CN108004218A

CN108004218A - 一种控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用

Info

Publication number: CN108004218A
Application number: CN201810051691.6A
Authority: CN
Inventors: 涂斌; 胡丽; 李佳莲; 李仕贵; 马炳田; 王玉平; 钦鹏; 陈薇兰; 郑灵
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108004218B

Abstract

本发明公开了一种控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明通过图位克隆的方法定位到了一个新基因OsPK3并利用CRISPR/Cas9系统对该基因OsPK3进行敲除后形成转基因突变株系，突变体植株与野生型相比，均表现出种子粒厚变小，千粒重显著降低，株高变矮，说明该基因是控制水稻千粒重的基因，可用于水稻高产、稳产育种。

Description

一种控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用

技术领域

本发明属于基因工程及遗传育种技术领域，具体涉及一种控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，是全球一半以上人口赖以生存的基本食粮。然而，随着人口的不断增长，耕地面积的急剧减少，粮食生产仍然面临着巨大压力，因此通过进一步提高水稻单位面积产量是解决这一问题的重要途径，对保证我国粮食安全、促进农业经济发展具有举足轻重的意义。有效穗数、每穗粒数和千粒重是构成水稻产量的三个基本要素。千粒重是由粒长、粒宽和粒厚共同决定的，而粒厚主要受到籽粒灌浆充实度的影响。长期以来，粒长、粒宽和粒厚一直是作物育种改良的重要目标，对产量和外观品质有很大的影响。因此，对于作为实现高产育种目标的重要组成因子之一千粒重相关功能基因的挖掘及其作用机理的研究，并将其应用于水稻等禾谷类作物高产品种的培育，具有重要的理论意义和生产应用潜力。

水稻重要产量相关性状基因的定位、克隆和功能分析，有助于水稻产量性状的分子遗传改良，提高水稻单产。在过去20年，随着DNA标记和基因组测序技术的快速发展，水稻粒重相关基因的定位和克隆取得了巨大的进展。这些被克隆的基因可以根据其突变体的表型分为2大类。第一类克隆的粒重基因主要通过调控籽粒形状包括粒长、粒宽来影响粒重，如：GW2、PGL1、PGL2、 GS3、GL3.1、qSW5/GW5、GS5、TGW6、GW6a、GL7/GW7和GW8/SPL16等，这些基因的突变会改变籽粒形状使千粒重发生改变。第二类克隆的粒重基因主要通过调控籽粒灌浆充实度来影响粒重，如GIF1、OsAGPase、OsBT1、OsSSIIIa、OsPho1等。这些粒重基因的克隆与功能分析为基于改良粒型，提高稻谷产量与品质的分子设计育种提供了越来越多的基础材料，但目前并未见基因OsPK3具有控制水稻千粒重功能的报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种控制水稻千粒重的基因 OsPK3及应用，该基因具有控制水稻千粒重的功能，能够用于水稻改良，提高其产量和品质。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种控制水稻千粒重的蛋白质OsPK3，该蛋白质的氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

一种编码上述蛋白质的基因OsPK3，该基因的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(2)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供了包含控制水稻千粒重基因OsPK3的质粒。

本发明还提供了包含控制水稻千粒重基因OsPK3的植物表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括控制水稻千粒重基因 OsPK3，作为优选，该宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

本发明提供控制水稻千粒重的基因OsPK3的用途，用于改良水稻千粒重、稻米品质和产量。

本发明提供的控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用，具有以下有益效果：

本发明通过图位克隆的方法定位到了一个新基因OsPK3，并利用 CRISPR/Cas9系统对该基因OsPK3进行敲除后形成转基因株系，该转基因株系与野生型相比，均表现出种子粒厚变小，千粒重显著降低，且株高变矮，说明基因OsPK3可控制水稻千粒重，可用于水稻高产、稳产育种。

附图说明

图1为野生型和突变体植株及籽粒表型图。

图2为野生型和突变体植株及籽粒参数柱形图。

图3为野生型和突变体种子的生理指标测定结果图。

图4为OsPK3基因的图位克隆图，其中，A为OsPK3的精细定位图；B是 OsPK3的基因结构。

图5为OsPK3基因在水稻全生育期时空表达谱分析结果图。

图6为crispr/cas9系统载体图谱。

图7为OsPK3基因crispr/cas9靶位点信息图。

图8为OsPK3敲除转基因株系表型及考种数据结果图。

图9为OsPK3敲除转基因株系考种数据结果图。

具体实施方式

通过图位克隆的方法定位到一个新基因，该基因命名为OsPK3，核苷酸序列如SEQID NO：2所示或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/ 或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在突变体中该基因的第223位碱基处插入了一个C碱基，从而导致编码氨基酸的移码突变，并在第90位氨基酸处发生了提前终止。基因OsPK3功能丧失后与野生型相比，株高变矮，种子粒厚变小，千粒重显著降低(如图1和图2 所示，图1中b上面一行为WT，下面一行为OsPK3；c中左边为WT，右边为OsPK3；d中左边为WT，右边为OsPK3)；在种子生理指标方面，突变体种子中总淀粉含量、直链淀粉及总蛋白质含量均低于野生型植株，可溶性糖高于野生型植株，说明OsPK3基因可能通过影响种子中营养物质组成来控制其千粒重的。此外，本发明还检测了OsPK3基因在水稻全生育期的表达情况，由此可知， OsPK3基因呈组成型表达，在水稻所有组织中均有表达，但在叶片中的表达量最高，说明OsPK3基因可能会同时影响水稻源器官和库器官的物质代谢，最终导致千粒重变化。

本发明还利用CRISPR/Cas9系统对该基因OsPK3进行敲除后形成转基因株系，并研究了水稻OsPK3基因功能丧失后，转基因植株的表型，验证了该基因在水稻中的生理功能，转基因植株与野生型相比，均表现出种子粒厚变小，千粒重显著降低，株高变矮，说明基因OsPK3可控制水稻千粒重，可用于水稻高产、稳产育种。

实施例1野生型和突变体种子生理指标测定

(1)水稻材料

野生型材料为粳稻品种Dong jin，突变体为ospk3(pyruvate kinase 3)。

(2)野生型和突变体种子生理指标测定

①总淀粉和可溶性糖含量测定

称取0.1g粉碎过100目筛的烘干样品，置于10ml的离心管中，加入5ml 的蒸馏水，于沸水中提取30min，冷却后于4500r/min离心5min，吸取上清液，向沉淀中加水5ml，沸水浴中提取10min，再于4500r/min离心4-5min，吸取上清液，合并2次上清液于10ml离心管中并用蒸馏水定容至10ml，用于可溶性糖含量测定。

向沉淀中加水2ml，混匀，在沸水浴中糊化15min，不时搅拌，冷却后，加入2ml冷的9.2mol/L高氯酸，不时搅拌，提取15分钟后加水4ml，混匀，于 4500r/min离心5-8min，将上清液倒入10ml离心管中用蒸馏水定容至10ml，用于淀粉含量测定。

吸取样液0.1ml加蒸馏水1.90ml，向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和 5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度。根据标准曲线换算出样品中的淀粉和可溶性糖含量。

②直链淀粉含量测定

本实验采用megzyme公司试剂盒测定。

③蛋白含量测定

准确称取稻米粉0.5克，放入研钵中，加2ml 0.1mol/L NaOH溶液，研磨成匀浆，转入到10ml离心管中，再用6ml 0.1mol/L NaOH溶液分三次洗涤研钵，洗液一并转入10ml离心管中，用玻璃棒搅拌，放置30min，放置过程中间断搅动数次，然后于3500r/min离心15min，上清液转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得碱溶性蛋白。将上述沉淀用70％乙醇重复提取，操作步骤同上，得醇溶性蛋白。测定：吸取提取液0.1ml，放入10ml具塞刻度试管中，加5ml 考马斯亮兰G-250试剂，混匀，放置2分钟，用10mm光径的比色杯在595nm 波长下比色(比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂混合)，记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的蛋白质浓度。

上述野生型和突变体种子生理指标测定结果见图3，由图3可知，突变体种子中总淀粉量、直链淀粉及总蛋白质含量均低于野生型植株，可溶性糖高于野生型植株，说明基因Ospk3可能会影响种子中营养物质组成，进而控制水稻千粒重。

实施例2OsPK3基因的图位克隆

(1)遗传分析及定位群体

采用ospk3与Nip(Nipponbare)构建F2群体，以及ospk3和野生型Dongjin 回交，再通过图位克隆的方法，利用SSR微卫星多态性标记对基因Ospk3进行初步定位，然后再对该基因进行精细定位，其结果见图4。

F2群体遗传分析表明，2个F2群体株高均表现为3:1的分离比，表明突变体可能受一对隐性单基因控制。通过ospk3与Nip的F2群体、近等基因池和SSR 微卫星多态性标记，将该基因定位到水稻第4号染色体RM1113-RM127之间，进一步开发Indel标记，将该基因精细定位于AI45和AI51标记之间的57KB的区间内，在这个区间内共有10个ORFs，其中第8个ORF(LOC_Os04g58110) 编码丙酮酸激酶蛋白，测序后发现突变体中的LOC_Os04g58110这个基因的第 223位碱基处插入了一个C碱基，从而导致编码氨基酸的移码突变，并在第90 位氨基酸处发生了提前终止。

图位克隆中用到的实验方法如下：

①CTAB法提取DNA，依次包括以下步骤：

取0.5g新鲜植物叶片置于研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成均匀粉末。

将粉末移入1.5mL离心管，加入500ul CTAB分离缓冲液，上下颠倒混匀。

将盛有样品的离心管置于65℃水浴中保温30min，其间每隔3-4min轻摇混匀。

加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，上下颠倒离心管，混合均匀；静置10min，低温12000rpm离心5min，将上层水相转移至已加有500ul冰无水乙醇的新离心管中，混匀，静置10min。

低温12000rpm离心5min去上清，加入500ul 70％乙醇洗涤沉淀，常温 12000rpm2min，去上清，沉淀尽量干燥。

用200ul ddH₂O溶解待用。

②PCR扩增体系及程序

反应体系：

PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸 1min，共34个循环，最后72℃完全延伸5min。

(2)OsPK3基因在水稻全生育期时空表达谱分析

提取水稻根、茎、叶、叶鞘、幼穗、颖壳和开花后3d、6d颖果中RNA，反转录后利用QPCR进行表达量分析，其结果见图5，由图5可知，OsPK3基因呈组成型表达，在水稻所有组织中均有表达，但在叶片中的表达量最高，因此该基因可能会同时影响水稻源器官和库器官的物质代谢，最终导致千粒重变化。实施例3OsPK3的crispr/cas9敲除载体构建及遗传转化

(1)向导RNA(guide RNA，gRNA)靶位点序列的设计与选择

根据OsPK3的基因组序列(如SEQ ID NO：2所示)，设计选择并合成2个 OsPK3的向导RNA靶序列。

(2)两靶位点CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建

将(1)中合成的向导RNA靶序列的寡核苷酸链在95℃变性，然后移至室温冷却完成退火形成双链，再分别与pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA中间载体混合，加入BsaⅠ内切酶和T4连接酶及buffer，接着置于PCR仪上37℃5min， 20℃5min，5个循环进行酶切连接，之后再经过两轮PCR获得2个分别含有这两个靶位点的gRNA表达盒，然后通过Golden gatecloning的方法将gRNA表达盒依次装载到CRISPR/Cas9载体上，得到2个靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体，其crispr/cas9系统载体图谱见图6，OsPK3基因crispr/cas9靶位点信息见图7。

(3)遗传转化

将Dong jin种子(糙米)经经次氯酸钠溶液灭菌后置于诱导培养基上，约2 周后将诱导出的愈伤挑下进行继代培养，1周后挑取生长旺盛的愈伤用于农杆菌浸染。

将带有2个靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体转入农杆菌菌株EH105中，挑单克隆摇菌，浸染愈伤组织，在黑暗条件下25℃共培养3天，然后转移到含有G418 抗生素的筛选培养基上筛选10天左右。将筛选出的愈伤转移至分化培养基上进行培养，待长成正常幼苗后移出试管进行移栽。最后取植株叶片提DNA，通过 PCR对靶位点进行扩增测序，确定突变方式，共获得了3种不同突变方式(如图7所示)的敲除转基因株系(KO1，KO2，KO3)，其表型及考种数据结果见图8、图9。

由图8和图9可知，转基因植株与野生型相比，均表现出种子粒厚变小，千粒重显著降低，株高变矮，说明基因OsPK3可控制水稻千粒重，可用于水稻高产、稳产育种。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种控制水稻千粒重的基因OsPK3及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asn Ile Asp Met Gly Lys Ile Leu Ala Gly Leu Glu Asn Asp

1 5 10 15

Asp Ala Arg Val Pro Lys Thr Lys Leu Val Cys Thr Leu Gly Pro Ala

20 25 30

Ser Arg Ser Val Pro Met Leu Glu Lys Leu Leu Arg Ala Gly Met Asn

35 40 45

Val Ala Arg Phe Asn Phe Ser His Gly Thr His Glu Tyr His Gln Glu

50 55 60

Thr Leu Asp Asn Leu Arg Gln Ala Met His Asn Thr Gly Val Leu Cys

65 70 75 80

Ala Val Met Leu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Phe Leu

85 90 95

Lys Asp Gly Lys Pro Ile Lys Leu Thr Lys Gly Gln Glu Leu Thr Val

100 105 110

Thr Thr Asp Tyr Glu Ile Lys Gly Asp Glu Asn Met Ile Thr Met Ser

115 120 125

Tyr Lys Lys Leu Pro Val Asp Val Lys Pro Gly Asn Val Ile Leu Cys

130 135 140

Ala Asp Gly Thr Ile Ser Leu Thr Val Leu Ser Cys Asp Pro Lys Ala

145 150 155 160

Gly Thr Val Arg Cys Arg Cys Glu Asn Thr Ala Met Leu Gly Glu Arg

165 170 175

Lys Asn Cys Asn Leu Pro Gly Ile Val Val Asp Leu Pro Thr Leu Thr

180 185 190

Glu Lys Asp Lys Glu Asp Ile Leu Gly Trp Gly Val Pro Asn Asp Ile

195 200 205

Asp Met Ile Ala Leu Ser Phe Val Arg Lys Gly Ser Asp Leu Val Thr

210 215 220

Val Arg Gln Leu Leu Gly Gln His Ala Lys Arg Ile Lys Leu Met Ser

225 230 235 240

Lys Val Glu Asn Gln Glu Gly Val Val Asn Phe Asp Glu Ile Leu Arg

245 250 255

Glu Thr Asp Ala Phe Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Met Glu Ile

260 265 270

Pro Val Glu Lys Ile Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Tyr Lys Cys

275 280 285

Asn Leu Ala Gly Lys Pro Val Val Thr Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser

290 295 300

Met Ile Lys Ser Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Ala Thr Asp Val Ala

305 310 315 320

Asn Ala Val Leu Asp Gly Thr Asp Cys Val Met Leu Ser Gly Glu Ser

325 330 335

Ala Ala Gly Ala Tyr Pro Glu Val Ala Val Lys Ile Met Ala Arg Ile

340 345 350

Cys Val Glu Ala Glu Ser Ser Leu Asp Asn Glu Ala Val Phe Lys Glu

355 360 365

Met Ile Arg Ser Ala Pro Leu Pro Met Ser Pro Leu Glu Ser Leu Ala

370 375 380

Ser Ser Ala Val Arg Thr Ala Asn Lys Ala Lys Ala Ala Leu Ile Val

385 390 395 400

Val Leu Thr Arg Gly Gly Thr Thr Ala Lys Leu Val Ala Lys Tyr Arg

405 410 415

Pro Arg Val Pro Ile Leu Ser Val Val Val Pro Val Leu Thr Thr Asp

420 425 430

Ser Phe Asp Trp Thr Ile Ser Ser Glu Gly Pro Ala Arg His Ser Leu

435 440 445

Ile Tyr Arg Gly Leu Val Pro Leu Leu Ala Glu Gly Ser Ala Lys Ala

450 455 460

Thr Asp Ser Glu Ser Thr Glu Val Ile Leu Asp Ala Ala Leu Lys Ser

465 470 475 480

Ala Val Gln Lys Gln Leu Cys Lys Pro Gly Asp Ala Val Val Ala Leu

485 490 495

His Arg Ile Gly Val Ala Ser Val Ile Lys Ile Cys Ile Val Lys

500 505 510

<210> 2

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgaaca tcgacatggg gaagatcctg gcggggctgg agaacgacga cgcgcgggtg 60

cccaagacca agctggtctg cacgctcggc ccggcctccc gctccgtccc catgctcgag 120

aagctgctcc gcgccgggat gaacgtcgcg cgcttcaact tctcccacgg cacccacgag 180

taccaccagg agaccctcga caacctccgc caggccatgc acaacaccgg cgtcctctgc 240

gccgtcatgc tcgataccaa gggtcctgag attcgtactg gatttttgaa ggatggcaag 300

ccaatcaagc taacaaaggg tcaagaactc actgttacca ccgattatga gatcaagggt 360

gatgagaaca tgattaccat gagttacaag aaactgccag ttgatgtgaa gcctggaaat 420

gtcattctct gcgccgatgg tacaatctct ttgactgttt tgtcctgtga tccaaaggct 480

ggaactgtga ggtgtaggtg tgagaacaca gcaatgcttg gcgagagaaa gaattgcaat 540

ctgccaggaa ttgttgtgga ccttcctaca ctgactgaga aggataaaga agacattttg 600

ggatggggtg tgccaaatga catagacatg attgctctgt cgtttgtccg taaaggatca 660

gatttggtta ccgtcagaca acttcttgga cagcatgcaa agcgcatcaa gctgatgtca 720

aaggttgaaa accaagaggg tgttgtaaac ttcgatgaga tcttgaggga aacggatgca 780

tttatggttg ctagaggtga tcttggaatg gagattccag ttgagaagat attccttgca 840

cagaagatga tgatttacaa gtgcaacctt gctggaaagc ctgttgtgac tgctactcag 900

atgcttgagt cgatgatcaa atcaccacgt ccaactcgtg ctgaggcaac tgacgttgca 960

aatgcagttc ttgatggaac tgactgcgtc atgcttagtg gagagagtgc tgctggagca 1020

taccctgaag tagctgtgaa gatcatggca cgtatatgtg ttgaggcaga gtcttccctt 1080

gacaacgaag ctgtcttcaa ggagatgatc aggtctgcgc cccttccgat gagcccattg 1140

gagtctctcg catcctctgc tgtacgcaca gccaacaagg ccaaggcagc cctgattgtt 1200

gtcttgactc gtggtggtac cacggcaaag ctggttgcca agtatcgtcc cagggttcca 1260

atcctctctg tggttgtccc cgtgttgaca accgattcat tcgactggac aatcagctcg 1320

gagggcccag caaggcacag cctaatctac agaggtcttg ttcctctcct ggctgagggt 1380

tctgccaaag ccaccgattc ggagtcgaca gaggtcatcc ttgatgctgc tctcaagtca 1440

gctgtacaga agcagttgtg caagcctggt gatgctgttg ttgctctgca ccgtattggc 1500

gtcgcatccg tgatcaagat ctgcatcgtg aagtaa 1536

Claims

1.一种控制水稻千粒重的蛋白质OsPK3，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

2.一种编码权利要求1所述的控制水稻千粒重的蛋白质的基因OsPK3，其特征在于，该基因的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

3.一种包含权利要求2所述基因的质粒。

4.一种包含权利要求2所述基因的植物表达载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包括权利要求1所述的基因，所述宿主细胞不包括植物细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

7.一种控制水稻千粒重的基因OsPK3在改良水稻千粒重、水稻品质和产量上的应用。