CN111850120B - 一种检测nsclc的诊断试剂盒及其使用方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种检测NSCLC的诊断试剂盒及其使用方法与应用。提供一种hsa_circ_0069841在检测NSCLC生物标志物中的应用。还提供一种包含检测hsa_circ_0069841表达试剂的试剂盒，包含序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对、以及序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的用于扩增GAPDH基因的引物对。本发明首次发现hsa_circ_0069841在NSCLC中显著高表达，作为诊断NSCLC的生物标记物，制备一种诊断NSCLC的试剂盒，可方便临床诊断NSCLC，指导临床治疗。

Description

一种检测NSCLC的诊断试剂盒及其使用方法与应用

技术领域

本申请涉及医药和临床诊断技术领域，具体涉及一种检测NSCLC诊断试剂盒及其使用方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的一类重大高危疾病。肺癌的病发率和死亡率在世界范围内都居于所有恶性肿瘤的首位。肺癌是我国的第一大癌症，为癌症防治的重中之重。目前我国肺癌发病率每年增长约26％，如不及时采取有效控制措施，预计到2025年，我国肺癌病人将达到100万，成为世界第一肺癌大国。

非小细胞肺癌(NSCLC)是临床中最常见的肺癌病理类型，约占肺癌发病率的85％。受限于缺少高特异性及灵敏度的早期筛查手段，约75％病人确诊时已发生局部或远端转移，由于病变范围广泛，中晚期肺部肿瘤往往难以得到根治，5年生存率仍不足20％。因此，寻找和研发特异性强、灵敏度高的生物标志物对于肺癌的早期诊断具有重大意义。

在人类基因组序列中，只有不到2％是编码序列，其余全为非编码序列，因此大多数转录物是非编码RNA。越来越多的研究表明非编码RNA在生命调控过程、疾病发生发展中都扮演了重要角色。circRNA是一类以共价键结构形成，不具有3’和5’末端头尾结构的非编码RNA，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内。大多数circRNA是由外显子环化而成，也有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构。同时由于circRNA含有大量的miRNA应答原件(MREs)，能与AGO蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RISC)的催化核心，最终导致circRNA降解。根据来源，circRNA可大致分为四类：全外显子型的circRNA，内含子和外显子组合的EIcircRNA，内含子组成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRNA。

circRNA具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。近几年，大量的研究表明circRNA在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物等方面的应用前景，但其生物学功能在很大程度上仍然未知。目前认可度比较高的circRNA生物学功能，包括miRNA海绵，调控蛋白结合，调控基因转录以及编码功能。

circRNA的异常表达会导致包括癌症在内的多种疾病的发生。现有研究表明circRNA从表观遗传调控、增殖、凋亡、转移、DNA损伤修复、信号转导等途径参与了肿瘤发生发展的全过程，可作为疾病的生物标志物，在临床诊断和治疗方面有广阔的应用前景。

发明内容

本申请的主要目的在于针对现有技术中的不足，提供一种检测NSCLC诊断试剂盒及其使用方法与应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

本发明的第一方面，提供hsa_circ_0069841在检测NSCLC生物标志物中的应用。

作为一个实例，所述的肺癌为A549或H1299肺癌。

作为一个实例，所述的肺癌为A549或H1299肺癌细胞系。

上述hsa_circ_0069841在检测NSCLC生物标志物中的应用，作为一种优选的实施方案，所示hsa_circ_0069841的序列如：ATCTTTGCCGCCGTTCATTATCAGAAGACACTGATGGGACTGAGGAAGACCCACAGGCAGAACTGGCCATCATTCATGGTCAGATGGCTTATATTCTGCAGCTTCAGGGTCGAACAGAGGAGGCTTTGCAACTTTACAATCAAATAATAAAACTAAAACCAACAGATGTGGGATTACTAGCTGTAATTGCAAATAACATCATTACCATTAACAAGGACCAAAATGTCTTTGACTCCAAGAAGAAAGTGAAATTAACCAATGCGGAAGGAGTAGAGTTTAAGCTTTCCAAGAAACAACTACAAGCTATAGAATTTAACAAAGCTTTACTTGCTATGTACACAAACCAGGCTGAACAATGCCGCAAAATATCTGCCAGTTTACAGTCCCAAAGTCCCGAGCATCTCTTACCTGTGTTAATCCAAGCTGCCCAGCTCTGCCGTGAAAAGCAGCACACAAAAGCAATAGAGCTGCTTCAG。

本发明的第二方面，提供一种检测hsa_circ_0069841基因的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对和用于扩增GAPDH基因的引物对。

上述一种检测hsa_circ_0069841基因的试剂，作为一种优选的实施方案，所述用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

上述一种检测hsa_circ_0069841基因的试剂，作为一种优选的实施方案，所述用于扩增GAPDH基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

本发明的第三方面，提供一种检测NSCLC的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求3所述的检测hsa_circ_0069841基因的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对和用于扩增GAPDH基因的引物对；

优选地，所述用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述用于扩增GAPDH基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

上述一种检测NSCLC的试剂盒，作为一种优选的实施方案，所述试剂盒还包括采用实时荧光定量PCR扩增体系，反应体系包括：一对检测hsa_circ_0069841基因拷贝数的扩增引物序列和一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列，PCR底物，PCR缓冲液，待检NSCLC组织cDNA模板(组织中抽提RNA后逆转录获得)，无酶去离子水。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明首次发现hsa_circ_0069841在NSCLC中显著高表达，因此，本发明采用hsa_circ_0069841基因作为诊断NSCLC的生物标记物，制备一种诊断NSCLC的试剂盒，可方便临床诊断NSCLC，指导临床治疗。

2.本发明采用自行设计并优化的内参和目的引物，整合了实时荧光定量PCR试剂，制成检测试剂盒，引物特异性强，准确率高，能提供准确可靠的检测结果。

3.本发明的试剂盒制作方法和使用操作简单、方便，可节省时间和试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。

附图说明

图1为14株NSCLC细胞株中hsa_circ_0069841的表达；

图2为8例NSCLC组织及其配对的癌旁组织中差异circRNA热图；

图3为100例NSCLC组织及其配对的癌旁组织中hsa_circRNA_0069841的表达；

图4A为hsa_circ_0069841的不同引物序列在A549和H1299中的实时荧光定量PCR产物的特异性结果；

图4B为GAPDH的不同引物序列在A549和H1299中的实时荧光定量PCR产物的特异性结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

第一方面，本申请提供了hsa_circ_0069841在检测NSCLC生物标志物中的应用。作为一种优选的实施方案，所述hsa_circ_0069841的序列如：ATCTTTGCCGCCGTTCATTATCAGAAGACACTGATGGGACTGAGGAAGACCCACAGGCAGAACTGGCCATCATTCATGGTCAGATGGCTTATATTCTGCAGCTTCAGGGTCGAACAGAGGAGGCTTTGCAACTTTACAATCAAATAATAAAACTAAAACCAACAGATGTGGGATTACTAGCTGTAATTGCAAATAACATCATTACCATTAACAAGGACCAAAATGTCTTTGACTCCAAGAAGAAAGTGAAATTAACCAATGCGGAAGGAGTAGAGTTTAAGCTTTCCAAGAAACAACTACAAGCTATAGAATTTAACAAAGCTTTACTTGCTATGTACACAAACCAGGCTGAACAATGCCGCAAAATATCTGCCAGTTTACAGTCCCAAAGTCCCGAGCATCTCTTACCTGTGTTAATCCAAGCTGCCCAGCTCTGCCGTGAAAAGCAGCACACAAAAGCAATAGAGCTGCTTCAG。

第二方面，本申请提供了一种检测hsa_circ_0069841基因的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对和用于扩增GAPDH基因的引物对；作为一种优选的实施方案，所述用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，所述用于扩增GAPDH基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

第三方面，本申请提供了一种检测NSCLC的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求3所述的检测hsa_circ_0069841基因的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对和用于扩增GAPDH基因的引物对；作为一种优选的实施方案，所述用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述用于扩增GAPDH基因的引物对包含序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，且所述试剂盒还包括采用实时荧光定量PCR扩增体系，反应体系包括：一对检测hsa_circ_0069841基因拷贝数的扩增引物序列和一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列，PCR底物，PCR缓冲液，待检NSCLC组织cDNA模板(组织中抽提RNA后逆转录获得)，无酶去离子水。

本申请实验所有数据均由SPSS 21.0统计软件分析输出，计量资料以均数±标准差()表示，采用t检验，组间差异采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实施例1

1、hsa_circ_0069841在NSCLC细胞株中的表达

1.1细胞培养

人正常肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞株H1299、A549、H1975、H1650、H1972、H2073、HCC827、H226、H520、H460、H358、H1573、H2170、SK-MES-1，分别用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO₂，95％饱和湿度的培养箱中培养，细胞到对数生长期时，常规消化传代1次，并分别收集细胞，用于实验。细胞消化使用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化液。

1.2、RT-qPCR实验

1.2.1提取细胞总RNA

使用胰蛋白酶消化上述人正常肺上皮细胞BEAS-2B及14种NSCLC细胞，消化后将上述细胞分别收集于1.5ml EP管中，放入离心机中，1000rpm/min室温离心10min。离心后弃上清，加入1×PBS清洗两次，每个EP管中加入1ml Trizol(Invitrogen,USA)，将细胞团吹打混匀，室温静置5min，按1ml Trizol中加入200μl氯仿的比例加入氯仿，上下剧烈震荡混匀30s，至溶液呈现出乳糜状时放入离心机，4℃12000g离心20min。取出EP管，置于冰中，小心缓慢吸取上层溶液400μl至一新的EP管中，切记不要吸到沉淀，在吸出的400μl上清中加入400μl预冷的异丙醇，上下轻轻颠倒，置于-20℃冰箱静置20min以沉淀RNA，4℃12000g离心10min；吸弃上清，尽量吸净，轻轻沿管壁加入250μl含有70％乙醇的DEPC(焦碳酸二乙酯)水以清洗RNA，4℃，12000g离心10min，吸弃乙醇，尽量吸净，室温风干沉淀3min；加入适量的DEPC水溶解RNA，置于微量核酸浓度测定仪上，测定RNA浓度与A260/280值(A260/280的值正常范围在1.80-2.0之间，说明RNA的浓度可以用于后续实验)，测定后置于-80℃保存。

1.2.2逆转录合成cDNA

取3000ng总RNA，加入5×qRT super-Mix(5×逆转录混合液，Takara，大连)2μl，剩余用无酶超纯水补至10μl，在PCR仪中逆转录合成cDNA，逆转录条件：在PCR仪中，在25℃的条件下逆转录10min，将温度调至42℃，在此条件下逆转录30min，再将温度调至85℃，在此条件下逆转录5min得cDNA，cDNA分装后置于-20℃保存。

1.2.3实时荧光定量PCR

取正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl(引物序列见表1)，2×SYBR GreenqPCR Mix(2×荧光染料qPCR混合液)10μl，上述15种细胞的cDNA模板2μl，50×ROX Dye2(50×ROX参比染料，Takara，大连)0.4μl，无酶去离子水5.6μl。将上述物质混合加入0.2ml的qPCR管中，重复加入3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qPCR的反应条件如下：步骤1：95℃30s；步骤2(40个循环)：95℃5s，60℃34s；步骤3(熔解曲线)：95℃15s，60℃60s，95℃15s。设置在延伸阶段收集荧光信号，Quant Studio软件分析得到上述15种细胞中每个基因的循环阈值(Cq值)。qPCR反应结束后进行熔解曲线检测，95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。每个样本实验重复3次，结果如图1所示：从图1可得出在14株NSCLC细胞株中检测hsa_circ_0069841的表达，发现hsa_circ_0069841在NSCLC细胞株中为高表达。

表1 PCR引物序列

2、circRNA基因芯片分析

收集8例NSCLC(非小细胞肺癌)患者组织及配对癌旁组织，做circRNA基因芯片分析，以log2FC≥1，P<0.05为标准，选取差异的circRNA，结果如图2所示。从图2中可以得出差异最显著的是hsa_circ_0069841，并且hsa_circ_0069841在NSCLC组织中为高表达。

3、组织和细胞中hsa_circ_0069841表达量的检测

收集100例NSCLC(非小细胞肺癌)患者组织及配对癌旁组织，剪取黄豆粒大小，研磨，抽提RNA，采用RT-qPCR的方法，检测NSCLC组织中hsa_circ_0069841的表达量。检测细胞中hsa_circ_0069841表达量，方法相同，抽提RNA后，采用RT-qPCR的方法，检测NSCLC细胞中hsa_circ_0069841的表达量，结果如图3所示。从图3中可以得出，在100例NSCLC组织及其配对的癌旁组织中发现hsa_circ_0069841在NSCLC组织中显著高表达。

4、为了制备通过检测hsa_circ_0069841表达诊断NSCLC的试剂盒，优化其中的引物，提高检测特异性和准确率。我们设计了众多对hsa_circ_0069841基因引物序列和GAPDH基因引物序列(见表1，表1中列出其中的4对)，分别在A549和H1299肺癌细胞中进行实时荧光定量PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，评价PCR产物的特异性，进而评价引物质量。结果如图4所示；图4A为hsa_circ_0069841的不同引物序列在A549和H1299中的实时荧光定量PCR产物的特异性结果，图4B为GAPDH的不同引物序列在A549和H1299中的实时荧光定量PCR产物的特异性结果，从中发现hsa_circ_0069841第1对引物和GAPDH第1对引物特异性最好。

琼脂糖凝胶电泳的检测方法为：

(1)配制适量的电泳缓冲液(1×TBE)及制胶缓冲液(1×TBE)；

(2)配制2％的琼脂糖凝胶，称取2g的琼脂粉，加入制胶瓶中，加入100ml的TBE；

(3)盖松瓶盖，在微波炉中加热溶解所称取的2g琼脂粉，沸腾后，摇动瓶，反复三次,使其充分溶解；

(4)将梳子放入制胶板中的卡槽，把溶解好的琼脂粉溶液倒入制胶板制成厚度为8mm左右的凝胶，用枪头赶走气泡，室温下使胶凝固，拔掉梳子，放入电泳槽使用；

(5)向PCR产物加入6×上样缓冲液(天根，RT201-02，北京)及1/10的荧光染料SYBRGreen(索莱宝，Y1040-100μl，北京)，充分混匀后使用；

(6)将PCR产物沿着胶孔边缘匀速加入，尽量避免破坏胶孔；

(7)向预留孔中加入DNA marker D2000；

(8)盖好电泳槽的盖子，接通电源，电压80V～120V进行电泳；电泳结束后用凝胶成像观察并记录电泳结果。

从图4中发现hsa_circ_0069841第1对引物和GAPDH第1对引物特异性最好。

实施例2

采用优选的hsa_circ_0069841和GAPDH基因的引物设计试剂盒。本试剂盒采用实时荧光定量PCR扩增体系，每20μl反应体系包括：一对检测hsa_circ_0069841基因拷贝数的扩增引物序列和一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列(见表2)，其正向引物(10μM)体积均为1μl，反向引物(10μM)体积均为1μl，2×SYBR Green qPCR Mix的体积为10μl，50×ROX Dye2的体积为0.4μl，待检NSCLC组织cDNA模板(组织中抽提RNA后逆转录获得)2μl，无酶去离子水5.6μl。在该试剂盒中，hsa_circ_0069841在NSCLC中显著高表达，因此检测hsa_circ_0069841能够准确诊断NSCLC。

表2试剂盒中PCR引物序列

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.检测hsa_circ_0069841表达量的试剂在制备检测NSCLC诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂由用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对和用于扩增GAPDH基因的引物对组成；

所述用于扩增hsa_circ_0069841基因的引物对由序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；

SEQ ID NO:1：F:AGACACTGATGGGACTGAGG；

SEQ ID NO:2：R: GTTGCAAAGCCTCCTCTGTT；

所述用于扩增GAPDH基因的引物对由序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成；

SEQ ID NO:9：F: AGATCATCAGCAATGCCTCCTG；

SEQ ID NO:10：R: GCAGGGATGATGTTCTGGAGAG。

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