CN111909912A

CN111909912A - 一种提升水稻穗期高温耐受性的map3k-19基因及其编码得到的蛋白和应用

Info

Publication number: CN111909912A
Application number: CN202010953189.1A
Authority: CN
Inventors: 陈薇兰; 陈非凡; 樊世军; 范文星; 袁华; 涂斌; 马炳田; 王玉平; 钦鹏; 李仕贵
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN111909912B

Abstract

本发明公开了一种提升水稻穗期高温耐受性的MAP3K‑19基因及其编码得到的蛋白和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的水稻穗期耐高温相关基因，为水稻耐高温育种和水稻温敏不育系的育种提供了新的遗传资源。

Description

一种提升水稻穗期高温耐受性的MAP3K-19基因及其编码得到的蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提升水稻穗期高温耐受性的MAP3K-19基因及其编码得到的蛋白和应用。

背景技术

近年来，世界各地稻区高温热害愈加频繁，高温相关研究也逐渐受到学者的重视，但由于作物耐热性状属于复杂的数量性状，且鉴定和评价指标较难统一，所以耐热性遗传研究进展较为缓慢(Zhao,C.等，2016)。目前水稻中耐高温机理研究已报道与高温相关基因主要涉及热激蛋白家族、转录因子类、各种酶类等(Ai-Li Qu等,2013)。

在众多信号通路中，MAPK信号通路是真核生物中极为保守和经典的三级激酶信号级联途径，由MAP3K-MAP2K-MAPK组成，其主要负责帮助生物体在受到外界胁迫时，通过依次磷酸化的级联放大将细胞表面信号传递至胞内下游应答分子，最终调控下游基因表达对外界逆境做出响应(丁洋等，2009)。水稻中属于该途径的基因共很多，多数被报道参与逆境胁迫应答，如OsMPK15(Hong等，2019)、OsMPK6(Shen等,2010)负调控水稻的稻瘟病和白叶枯病抗性，OsMPK12、OsMPK17、OsMPK13负调控水稻的褐飞虱免疫反应(Hu等，2011)，OsMPK14受到高盐、低温等多种逆境胁迫诱导(梁卫红等,2010)。至今为止，未有MAPK途径基因参与高温胁迫途径的明确报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种提升水稻穗期高温耐受性的MAP3K-19基因及其编码得到的蛋白和应用，本申请从反向遗传学的角度在水稻中首次解析了一个新的MAP3K基因MAP3K-19的生物学功能，并通过转基因实验证明该基因参与调控水稻抽穗期耐高温的途径，为水稻耐高温育种和水稻温敏不育系的育种提供了新的遗传资源。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种MAP3K-19基因在提升水稻穗期高温耐受性中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因在水稻种质资源改良中的应用。

上述基因在培育温敏不育系水稻中的应用。

一种含有上述基因的表达载体。

一种提升水稻抽穗期高温耐受的制剂，包括上述蛋白。

一种基因芯片，包括用于检测MAP3K-19基因的特异性引物，该特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。

一种筛选穗期耐高温水稻的试剂盒，包括如SEQ ID NO.3～4所示的特异性引物。

本发明的有益效果为：

1、本发明通过水稻中蛋白序列同源比对方式获得可能的功能保守新基因，并运用CRISPR/Cas9系统在粳稻背景下将其敲除，结合新的高温鉴定体系对其表型加以鉴定，最终提供了新的耐高温相关基因，为水稻耐高温研究提供了很好的研究基础。

2、本发明基因属于水稻中一个新的穗期耐高温相关基因，为水稻耐高温育种提供了新的遗传资源。

3、本发明建立了较为成熟的穗期耐高温鉴定程序和方法，为水稻耐高温鉴定提供了科学的研究方法。

附图说明

图1为本发明实施例一中水稻中MAP3K家族蛋白进化树分析；

图2为本发明实施例一中MAP3K-19基因时空表达模式；

图3为本发明实施例二中MAP3K-19基因编辑载体示意图；

图4为本发明实施例二中MAP3K-19基因敲除靶位点示意图；

图5为本发明实施例三中高温处理条件示意图；

图6为本发明实施例三中粳稻背景下MAP3K-19基因敲除后高温处理结实率变化。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例一：MAP3K家族蛋白序列同源比对分析

1.同源基因序列获得

2.进化树制作

使用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比对上述同源蛋白序列并用MEGA5.1制作进化树。序列分析结果如图1所示，水稻中MAP3K基因共23个，本申请选择对MAP3K-19展开研究，通过设计敲除实验首先验证该基因是否存在特定的生物学功能。

3.表达谱分析

利用已设计好的qPCR引物：

U800:GCAATGGACGAGGGTGCGGA；(SEQ ID NO.3)

U801:TGCGGCGAGCTCAGCCCGG；(SEQ ID NO.4)

在水稻发育不同时期不同部位取材后，分别检测MAP3K-19基因表达水平，结果如图2所示，该基因全生育期表达，尤其在孕穗期的叶片和穗子中表达较为强烈，由此暗示了该基因可能在穗期发育过程中发挥一定的功能。

实施例二：MAP3K-19基因编辑载体构建

1.基因编辑位点设计

根据本实验室现有的CRISPR/Cas9构建方法，在MAP3K-19第一外显子上选择含有CGG作为识别位点的GTGCGCGAGGTGGGCGGATTCGG序列作为MAP3K-19的敲除靶位点(图2)，期望获得功能丧失型转基因植株以明确MAP3K-19基因功能。

2.CRISPR/Cas9载体构建

先将10μM靶位点前后引物各5μL混合后99℃退火5min获得含双链敲除位点的序列，然后利用Bas1(NEB公司)边酶切边连接(37℃)，将靶位点序列连至中间载体pYLsgRNA-OsU6a上，随后利用通用扩增引物CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(UF)和CGGAGGAAAATTCCATCCAC(gR-R)分别与靶位点后引物和前引物结合使用，经过PCR扩增从中间载体pYLsgRNA-OsU6a上获取含有靶位点的一大一小两个片段，然后经过一次overlapping将两个片段融合，最后再次利用Bas1(NEB公司)边酶切边连接(37℃)3个小时将融合片段连接至终载体pylcrispr/Cas9P35S-N(15011bp)，构建成功的终载体如图3所示。

3.大肠杆菌转化

将大肠杆菌细胞T1感受态(全式金)从-80℃取出后置于冰上解冻，待细胞溶解后迅速加入上一步连接产物，用移液枪轻轻混匀后冰上静置30分钟，随后42℃热激30秒，再次冰上静置2分钟，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，37℃200rpm培养50分钟取出，4000rpm离心后去掉大部分上清，剩余液体(约100μL)将菌体重悬后涂板(LB+卡那霉素抗性)，37℃过夜静置培养后挑取单克隆菌落扩大培养3mL(LB+卡那霉素抗性)，通用引物(SP-L1:GCGGTGTCATCTATGTTACTA)测序验证靶位点序列获得阳性克隆。

4.农杆菌转化

将农杆菌EHA105细胞感受态(化转法制备)从-80℃取出后置于冰上解冻，加入阳性克隆质粒2μL，轻轻混匀后置于冰上30分钟，随后液氮中冻2分钟，迅速取出置于37℃金属浴中将细胞溶解2分钟，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，28℃250rpm培养2-3小时取出，5000rpm离心后去掉大部分上清，剩余液体(约100μL)将菌体重悬后涂板(LB+利福平+卡那霉素)，28℃过夜静置培养后挑取单克隆菌落，用G418引物检测获得阳性克隆并扩大培养3mL(LB+利福平+卡那霉素)待用。

5.水稻遗传转化

取日本晴种子500颗左右，无菌水和50％次氯酸钠依次清洗后滤纸吸干水分，用NMB培养基诱导愈伤发生；接着将备用的农杆菌菌液扩大培养50mL，5000rpm收集菌体后用加入AS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基重悬菌体，然后将挑选好的愈伤浸润在重悬的菌体环境下约30分钟，后吸去菌体，愈伤在培养基上继续培养2天；培养后的愈伤无菌水和含头孢霉素的无菌水分别清洗后，置于选择培养基上约三周；最后分别用分化培养基继续诱导愈伤生根，待苗高约10cm时，可在室内炼苗准备后续检测和移栽。

实施例三：粳稻日本晴背景下MAP3K-19基因编辑

1.转基因苗检测

农杆菌侵染转化共获得15株苗子，首先用G418检测引物检测载体转化情况，接着用跨靶位点的扩增引物U524(GGACGTGGCCAGGGGGCTCG)+U525(CATGTCGCTCCACGGC)将所有转化阳性单株中序列扩增后送擎科测序公司测序，结果如图4所示，获得序列经过比对分析显示共获得1种蛋白翻译提前终止的敲除植株。

2.表型调查

在T1代种植中，将转基因株系分3次田间实验重复种植，每个重复种植2行，首先测序检测确认靶位点存在稳定突变。考察农艺性状时，每个重复去掉边行和杂株，选择5-10株稳定株系，考察单株农艺性状，并进行统计学分析。结果显示，稳定株系的敲除后代农艺性状几乎无明显变化。

3.穗期高温处理

考虑到该基因可能很大程度上与植物逆境胁迫应答关联，且表达谱实验显示该基因在穗发育过程中高度表达，首先设计了穗期高温处理实验(处理条件如图5所示)。经过开花期为期2天的高温处理后，后代单穗结实率统计结果显示(如图6所示)，敲除株系的结实较野生型发生了大幅度降低。由此表明，MAP3K-19基因可能是一个新的穗期耐高温基因。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种提升水稻穗期高温耐受性的MAP3K-19基因及其编码得到的蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcggtgg cggtggcggc ggcggcggcg gtgagcaggc aatggacgag ggtgcggacg 60

ctggggcgcg gggcgtccgg ggcggaggtg ttcctggcgg cggacgacgc gtcgggggag 120

ctgttcgccg tcaagtccgt gggcgcggcg ggcgcggcgg cgctgaggcg ggagcagggg 180

gtgatggccg ggctgagctc gccgcacgtc gtcccctgca tcggcggacg cgtggggcgc 240

gacgggtcgt accagatgtt cctcgagttc gcccccggcg ggtcgctcgc cgacgtggcg 300

gcgaggtgcg gcgggcggat ggaggagtgc gccgtcgggg agtacgcggt ggacgtggcc 360

agggggctcg cgtacctcca cgggatgggg ctggtgcacg gggacgtcaa ggcgaggaat 420

gtcgtgatcg gcggcgacgg ccgggcgaag ctcgcggact tcgggtgcgc gaggtgggcg 480

gattcgggcc ggccgatcgg cggcacgccg gcgttcatgg cgcccgaggt cgcgcgcggg 540

gaggagcaga gcccagccgc cgacgtctgg gcgctcggct gcacggtcat cgagatggcc 600

accggccgcg cgccgtggag cgacatggac gacgtgctcg cggcggtgca ccggattggc 660

tacacggagg ccgtccccga ggtccccggt tggctgtccg ccgacgcgaa ggacttcttg 720

gccaggtgct tgcaacggcg ccccattgac cggagcacgg cggcgcagct gctagaacac 780

ccgttcgtcg cctccgccgc cggcgacggc aagccggagg ccgcgaagtc caaatgggtg 840

tcccccaaga gcaccctgga cgccgcattg tgggagtccg acaccgacga ggaggaagac 900

gacgagctgt cgcagagcac ggccgagagg atcggttcac tggcctgcgc cgcctcgtcg 960

ctgccggatt gggactccga cgacggctgg atcgatgtga tctccacccc taccgaagaa 1020

tcctgcgaga ccaccacctc gccggccgac gaggagacga cgactgacct caacggcgac 1080

atcagaaccg cagaattcga gcttccccac attgacgtgg acagcggcaa tggcaacacc 1140

acccacaatg tgggagaagc caatgctcag cacattattt ccccttcgaa tttagttttc 1200

gatcaagtac tatgtaaaac accattttgt aacaaacaca ttgcaattga attcatacca 1260

tgttttctcc tcacaaatgt ttttctcccc ctttcgctgc tctgttcata cgctcctcac 1320

ccttag 1326

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Arg Gln Trp Thr

1 5 10 15

Arg Val Arg Thr Leu Gly Arg Gly Ala Ser Gly Ala Glu Val Phe Leu

20 25 30

Ala Ala Asp Asp Ala Ser Gly Glu Leu Phe Ala Val Lys Ser Val Gly

35 40 45

Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Arg Arg Glu Gln Gly Val Met Ala Gly

50 55 60

Leu Ser Ser Pro His Val Val Pro Cys Ile Gly Gly Arg Val Gly Arg

65 70 75 80

Asp Gly Ser Tyr Gln Met Phe Leu Glu Phe Ala Pro Gly Gly Ser Leu

85 90 95

Ala Asp Val Ala Ala Arg Cys Gly Gly Arg Met Glu Glu Cys Ala Val

100 105 110

Gly Glu Tyr Ala Val Asp Val Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Gly

115 120 125

Met Gly Leu Val His Gly Asp Val Lys Ala Arg Asn Val Val Ile Gly

130 135 140

Gly Asp Gly Arg Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly Cys Ala Arg Trp Ala

145 150 155 160

Asp Ser Gly Arg Pro Ile Gly Gly Thr Pro Ala Phe Met Ala Pro Glu

165 170 175

Val Ala Arg Gly Glu Glu Gln Ser Pro Ala Ala Asp Val Trp Ala Leu

180 185 190

Gly Cys Thr Val Ile Glu Met Ala Thr Gly Arg Ala Pro Trp Ser Asp

195 200 205

Met Asp Asp Val Leu Ala Ala Val His Arg Ile Gly Tyr Thr Glu Ala

210 215 220

Val Pro Glu Val Pro Gly Trp Leu Ser Ala Asp Ala Lys Asp Phe Leu

225 230 235 240

Ala Arg Cys Leu Gln Arg Arg Pro Ile Asp Arg Ser Thr Ala Ala Gln

245 250 255

Leu Leu Glu His Pro Phe Val Ala Ser Ala Ala Gly Asp Gly Lys Pro

260 265 270

Glu Ala Ala Lys Ser Lys Trp Val Ser Pro Lys Ser Thr Leu Asp Ala

275 280 285

Ala Leu Trp Glu Ser Asp Thr Asp Glu Glu Glu Asp Asp Glu Leu Ser

290 295 300

Gln Ser Thr Ala Glu Arg Ile Gly Ser Leu Ala Cys Ala Ala Ser Ser

305 310 315 320

Leu Pro Asp Trp Asp Ser Asp Asp Gly Trp Ile Asp Val Ile Ser Thr

325 330 335

Pro Thr Glu Glu Ser Cys Glu Thr Thr Thr Ser Pro Ala Asp Glu Glu

340 345 350

Thr Thr Thr Asp Leu Asn Gly Asp Ile Arg Thr Ala Glu Phe Glu Leu

355 360 365

Pro His Ile Asp Val Asp Ser Gly Asn Gly Asn Thr Thr His Asn Val

370 375 380

Gly Glu Ala Asn Ala Gln His Ile Ile Ser Pro Ser Asn Leu Val Phe

385 390 395 400

Asp Gln Val Leu Cys Lys Thr Pro Phe Cys Asn Lys His Ile Ala Ile

405 410 415

Glu Phe Ile Pro Cys Phe Leu Leu Thr Asn Val Phe Leu Pro Leu Ser

420 425 430

Leu Leu Cys Ser Tyr Ala Pro His Pro

435 440

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaatggacg agggtgcgga 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcggcgagc tcagcccgg 19

Claims

1.MAP3K-19基因在提升水稻穗期高温耐受性中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述基因在水稻种质资源改良中的应用。

4.权利要求1所述基因在培育温敏不育系水稻中的应用。

5.一种含有权利要求1所述基因的表达载体。

6.一种提升水稻抽穗期高温耐受性的制剂，其特征在于，包括权利要求2所述的蛋白。

7.一种基因芯片，其特征在于，包括用于检测MAP3K-19基因的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。

8.一种筛选穗期耐高温水稻的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.3～4所示的特异性引物。