪购自Bandelin；吸水滤纸和底板购自上海金标生物科技有限公司；Protein G亲合层析介质购自南京金斯瑞生物科技有限公司；量子点微球购自北京纳晶生物科技有限公司。
浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液配制方法：将4.265g MES溶于1L 的双蒸水中，再调节pH至7.0。
PBS缓冲液(浓度为0.01M、pH7.4)：取3g的Na2HPO4.12H2O、0.2g的 KH2PO4、8g的NaCl和0.2g的KCl溶于1L的双蒸水中，采用1M的氢氧化钠溶液或盐酸调节pH至7.4。
PBS缓冲液(浓度为50mM、pH8.0)：取15g的Na2HPO4.12H2O、1.0g的 KH2PO4、40g的NaCl和1.0g的KCl溶于1L的双蒸水中，采用1M的氢氧化钠溶液或盐酸调节pH至8.0。
实施例1重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360的制备
1.制备重组蛋白CD2v的重组菌的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟SY18全基因序列(MH766894， EP402R，73369～74451)，设计了重组蛋白CD2v的基因，序列如SEQ ID NO:1 所示，重组蛋白CD2v的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。采用基因合成的方式 (由南京金斯瑞生物科技有限公司)获得重组蛋白CD2v的基因，并将重组蛋白 CD2v的基因插入载体pET-32a(+)的多克隆酶切位点EcoRⅠ和HindIII之间，得到重组质粒pET-32a-CD2v。
通过“热激”法，将重组质粒pET-32a-CD2v转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-32a-CD2v(BL21)。
2.制备重组蛋白MGF360的重组菌的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟SY18全基因序列(MH766894， MGF360-12L，29382～30434)，设计了重组蛋白MGF360的基因，序列如SEQ ID NO:3所示，重组蛋白MGF360的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。采用基因合成的方式(由南京金斯瑞生物科技有限公司)获得重组蛋白MGF360的基因，并将重组蛋白MGF360的基因插入载体pET-32a(+)的多克隆酶切位点EcoR Ⅰ和HindIII之间，得到重组质粒pET-32a-MGF360。
通过“热激”法，将重组质粒pET-32a-MGF360转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞，获得重组菌pET-32a-MGF360(BL21)。
3.重组蛋白的表达及纯化
将重组菌pET-32a-CD2v(BL21)和重组菌pET-32a-MGF360(BL21)分别在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，培养条件如下：培养温度为37℃、摇床转速为180r/min，待OD600＝0.6～0.8时降温至20℃，30min后加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导表达，然后在20℃培养12～18小时，收集菌体。用缓冲液洗涤菌体，菌体重悬后加入PMSF(苯甲基磺酰氟)进行超声波裂解，4℃下10000r/min离心30分钟。取上清，按照Ni-NTA亲合层析介质(金斯瑞生物科技有限公司产品，Cat.No：L00250)的说明书纯化重组蛋白。从图1 的泳道1可见，纯化后的重组蛋白CD2v在30KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。从图2的泳道1可见，纯化后的重组蛋白MGF360在50KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。因此，重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360成功表达，置于-70℃以下保存备用。
4.重组蛋白的抗原性检测
将纯化的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360经SDS-PAGE电泳后转印至 NC膜，分别进行Western-bloting检测。用5％脱脂乳封闭过夜后，以体积比为1:1的非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子(采集自非洲猪瘟血清抗体阳性猪的口腔液，下同)和5％脱脂乳溶液的混合物作为一抗，在2～8℃孵育12～18小时。TBST 洗涤5次，5分钟/次。用1:20000稀释的HRP-羊抗猪酶标抗体(购自Bethyl公司产品，货号A100-102p)作为二抗，37℃孵育1.0小时。TBST洗涤5次，5 分钟/次。ECL避光显色5min。结果：重组蛋白CD2v在30KDa左右出现了特异性反应条带(如图1泳道2)。重组蛋白MGF360在50KDa左右出现了特异性反应条带(如图2泳道2)。上述结果说明，重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360 均可与非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子发生特异性反应，具有良好的抗原性。
实施例2本发明样本稀释液的制备
本发明样本稀释液：含有非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物是量子点微球标记的重组蛋白CD2v和量子点微球标记的重组蛋白 MGF360的混合物。
本发明样本稀释液的制备方法包括如下步骤：
(1)制备量子点微球标记的重组蛋白CD2v
将浓度为1.2μg/μL的量子点微球悬浮液(购自北京纳晶生物科技有限公司，产品编号为FM610C，水合粒径是120nm)与浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液以体积比为1:1混合，再加入终浓度为10mg/mL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mg/mL的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，在摇床中37℃恒温孵育25分钟。经10000g离心15分钟后，弃上清，加入量子点微球悬浮液相同体积的浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到活化的量子点微球。随后，将重组蛋白CD2v(实施例1制备)加入活化的量子点微球中，重组蛋白CD2v与活化前的量子点微球的质量比为1:4，于摇床中37℃恒温孵育2.5小时，将重组蛋白CD2v与量子点微球进行偶联，得到重组蛋白CD2v和量子点微球的偶联物。
在所得重组蛋白CD2v和量子点微球的偶联物中，加入酪蛋白粉末，使酪蛋白的终浓度(质量百分浓度)为1％，然后在摇床中37℃恒温孵育15分钟，进行封闭，经10000g离心10分钟后，弃上清，加入量子点微球悬浮液2倍体积的浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到量子点微球标记的重组蛋白CD2v溶液，置于4℃冰箱中保存。
(2)制备量子点微球标记的重组蛋白MGF360
按照本实施例标题(1)中相同方法制备量子点微球标记的重组蛋白MGF360 溶液，不同之处在于，将本实施例标题(1)中重组蛋白CD2v替换为重组蛋白 MGF360，且使重组蛋白MGF360与活化前的量子点微球的质量比为1:4。
(3)混合
配置含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20 的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。具体配置方法如下：以PBS缓冲液(浓度为 0.01M、pH7.4)为溶剂，加入终浓度为0.5％(质量百分浓度)的酪蛋白和终浓度为0.2％(体积百分浓度)的Tween-20。
将本实施例标题(1)制备的量子点微球标记的重组蛋白CD2v溶液和本实施例标题(2)制备的量子点微球标记的重组蛋白MGF360溶液以体积比为1:1 混匀，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。将含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液和非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物以体积比为15:1混匀，得到本发明样本稀释液，于4℃避光保存。
实施例3本发明试纸条的制备
如图3-5，检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条包括底板 2，在底板上依次设置样品垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫7。硝酸纤维素膜4 上设有检测线5和质控线6，检测线5靠近样品垫一侧设置，检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；质控线6靠近吸水垫7一侧设置，质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白。
1.制备非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白
(1)样品准备
将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360作为免疫原，背部皮下多点注射免疫成年新西兰大白兔(1-2Kg/只)，共免疫四次，每次免疫间隔2周。首次免疫使用重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360各1.5mg与等体积弗氏完全佐剂混合进行免疫，其中弗氏完全佐剂的体积与两种重组蛋白体积之和相等；后三次使用重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360各1.0mg与等量弗氏不完全佐剂混合免疫，其中弗氏不完全佐剂的体积与两种重组蛋白体积之和相等。第四次免疫后7d采血，离心分离，得到非洲猪瘟阳性血清，利用间接ELISA的方法检测该阳性血清针对重组蛋白CD2v或重组蛋白MGF360的抗体效价。
间接ELISA方法检测阳性血清针对重组蛋白CD2v的抗体效价，具体方法如下：用碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)配制含有2.0μg/mL重组蛋白 CD2v的包被液，以每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；弃去孔内液体，每孔再用250μL的PBST洗涤3次，每次5min，拍干。每孔加入200μL含1％酪蛋白的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液，于37℃封闭2h，弃去孔内液体，每孔用250μLPBST洗涤3次，每次5min，拍干。加入10倍梯度稀释的待检血清，每孔100μL，于37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔用250μLPBST洗涤3次，每次5min，拍干。用PBS缓冲液(浓度0.01M、pH为7.4)对HRP-羊抗兔IgG 酶标抗体(品牌是BOSTER，货号是BA1054)以稀释度为1:5000进行稀释，每孔加入100μL，37℃反应0.5h。每孔加入100μL底物显色液TMB，37℃避光作用10min；再加入50μL浓度为2mol/L的硫酸水溶液终止反应。在酶标仪上测定OD450读值，按照常规方法计算效价。其中PBST是含有0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。计算得到，非洲猪瘟阳性血清对重组蛋白CD2v的抗体效价为1∶10万。另外，采用上述相同方法，检测非洲猪瘟阳性血清对重组蛋白MGF360的抗体效价，不同之处仅在于包被液采用如下方法配制：在碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)中添加终浓度为1.0 μg/mL的重组蛋白MGF360，得到包被液。计算得到，非洲猪瘟阳性血清对重组蛋白MGF360的抗体效价为1∶20万。
生产过程中，非洲猪瘟阳性血清针对重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360 的血清抗体效价均应大于等于105。
将Wash Buffer(含有20mMNa2HPO4和0.15M NaCl的水溶液，pH7.0)与非洲猪瘟阳性血清以体积比为1:1混合，得到非洲猪瘟阳性血清稀释液。
(2)采用金斯瑞protein G纯化试剂盒(货号为L00209)从非洲猪瘟阳性血清中分离蛋白，具体方法如下：
①层析柱填充：在protein G纯化试剂盒中取0.5mL的protein G纯化介质，加入0.5mLWash Buffer(同上)，充分摇匀，然后加入到一个预先装有1mLWash Buffer的层析柱中，让填料自然沉降到柱子底部。加入5mLWash Buffer到柱中，让Buffer缓慢的流出，流速大约为1mL/min。
②过柱纯化：在上述层析柱上端缓慢地加入样品(非洲猪瘟阳性血清稀释液)，样品的流速为0.5mL/min。收集流出液。使用大约30mL的Wash Buffer 洗涤杂质，Wash Buffer流速为2mL/min，或者采用Wash Buffer洗涤到流出液在紫外检测仪280nm下的吸光值(A280值)稳定为止。洗杂完毕后，加入15mL Elution Buffer(pH为2.5、浓度为0.1M的甘氨酸水溶液)进行洗脱，Elution Buffer 流速为1ml/min，收集洗脱液，加入洗脱液体积1/10的中和Buffer(pH8.5、浓度为1M的Tris-HCl缓冲液)调节洗脱液的pH到7.4，得到非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白。
非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白的鉴定结果如图6所示，可以看到纯化蛋白在 55kDa(重链)和25kDa(轻链)处分别有一个条带，纯度达到98％。
2.样品垫的制备
将玻璃纤维采用含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的50mM、pH8.0的PBS缓冲液浸泡处理20min，然后干燥，得到样品垫。含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的50mM、 pH8.0的PBS缓冲液是以PBS缓冲液(浓度为50mM、pH8.0)为溶剂，加入酪蛋白和Tween-20后所得。
3.硝酸纤维素膜的制备
(1)将鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01 M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至1.5mg/mL，得到检测线溶液。含有3％(质量百分浓度)蔗糖的PBS缓冲液，是将蔗糖溶解在浓度为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液中所得。其中，鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备(ZL2015102397123中实施例2标题9)，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCC NO：C201526。其中含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液是以PBS缓冲液(浓度为0.01M、 pH7.4)为溶剂，加入蔗糖后所得。
(2)将非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01 M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至1.0mg/mL，得到质控线溶液。
(3)在硝酸纤维素膜上，用划膜仪喷涂检测线溶液形成T线，喷涂量为1 ug/cm；喷涂质控线溶液形成C线，喷涂量为1ug/cm。喷涂量是指每厘米长的T 线或C线上喷涂的蛋白质量。T线和C线的宽度为1mm。
(4)过夜干燥，得到喷涂了检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜。
4.试纸条的组装
按照图3-5中试纸条的结构，采用如下方法组装试纸条：在正常湿度和温度下的洁净操作台上，将处理好的样品垫3、喷涂了检测线和质控线的硝酸纤维素膜4、吸水垫7(材质为吸水滤纸)依次以2-4mm重叠黏贴在底板2上，然后送入切条机，得到宽为4±0.5mm的试纸条，即为本发明试纸条。挑取完好整齐的试纸条，放入卡壳中，压盖完成后连同1粒干燥剂放入铝箔袋中密封保存。其中底板2为PVC板。
实施例4试纸条定性检测方法及结果判定
1.采用本发明试纸条和本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜抗体的方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：用1根医用脱脂棉签伸入猪口腔，充分吸取口腔液后，放入含有1mlPBS缓冲液(浓度为0.01M、pH7.4，含0.01％硫柳汞)的EP管中，反复挤压混匀，所得溶液即为口拭子。将口拭子或口拭子采用PBS缓冲液稀释后所得的稀释液作为检测样本。
(2)取出本发明试纸条(实施例3制备)，将其放于洁净操作台上。
(3)用1mL巴氏吸管吸取检测样本，以体积比为1:1的比例与本发明样本稀释液混合，室温(20℃)孵育10min。
(4)孵育完成后，用吸管吸取3滴(每滴约30微升)，于样品垫上方，垂直状态下全部滴加。
(5)滴加完成后，等待10～15min，判定结果，30min后结果无效。
2.结果判定方法(目视法)
将反应后的试纸条采用365nm的紫外光发射器，如果试纸条的C线显色，T 线也显色时，结果判定为阳性，且T线的颜色越深，则样品中的非洲猪瘟病毒黏膜抗体效价越高。当试纸条的C线显色，T线不显色时，结果判定为阴性，样品中无非洲猪瘟病毒黏膜抗体。若试纸条的C线不显色，则该纸条的检测结果无效。
实施例5试纸条检测的特性
1.试纸条检测时的灵敏度
考察采用本发明试纸条和本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜抗体时灵敏度情况。
1)方法
将非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子(采集自非洲猪瘟血清抗体阳性猪的口腔液)用PBS缓冲液(浓度0.01M、pH为7.4)按照稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、 1:32、1:64、1:128进行稀释。
用本发明样本稀释液配合本发明试纸条，分别对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的不同稀释度的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子(采集自健康猪的口腔液)进行检测。
2)结果
本发明试纸条对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:64的稀释液检测的结果为阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液检测的结果为阴性，对非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子样品检测的结果为阴性，表明本发明试纸条对非洲猪瘟病毒黏膜抗体的检出敏感性可达1:64的稀释度。具体见图7。
2.样本稀释液中缓冲液对检测灵敏度的影响
1)对照样本稀释液1和对照样本稀释液2的配制
为了考察样本稀释液中组分对检测结果的影响，将本发明样本稀释液配制时使用的含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的 0.01M、pH7.4的PBS缓冲液，分别更换成PBS缓冲液(浓度0.01M、pH7.4)和 PBST缓冲液，分别得到对照样本稀释液1和对照样本稀释液2。其中，PBST缓冲液是含有0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。
2)检测方法
分别采用本发明样本稀释液、对照样本稀释液1或对照样本稀释液2，配合本发明试纸条，以实施例4中方法检测本实施例标题1中非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的各稀释度的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子。
3)检测结果
在使用对照样本稀释液1或对照样本稀释液2时，均在检测非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子时出现了假阳性，因此，结果不成立。采用本发明样本稀释液检测时，非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子未出现假阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:64的稀释液检测结果为阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液检测结果为阴性。
3.样本稀释液中非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物对检测灵敏度的影响
(1)按照本发明样本稀释液(实施例2)的制备方法，制备对照样本稀释液3和对照样本稀释液4，不同点仅在于：无步骤(2)，步骤(3)中将含有0.5％ (质量百分浓度)酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4 的PBS缓冲液与量子点微球标记的重组蛋白CD2v溶液以体积比为15:1混匀，得到对照样本稀释液3；无步骤(1)，步骤(3)中将含有0.5％(质量百分浓度) 酪蛋白和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液与量子点微球标记的重组蛋白MGF360溶液以体积比为15:1混匀，得到对照样本稀释液4。
(2)将本发明样本稀释液、对照样本稀释液3和对照样本稀释液4分别配合本发明试纸条，按实施例4中方法对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128的稀释液(本实施例标题1)进行检测，进行灵敏度对比试验。具体结果见表1。
表1各种方法对样品检测的结果
Figure RE-GDA0002707606330000131
由检测结果可以得出：配合本发明试纸条进行检测，采用本发明样本稀释液时，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:64的稀释液检测结果仍然为阳性；采用对照样本稀释液3或4时，均对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:16的稀释液检测结果为阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:32的稀释液检测结果为阴性。可见样本稀释液中单独使用量子点微球标记的重组蛋白CD2v或量子点微球标记的重组蛋白MGF360时，其灵敏度低于使用非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。
4.体外孵育温度和时间的影响
将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子样品进行检测，考察拭子样品与样本稀释液的孵育温度和孵育时间，对检测结果的影响。结果：当孵育温度在10～37℃之间，孵育时间在7～20min时结果均成立。选室温(20℃)作为孵育温度及10min作为孵育时间的最适条件。
5.试纸条特异性的检测
1)检测方法：
将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用实施例4中方法，检测猪圆环病毒黏膜抗体阳性样品、猪繁殖呼吸综合症病毒黏膜抗体阳性样品、猪胸膜肺炎放线杆菌黏膜抗体阳性样品、猪流感病毒黏膜抗体阳性样品、猪流行性腹泻病毒黏膜抗体阳性样品。
2)检测结果：
判定结果均为阴性，说明本发明试纸条与猪的其他病毒无交叉反应，特异性良好。
6.稳定性检测
1)检测方法：
将本发明试纸条在放入含有1粒干燥剂的铝箔袋中密封保存后，置于20℃和 37℃下分别保存10日、30日和60日，分别按照本实施例标题1中方法进行灵敏度的检验，按照本实施例标题5进行特异性的检验。
2)检测结果：
在常温(20℃)和37℃下保存10日、30日和60日的试纸条对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:64的稀释液检测结果仍然为阳性，特异性良好，无交叉反应。
实施例6本发明试纸条与胶体金试纸条的灵敏度对比
1.制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原，制成20-40nm胶体金颗粒，具体方法如下：取质量百分浓度为1％的氯金酸水溶液800mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入质量百分浓度为16％的柠檬酸三钠水溶液1mL，继续搅拌加热5-10min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水补足体积至800mL，得到20-40nm胶体金颗粒，4℃保存。
2.非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的制备：取步骤1制备的胶体金颗粒 1mL，在其中加入3.5μL浓度为0.1mol/L的K2CO3溶液以调节pH值，然后加入2.0mg的重组蛋白CD2v，混匀后静置5min，加入10μL质量百分浓度为10％的聚乙二醇2000溶液，12000rpm离心7min，弃上清，加入100μL复溶液(含有0.05M三羟甲基氨基甲烷和5％蔗糖的水溶液)，混合均匀，得到胶体金标记的重组蛋白CD2v。采用相同方法，制备胶体金标记的重组蛋白MGF360，不同之处在于将其中的重组蛋白CD2v替换为重组蛋白MGF360。将胶体金标记的重组蛋白CD2v和胶体金标记的重组蛋白MGF360以体积比为1:1混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物。
3.胶体金垫的制备：将非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物与含有0.5％(质量百分浓度)酪蛋白、0.5％(体积百分浓度)Tween-20和4％(质量百分浓度) 蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液按照体积比为1:100混合均匀，然后用于浸泡玻璃纤维30分钟，37℃干燥30分钟，得到胶体金垫。胶体金垫制备中，使用的含有0.5％酪蛋白、0.5％Tween-20和4％蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液及其与非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的体积比均是经过优化的条件。
4.试纸条组装：按照本发明试纸条的组装方法组装胶体金试纸条，不同之处在于在样品垫和硝酸纤维素膜之间设置一个上述胶体金垫(本实施例标题3中制备)，得到胶体金试纸条。胶体金试纸条的检测方法：在样品垫上滴加三滴样品 (每滴约30微升)，直接肉眼观察，当T线、C线均有显色时为阳性；当C线显色，T线不显色为阴性；当C线不显色时，结果无效。
5.本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度对比试验
对实施例5标题1中非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:2、1:4、1:8、 1:16、1:32、1:64、1:128的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子分别用本发明试纸条(配合本发明样品稀释液，检测方法同实施例4)与胶体金试纸条进行检测，检测结果如表4所示。
表4本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度的对比
Figure RE-GDA0002707606330000151
由检测结果可以看出：本发明试纸条与胶体金试纸分别对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的不同稀释度的稀释液进行检测，本发明试纸条检测稀释度为1:64的稀释液时为阳性。胶体金试纸条检测稀释度为1:4的稀释液时为阳性，检测稀释度为1:8的稀释液时为阴性，灵敏度显著低于本发明试纸条。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
南京农业大学
<120> 一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用
<130> 20200811
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白CD2v
<400> 1
atcgattatt gggtgagctt caacaagacc atcattctgg atagcaacat caccaatgac 60
aacaacgata ttaacggtgt tagctggaac ttctttaaca acagcttcaa caccctggcg 120
acctgcggta aagcgggcaa cttttgcgag tgcagcaact acagcaccag catctataac 180
attaccaaca actgcagcct gaccatcttc ccgcacaacg acgtgtttga taccacctac 240
caggtggttt ggaaccaaat cattaactat accattaagc tgctgacccc ggcgaccccg 300
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<211> 100
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白CD2v
<400> 2
Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn
1 5 10 15
Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe
20 25 30
Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe
35 40 45
Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr
85 90 95
Pro Ala Thr Pro
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<223> 重组蛋白MGF360
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100 105 110
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115 120 125
Arg Leu Thr Cys Ala Leu Cys Phe Asn Asn Val Phe Asp Leu His Glu
130 135 140
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225 230 235 240
Lys Ser Thr Asp Pro Glu Ile Ile Asp His Ala Leu Lys Asn Tyr Val
245 250 255
Ser Lys Asn Met
260

Claims (8)

1.一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，其特征在于包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白；所述非洲猪瘟阳性血清是将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360免疫兔子后所得。
2.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白是将非洲猪瘟阳性血清采用protein G纯化试剂盒纯化后所得蛋白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCC NO：C201526。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述试纸条还包括样品垫，所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液浸泡处理后所得。
4.配合权利要求1-3之一所述试纸条使用的样本稀释液，其特征在于所述样本稀释液含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；所述重组蛋白MGF360的序列如SEQ ID NO:4所示；所述重组蛋白CD2v的序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求4所述样本稀释液，其特征在于将量子点微球分别与重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；然后将量子点微球标记的重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液按照体积比1:10-20混合，得到样本稀释液。
6.根据权利要求5所述样本稀释液，其特征在于所述量子点微球与重组蛋白MGF360的质量比为3-5:1，所述量子点微球与重组蛋白CD2v的质量比为3-5:1；所述PBS缓冲液含有0.2-1.0%的酪蛋白和0.1-0.3%的Tween-20。
7.一种以非诊断为目的的采用权利要求1所述试纸条和权利要求4所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜抗体的方法：将拭子样品加入样本稀释液中孵育后，滴加在试纸条的样品垫，反应后，采用紫外光发射器检测C线和T线。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于所述拭子样品包括口拭子、鼻拭子、肛拭子和肺泡灌洗液。
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