CN110183526A

CN110183526A - 一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110183526A
Application number: CN201910532038.6A
Authority: CN
Inventors: 袁华; 陈薇兰; 钦鹏; 李仕贵; 许正艳; 高鹏; 金梦雅; 涂斌; 马炳田; 王玉平; 陈郡雯
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110183526B

Abstract

本发明公开了一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的OsPPR5蛋白具有正调控水稻粒厚和千粒重的作用，能直接应用于实际生产，用于提高水稻千粒重和产量，且不影响粒长和粒宽，为水稻粒型和千粒重的基础研究以及育种利用提供了一个全新的基因资源。

Description

一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用。

背景技术

水稻作为我国最重要的粮食作物之一，是全国65％以上人口的主食，提高水稻产量对保障我国粮食安全具有重要意义。水稻产量是由单株有效穗数，单穗粒数和千粒重三大因素构成，属于典型的由多基因控制的复杂性状。

水稻千粒重主要由粒型和籽粒充实度决定，而粒型包括粒长，粒宽和粒厚三个方面。根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布数据，已经有将近500个粒型相关基因或QTL被检测到，分布于水稻12条染色体，其中第2、3和5染色体上最多。目前克隆了较多控制粒长和粒宽的基因，包括GS3、GW2、GS5、GL3.1、GW8、TGW6、GW5/GSE5、OsLG3b/LGY3、TGW3/GL3.3等，但是仅仅影响粒厚，而不影响粒长和粒宽的基因还未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用，该蛋白仅调控粒厚和千粒重，不影响粒长和粒宽，为水稻粒型和千粒重的基础研究以及育种利用提供了新的基因资源。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列经氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。

编码上述蛋白OsPPR5的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种用于敲除上述基因的CRISPR/Cas9载体。

包含敲除上述基因的靶点序列。

包含上述基因的质粒。

包含上述基因的重组表达载体。

包含上述基因的转基因细胞系。

包含上述基因的工程菌。

上述蛋白在提升水稻粒厚和千粒重中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的OsPPR5蛋白具有正调控水稻粒厚和千粒重的作用，能直接应用于实际生产，用于提高水稻千粒重和产量，且不影响粒长和粒宽，为水稻粒型和千粒重的基础研究以及育种利用提供了一个全新的基因资源。

附图说明

图1为OsPPR5敲除载体OsPPR5-BGK03结构示意图；

图2为OsPPR5敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图；其中，下划线表示PAM序列；“.”表示该位置碱基缺失；

图3为OsPPR5敲除株系粒型和千粒重考种数据；其中，标尺为3mm；“*”表示在0.05水平下差异显著；“**”表示在0.01水平下差异显著；

图4为OsPPR5敲除株系与野生型米质比较；其中，标尺为1cm；“**”表示在0.01水平下差异显著。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1：构建OsPPR5的CRISPR/Cas9敲除载体

本发明利用百格公司的CRISPR/Cas载体构建试剂盒构建OsPPR5的敲除载体，具体过程如下：

(1)利用http://skl.scau.edu.cn/网站的targetDesign在线工具，设计敲除靶位点。在网站输入OsPPR5基因核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，生成19bp的gRNA靶点序列Target1，该靶点序列如下：

Target1：5’-TACAGACCGAAGCCACCGC-3’(SEQ ID NO.3)

(2)将以上靶点序列Target1输入百格公司Oligo序列在线设计网站(http://121.41.105.238/index/excrispr)，选择水稻BGK03载体，生成与试剂盒对应的Oligo序列UP和LOW，UP和LOW序列如下：

UP：5’-TGTGTGTACAGACCGAAGCCACCGC-3’(SEQ ID NO.4)

LOW：5’-AAACGCGGTGGCTTCGGTCTGTACA-3’(SEQ ID NO.5)

由生工生物公司合成以上UP和LOW序列，然后将合成的UP和LOW引物加水溶解至10μM。

(3)按照百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒说明书进行如下操作：

步骤1：制备Oligo二聚体

配制PCR反应体系(18μL Buffer Anneal，1μL UP，1μL LOW)混匀后，用PCR仪按照如下反应程序进行：95℃加热3分钟，之后以0.2℃/秒缓慢降至20℃，冷却复性之后即得到Oligo二聚体。

步骤2：将以上Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体

在冰上配制反应体系(2μL CRISPR/Cas Vector、1μL Oligo二聚体，1μL EnzymeMix，最后加水至10μL)混匀后，室温反应1小时。

步骤3:将以上反应体系转化大肠杆菌

将大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(北京全式金生物技术有限公司)从-80℃冰箱取出，置于冰上中融化；再加入步骤2制备得到的5μL反应体系，轻轻混匀，冰上孵育30分钟(不要晃动)；之后置于42℃金属浴，热激60秒后，立刻置于冰水浴中，静置2分钟；再向离心管中加入500μL无抗LB液体培养基，37℃金属浴复苏10分钟；之后置于摇床，200rpm、37℃振荡培养1小时，使菌体复苏；吸取适当体积菌液，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的LB平板上轻轻涂匀(超净工作台进行)，于37℃培养箱倒置培养过夜。

其中，所用LB培养基配方如表1所示；

表1LB培养基配方

该LB固体培养基的制备方法为：

向表1的配方中再加入50μL浓度为100mg/mL的卡那霉素，即可配制成含有卡那霉素抗性的LB固体平板培养基。

步骤4：提取质粒，获得OsPPR5敲除载体OsPPR5-BGK03。

挑取LB固体平板培养基上生长的单克隆，并将其接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃摇床振荡培养过夜；然后利用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒(按照说明书进行)；将提取的质粒送生工生物公司进行测序验证，得到测序正确的OsPPR5敲除载体OsPPR5-BGK03(见图1)。

实施例2：OsPPR5的敲除载体转化水稻品种日本晴

(1)敲除载体质粒转化农杆菌EHA105

将以上构建好的OsPPR5敲除载体OsPPR5-BGK03的质粒转化农杆菌EHA105，农杆菌转化方法如下：

从-80℃冰箱取出EHA105感受态细胞，快速放手心化冻；加1μL质粒于1管感受态细胞中，冰上放置30分钟；液氮中冷冻2分钟；37℃水浴5分钟，溶化细胞；之后立即加入5倍体积的无抗LB培养基，置于28℃摇床，于170rpm培养2-3小时后；在7000rpm的条件下离心2分钟，然后悬浮细胞在100μL LB培养基中；涂布在含利福平以及卡那霉素抗性的LB平板(超净工作台进行)，吹干，28℃培养箱倒置培养2-3天。挑取平板上生长的单克隆摇菌，鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌液保存于-80℃冰箱备用。

(2)利用农杆菌介导法转化水稻

将上述转化农杆菌之后的敲除载体，利用农杆菌介导的方法，转化野生型水稻品种日本晴，具体的操作步骤如下：

a、诱导愈伤组织：将水稻品种日本晴的成熟种子去壳之后，用75％酒精浸泡清洗，清洗时间不超过1分钟；之后再用灭菌水清洗8次以上，继续用50％次氯酸钠清洗30分钟，并在清洗过程中适宜摇晃几次；再用灭菌水清洗8次以上；用灭菌的滤纸吸干水分，摆放于诱导培养基上；最后置于30℃光照培养箱生长7-10天，至生长出愈伤组织；之后继代培养1-2代即可选取生长状况良好的愈伤组织用于农杆菌浸染。

b、农杆菌活化：取20μL保存于-80℃冰箱的含有OsPPR5敲除载体的农杆菌，并将其接种于含卡那霉素和利福平的3mL YEP液体培养基中，然后于28℃摇床、200rpm的条件下培养至OD₆₀₀大约0.3-0.5左右后；取1mL菌液接种于新鲜的体积为50mL且含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，继续于28℃摇床、200rpm的条件下培养至OD₆₀₀大约0.3-0.5左右，最后离心收集菌液，重悬菌体于含100μM乙酰丁香酮(AS)的AAM培养基中。

c、愈伤组织与农杆菌共培养、愈伤组织抗性筛选与分化生根：将步骤a获得的愈伤组织浸入步骤b获得的AAM菌液中，侵染30分钟，并轻轻摇动；然后用灭菌的滤纸吸取多余的菌液，将浸染后的愈伤组织转移到共培养固定培养基，28℃暗培养3天；再转移至筛选培养基筛选培养2次；转移至分化培养基进行分化再生，之后转移至MS培养基进行生根壮苗；成苗之后移栽至大田，按常规大田管理，获得OsPPR5的敲除转基因植株。

实施例3：OsPPR5敲除植株的鉴定及表型分析

获得实施例2中的OsPPR5敲除转基因植株后，取叶片利用CTAB法提取基因组DNA，用于PCR检测。设计跨敲除靶位点的引物Y1211-F和Y1212-R进行扩增测序，确定敲除植株突变方式。引物Y1211-F和Y1212-R序列如下：

Y1211-F:5’-CTACTAAACGGGGCCGTAGC-3’(SEQ ID NO.6)

Y1212-R:5’-GCGTTGAGGAGGGAATGGAA-3’(SEQ ID NO.7)

PCR扩增体系(20μL)如表2所示；

表2PCR扩增体系

PCR反应条件为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸30s；共35个循环；(5)72℃延伸10min；(6)20℃延伸2min；

经测序鉴定，一共获得2种不同突变方式的OsPPR5敲除突变体株系，分别命名为KO1和KO2(见图2)。考察敲除突变体各株系粒型和米质表型，其结果见图3和图4。

图3为KO1、KO2和WT的粒型等检测结果；其中，A为粒型检测结果；B为千粒重检测结果；C为粒长检测结果；D为粒宽检测结果；E为粒厚检测结果；F为单株产量检测结果。

图4为KO1、KO2和WT的米质等检测结果；其中，A为米质检测结果；B为垩白粒率检测结果；C为垩白度检测结果。

由图3和图4的检测结果可知，与野生型日本晴(WT)相比，KO1和KO2的粒厚分别降低9.3％和8.9％，但是粒长和粒宽无显著差异，导致千粒重分别下降15.1％和14.6％，最终导致单株产量显著下降，说明OsPPR5能正调控水稻籽粒粒厚和千粒重，最终影响水稻产量。此外，考察米质发现，敲除突变体的米质显著变差，垩白粒率和垩白度均显著增加，说明OsPPR5同时还会调控稻米品质。

综上所述，OsPPR5能正调控水稻籽粒粒厚和千粒重，同时影响水稻米质，可应用于改善水稻千粒重和稻米品质，具有重要的育种利用价值。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种控制水稻粒厚和千粒重的蛋白OsPPR5及其编码基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Leu Arg Arg Arg Gly His Arg

1 5 10 15

Arg Lys Lys Phe Val Tyr Arg Pro Lys Pro Pro Pro Glu Pro His Pro

20 25 30

Phe Leu Leu His Leu Lys Ser Leu Pro Ser Pro Val Ala Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Leu Leu Ser Ala Pro Arg Arg Leu His Asp His Pro Phe Ala Ala

50 55 60

Cys Val Leu Tyr Arg Leu Ala Arg Ala Arg Leu Phe Pro Leu Val Pro

65 70 75 80

Pro Leu Leu Ala Ala Leu His Ser Arg Gly Ala Pro Leu Arg Pro Thr

85 90 95

Val Phe Ala Ala Val Ile Asp His Leu Gly Ala Ala Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Ala Ala Val Gly Val Phe Arg Thr Val Pro Ala Phe Cys Ser His Ser

115 120 125

Ala Ala Thr Phe His Ser Leu Leu Asn Ala Leu Val Ser Asn Gly Arg

130 135 140

Thr Asp Ala Ala Arg Asp Met Leu Pro Leu Ala Pro Lys Leu Gly Val

145 150 155 160

Arg Leu Asn Ala Val Ser Tyr Asn Ile Ile Leu Lys Gly Ala Cys Leu

165 170 175

Arg Asp Gly Phe Met Gly Ala Arg Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Ser

180 185 190

Arg Gly Val Arg Pro Thr Val Val Thr Phe Asn Thr Leu Val Gly Ser

195 200 205

Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Gly Ala Ala Glu Arg Leu Ile Asp Glu

210 215 220

Met Ala Arg Arg Gly Val Ala Pro Asn Ala Ala Thr Tyr Ala Leu Leu

225 230 235 240

Met Arg Gly Leu Cys Asp Ala Asp Arg His Ala Asp Ala Glu Lys Leu

245 250 255

Met Phe Asp Met Glu Tyr Arg Gly Cys Gln Ala Asp Val Val Asn Tyr

260 265 270

Gly Val Leu Met Ser Ser Arg Ala Arg His Gly Asp Ala Asp Gly Val

275 280 285

Arg Glu Leu Leu Ser Ala Met Arg Lys Arg Lys Leu Lys Pro Asp Asp

290 295 300

Ala Ser Tyr Asn Ile Leu Ile Arg Cys Leu Cys Asp Ala Gly Arg Ala

305 310 315 320

Asp Glu Ala His Arg Ala Leu Leu Glu Met Gln Leu Arg Gly Thr Val

325 330 335

Pro Gly Ala Ala Thr Tyr Arg Val Leu Val Asp Gly Cys Cys Arg Ala

340 345 350

Arg Asp Phe Asp Leu Gly Leu Arg Val Phe Asn Ala Met Met Ala Ser

355 360 365

Gly His Cys Pro Gln Ala Arg Thr Phe Arg His Leu Ala Arg Gly Leu

370 375 380

Gly Glu Asp Gly Lys Ala Glu Glu Ala Phe Phe Val Leu Glu Gln Met

385 390 395 400

Ala Arg Arg Glu Met Ser Leu Asp Ala Asp Gly Trp Gln Ala Val Val

405 410 415

Thr Cys Val Arg Ser Ser Cys Ser Thr Gln Ala Ser Glu Ile Lys Leu

420 425 430

Val Asn Glu Leu Val Leu Ser Asn

435 440

<210> 2

<211> 1323

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgcccgccg ccgccgccgc cgcgagactg cgccgccgcg gccaccgccg gaagaagttc 60

gtgtacagac cgaagccacc gccggagccg cacccattcc tcctccacct caagtcgctc 120

ccgtcccccg tcgccgccgc ggccgcgctc ctctccgcgc cgaggcgcct ccacgaccac 180

cccttcgccg cctgcgtgct ctaccgcctc gcccgcgcgc gcctcttccc gctcgtgccc 240

ccgctcctcg ccgcgctgca ctcccgcggc gcgccgctcc gtcccaccgt gttcgccgcc 300

gtcatcgacc acctcggcgc cgcttcccgc cccgacgccg cggtcggcgt cttccgcacc 360

gtcccggcct tctgctccca ctccgccgcc acattccatt ccctcctcaa cgcccttgtg 420

tccaatggcc gcacggatgc cgcccgggac atgctcccgc tcgccccgaa gctcggcgtc 480

cgcctcaacg ccgtgtcgta caacatcatc ctcaagggcg cgtgtctccg ggacgggttc 540

atgggcgccc gcggcgtgct cgacgaaatg ctcagccggg gtgtgcgacc gacggtggtc 600

accttcaaca cgctggtggg gtcggcgtgc cgggagggtg agctgggcgc ggcggagcgg 660

ctcatcgacg agatggcgcg ccgtggcgtg gcgccaaacg cggccaccta cgccctcctg 720

atgcgggggc tctgcgacgc cgaccgccac gccgacgccg agaagctgat gttcgacatg 780

gagtaccgcg ggtgccaggc cgacgtggtg aactacggcg tgctgatgag ctcccgcgcg 840

aggcacggcg acgccgacgg cgtcagggag ctcctctccg ccatgcgcaa gcggaagctc 900

aagcccgacg acgcgagcta caacatcctg atcaggtgcc tgtgcgacgc cggcagggcc 960

gacgaggcgc acagggcgct gctcgagatg cagctcaggg gcaccgtgcc gggcgccgcc 1020

acgtaccgcg tcctcgtcga cgggtgctgc agggctcgcg acttcgacct gggtctacgg 1080

gtcttcaacg cgatgatggc gagcggacac tgcccccaag ctcgcacctt caggcacctt 1140

gcgagagggc tcggcgagga cggcaaggcg gaggaggcgt tcttcgtctt ggagcagatg 1200

gcgaggaggg agatgagctt ggatgcagat gggtggcaag ctgttgtcac gtgcgttcgc 1260

agcagctgca gcacccaggc aagtgagatc aagcttgtca atgagttagt gttgtcaaat 1320

tga 1323

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacagaccga agccaccgc 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgtgtaca gaccgaagcc accgc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacgcggtg gcttcggtct gtaca 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctactaaacg gggccgtagc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgttgagga gggaatggaa 20

Claims

1.一种控制水稻粒厚和千粒重的OsPPR5蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的OsPPR5蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的序列经氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1或2所述OsPPR5蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求3所述基因的质粒。

5.一种含有权利要求3所述基因的重组表达载体。

6.一种含有权利要求3所述基因的转基因细胞系。

7.一种含有权利要求3所述基因的工程菌。

8.权利要求1或2所述OsPPR5蛋白在提升水稻粒厚和千粒重中的应用。