CN111848769A - 一种蛋白在影响棉铃虫雌虫交配行为和/或其产卵量中的应用 - Google Patents
一种蛋白在影响棉铃虫雌虫交配行为和/或其产卵量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种蛋白在影响棉铃虫雌虫交配行为和/或其产卵量中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白在影响棉铃虫雌虫交配行为和/或其产卵量中的应用。
背景技术
棉铃虫(Helicoverpa armigera)是世界性的农业害虫，杂食性昆虫可以取食超过60种不同的农作物，严重危害农作物的产量和质量，每年都会造成巨额的经济损失。目前的防治棉铃虫的方法主要是施用化学农药，许多农药都属于神经毒剂，例如多杀菌素(spinosyn)作为昆虫乙酰胆碱受体的激活剂可以有效的控制害虫的数量，由于乙酰胆碱受体在无脊椎动物和脊椎动物神经系统中大量存在且功能保守，因此神经毒剂也会杀死非靶标昆虫，甚至危害人类健康，并且由于农药的长期使用，棉铃虫对现有农药已经产生了抗药性，因此需要发展新的防治方法，控制害虫的数量。
发明内容
本发明之一提供了一种蛋白在影响棉铃虫(Helicoverpa armigera)雌虫交配行为和/或棉铃虫雌虫产卵量中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明之二如本发明之一所述的应用中的蛋白在用于筛选靶向抑制所述蛋白的活性物质中的应用。
在一个具体实施方式中，所述蛋白的氮端或碳端融合有蛋白标签和/或分泌蛋白。
在一个具体实施方式中，所述蛋白标签选自HIS标签、荧光蛋白、GST标签、MyC标签和HA标签中的至少一种。其中，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白等。
本发明之三提供了编码如如本发明之一中任意一项所述应用中的蛋白的核酸在影响棉铃虫(Helicoverpa armigera)交配行为和/或棉铃虫雌虫产卵量中的应用。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
本发明之四提供了编码如如本发明之一所述应用中的蛋白的核酸在用于筛选靶向抑制所述核酸的活性物质中的应用。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
在一个具体实施方式中，所述核酸的5’端或3’端融合有编码所述蛋白标签和/或分泌蛋白的核酸。
在一个具体实施方式中，编码所述蛋白标签的核酸选自编码HIS标签的核酸、编码荧光蛋白的核酸、编码GST标签的核酸、编码MyC标签的核酸和编码HA标签的核酸中的至少一种。
本发明之五提供了如本发明之一所述应用中的蛋白或本发明之三所述应用中的核酸在防治所述棉铃虫中的应用。
在一个具体实施方式中，通过抑制所述蛋白、失活所述蛋白、沉默所述蛋白，抑制所述蛋白的表达、沉默所述蛋白的表达和降低所述蛋白的表达量中的至少一种来防治所述棉铃虫
本发明的有益效果：
本发明首次发现具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白在棉铃虫雌虫体内缺失时，可以使已交配棉铃虫雌虫再次交配的频率相对于野生型显著提高，同时本发明还发现该蛋白在棉铃虫雌虫体内缺失时，会使棉铃虫雌虫的产卵量相对于野生型显著降低。如果开发出该蛋白或基因的抑制剂，当雌性棉铃虫的该基因被抑制，该雌虫即使交配后依然能保持很高的再次交配的欲望，那么该雌虫将会和该基因未被抑制的处女雌虫竞争配偶(雄虫)，结果造成大量的雄虫的精子被消耗，同时该基因受到抑制的雌虫产生的后代却很少，从而达到防治棉铃虫的目的。
附图说明
图1野生型和突变体雌虫求偶率的柱状图。误差线表示标准误，Student’s t检验，***P<0.001(具有显著差异)；n.s.,P>0.05(无显著差异)，N＝3-6。
图2野生型和突变体雌虫交配率的柱状图。误差线表示标准误，Student’s t检验，***P<0.001(具有显著差异)；n.s.,P>0.05(无显著差异)，N＝3-10。
图3未交配、野生型和突变体雌蛾在不同时期产卵量统计柱状图。误差线表示标准误，ANOVA LSD分析，不同字母代表显著性差异(P<0.05)，N＝15-17。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除棉铃虫体内的一种基因(SEQ ID No.1)，具体操作步骤可以参考chang et al.,2017,Current Biology,27,1-6。通过单对交配纯化突变体基因型，然后以产卵亲本的基因组为模板PCR扩增靶标序列，最后对扩增序列进行测序分析筛选得到纯合突变品系。其中，具有如SEQ ID No.1所示碱基序列的基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2。
在得到纯合突变品系之后，检测纯合突变品系雌虫交配后的性接受力(sexualreceptivity)和产卵量。雌性棉铃虫成虫性接受力的检测包括求偶率和再次交配率两个方面。在后续分析中，将纯和突变品系称之为突变体。
准备I)和II)两种不同处理的雌虫用来分析求偶率、交配率和产卵量：
I)3日龄处女(未交配)野生型和突变体雌虫。准备方法：成虫羽化后，雌雄虫分开饲养避免交配。
II)完成一次交配的野生型和突变体雌虫。准备方法：将3日龄处女野生型与2日龄未交配的野生型雄虫放入交配罐中单对交配，当交配完成后立即取出雄虫并记录交配完成的时间，雌虫单独饲养；同样，将3日龄处女突变体与2日龄未交配的野生型雄虫放入交配罐中单对交配，当交配完成后立即取出雄虫并记录交配完成的时间，雌虫单独饲养。
(1)求偶率分析
在进入暗期前1个小时，将上述I)和II)两种处理的雌虫均以每8头一组放入同一个透明的养虫笼中。
对于处理I)的雌虫，从进入暗期第4小时开始，每间隔20分钟观察并记录一次雌虫的求偶行为(求偶行为：雌虫将性腺从生殖孔挤出并暴露在空气中)，共观察两个小时。
对于处理II)的雌虫，从交配结束后的第24h和第48h开始每间隔20分钟统计一次雌虫求偶行为，共统计两个小时。
上述实验设置3-6次重复。
计算求偶率。求偶率＝(每个处理下雌虫平均求偶数/8)×100％。结果见图1。
从图1可知，突变体处女雌蛾的求偶率和野生型处女雌蛾的求偶率相比没有明显差异；但当完成交配后24h和48h的雌虫，与野生型相比，突变体的求偶率显著提高至未交配状态。因此得出结论：当敲除所述基因后，雌性棉铃虫即使交配后仍保持很高的求偶率。
(2)交配率分析
对于处理I)的雌虫，将未交配野生型雌蛾和突变体雌蛾分别与2日龄未交配的野生型雄蛾放入同一交配罐中单对交配，利用录像机(SONY,Japan)记录整个交配过程，并统计交配数量。
对于处理II)的雌虫，将交配后24h的野生型雌蛾和突变体雌蛾分别与3日龄未交配的野生型雄蛾放入同一交配罐中单对交配，利用录像机(SONY,Japan)记录整个交配过程，并统计交配数量。
对于处理II)的雌虫，将交配后48h的野生型雌蛾和突变体雌蛾分别与4日龄未交配的野生型雄蛾放入同一交配罐中单对交配，利用录像机(SONY,Japan)记录整个交配过程，并统计交配数量。
上述实验设置3-10次重复，计算各处理组的交配率。交配率计算方法：交配率＝(交配数量/总配对数)×100％。
结果见图2。结果发现处女突变体和处女野生型雌蛾的交配率均很高，且没有显著差异；但是当两者完成交配后24h和48h，突变体雌蛾的再次交配率显著高于野生型。
综合以上求偶行为和交配行为的结果，可以得出结论：敲除该基因后，雌性突变体棉铃虫即使在交配后依然保持很高的性接受力。
(3)产卵量分析
实验组：将3日龄处女突变体雌蛾和2日龄未交配的野生型雄虫放入交配罐中单对交配，观察交配完成后，立即将雄虫取出，雌虫在交配罐中单独饲养，在完成交配后24小时和48小时，利用计数器统计突变体雌蛾的产卵量。
对照组分为两组：
对照组1：将3日龄处女野生型雌蛾单头放入交配罐中，不放入雄虫，利用计数器统计未交配野生型雌蛾的产卵量，统计卵量的时间点同实验组(与实验组平行进行)。
对照组2：将3日龄处女野生型雌蛾和2日龄未交配的野生型雄虫放入交配罐中单对交配，观察交配完成后，立即将雄虫取出，雌虫在交配罐中单独饲养，在完成交配后24小时和48小时，利用计数器统计野生型雌蛾的产卵量。
结果见图3。结果发现突变体在交配后24h和48h的产卵量均显著低于交配后野生型雌虫的产卵量，但和未交配的野生型雌虫的产卵量无明显差异。因此得出结论：该基因能够调控雌虫交配后的产卵行为。
序列表
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种蛋白在影响棉铃虫雌虫交配行为和/或其产卵量中的应用
<130> LHA2060487
<141> 2020-07-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1275
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 1
atggcggcgc aagataaaga ctgggtcgat tacttcggcg attttaacgc aacaaaacaa 60
attgtcgacg gagacagcac tgatttagac atttcgaaag taaattataa ttattacgac 120
aacggaactg gttatcctgg ttactcgaac ttctcggcag ctgatgactt ctgcacgtcg 180
aaccattcgc atttttattt gaatgtcact tgcgaatttc ctgttgatta tgctgagcct 240
atgtatgggt acatagcccc tttcctgctg gctactacca cagtagccaa cacactaatc 300
gtggtggttc tatcaagaag acacatgaga acccccacca acgtagtcct gatggccatg 360
gctctatgtg atatgttcac catgctgttc ccagcaccct ggttgttcta catgtataca 420
ttcggcaatc attataagcc ccttagccct gtgagagcgt gtcaagcgtg gaattatatg 480
aatgaggtga taccagcgat gttccacacg gcgagcatct ggctgaccct ggcactggcg 540
gtacagcggt acatctacgt gtgccacgcg cccgtcgcaa ggacatggtg cacaatgcct 600
cgcgtgatga agtgcctggt gtacatcggc gtggctgcct tcctgcatca gctgccgagg 660
ttcttcgacc ggcggtacgt cccccagatc actgtgtggc gaggtcactt cgaagaagtc 720
tgcagaatcg aaatggctcc ctgggtgcac gcgatatcgc tagacgccta cttcatcacc 780
tactacggct tcagggtctt attcgttcat ctcatccctt gcacatctct agtagtcctc 840
aatgtcttac tgttcagagc tatgaggact gcacagataa acaggcaaag actcttcaag 900
gagaacagaa aatccgagtg cagaaaaccg agagactcag attgcaccac cttaatgctt 960
atagtcgttg tcacggtctt tctgctggtc gaaatcccag ttgctgtcgt cactatctta 1020
catattatat ctagcactat tgtcgaaatt ctagactatt atatagccaa catcttgatt 1080
ttaatcacta acttcttcat cttagtttct tatcctatca attttgcgat ctattgtggc 1140
atgtcaagac agtttcgaga gactttcaaa gagctattta taaggggcgc ggtgacgagt 1200
aggaaaaatg gcggatccag taggtattcc ctagtgaacg gccctcgtac ctgcaccaac 1260
gaaactgtgc tttaa 1275
<210> 2
<211> 424
<212> PRT
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 2
Met Ala Ala Gln Asp Lys Asp Trp Val Asp Tyr Phe Gly Asp Phe Asn
1 5 10 15
Ala Thr Lys Gln Ile Val Asp Gly Asp Ser Thr Asp Leu Asp Ile Ser
20 25 30
Lys Val Asn Tyr Asn Tyr Tyr Asp Asn Gly Thr Gly Tyr Pro Gly Tyr
35 40 45
Ser Asn Phe Ser Ala Ala Asp Asp Phe Cys Thr Ser Asn His Ser His
50 55 60
Phe Tyr Leu Asn Val Thr Cys Glu Phe Pro Val Asp Tyr Ala Glu Pro
65 70 75 80
Met Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Phe Leu Leu Ala Thr Thr Thr Val Ala
85 90 95
Asn Thr Leu Ile Val Val Val Leu Ser Arg Arg His Met Arg Thr Pro
100 105 110
Thr Asn Val Val Leu Met Ala Met Ala Leu Cys Asp Met Phe Thr Met
115 120 125
Leu Phe Pro Ala Pro Trp Leu Phe Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Asn His
130 135 140
Tyr Lys Pro Leu Ser Pro Val Arg Ala Cys Gln Ala Trp Asn Tyr Met
145 150 155 160
Asn Glu Val Ile Pro Ala Met Phe His Thr Ala Ser Ile Trp Leu Thr
165 170 175
Leu Ala Leu Ala Val Gln Arg Tyr Ile Tyr Val Cys His Ala Pro Val
180 185 190
Ala Arg Thr Trp Cys Thr Met Pro Arg Val Met Lys Cys Leu Val Tyr
195 200 205
Ile Gly Val Ala Ala Phe Leu His Gln Leu Pro Arg Phe Phe Asp Arg
210 215 220
Arg Tyr Val Pro Gln Ile Thr Val Trp Arg Gly His Phe Glu Glu Val
225 230 235 240
Cys Arg Ile Glu Met Ala Pro Trp Val His Ala Ile Ser Leu Asp Ala
245 250 255
Tyr Phe Ile Thr Tyr Tyr Gly Phe Arg Val Leu Phe Val His Leu Ile
260 265 270
Pro Cys Thr Ser Leu Val Val Leu Asn Val Leu Leu Phe Arg Ala Met
275 280 285
Arg Thr Ala Gln Ile Asn Arg Gln Arg Leu Phe Lys Glu Asn Arg Lys
290 295 300
Ser Glu Cys Arg Lys Pro Arg Asp Ser Asp Cys Thr Thr Leu Met Leu
305 310 315 320
Ile Val Val Val Thr Val Phe Leu Leu Val Glu Ile Pro Val Ala Val
325 330 335
Val Thr Ile Leu His Ile Ile Ser Ser Thr Ile Val Glu Ile Leu Asp
340 345 350
Tyr Tyr Ile Ala Asn Ile Leu Ile Leu Ile Thr Asn Phe Phe Ile Leu
355 360 365
Val Ser Tyr Pro Ile Asn Phe Ala Ile Tyr Cys Gly Met Ser Arg Gln
370 375 380
Phe Arg Glu Thr Phe Lys Glu Leu Phe Ile Arg Gly Ala Val Thr Ser
385 390 395 400
Arg Lys Asn Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Leu Val Asn Gly Pro Arg
405 410 415
Thr Cys Thr Asn Glu Thr Val Leu
420
Claims (10)
1.一种蛋白在影响棉铃虫(Helicoverpa armigera)雌虫交配行为和/或棉铃虫雌虫产卵量中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的应用中的蛋白在用于筛选靶向抑制所述蛋白的活性物质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白的氮端或碳端融合有蛋白标签和/或分泌蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述标签蛋白选自HIS标签、荧光蛋白、GST标签、MyC标签和HA标签中的至少一种。
5.编码如权利要求1所述应用中的蛋白的核酸在影响棉铃虫(Helicoverpa armigera)交配行为和/或棉铃虫雌虫产卵量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
7.编码如权利要求2至4中任意一项所述应用中的蛋白的核酸在用于筛选靶向抑制所述核酸的活性物质中的应用。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
9.如权利要求1所述应用中的蛋白或权利要求5或6所述应用中的核酸在防治所述棉铃虫中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，通过抑制所述蛋白、失活所述蛋白、沉默所述蛋白，抑制所述蛋白的表达、沉默所述蛋白的表达和降低所述蛋白的表达量中的至少一种来防治所述棉铃虫。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007145777A (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Glycomedics Inc | インフルエンザウイルス感染阻害方法 |
| WO2009071672A1 (en) * | 2007-12-06 | 2009-06-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Method for controlling insect populations |
| CN104928294A (zh) * | 2015-06-08 | 2015-09-23 | 云南大学 | 利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法 |
-
2020
- 2020-07-31 CN CN202010758055.4A patent/CN111848769A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Title |
|---|
| GENBANK: "GenBank: ADK79103.2", 《GENBANK》 * |
| GENBANK: "GenBank: HM567403.2", 《GENBANK》 * |
| HANIN O.等: "Functional impact of silencing the Helicoverpa armigera sex-peptide receptor on female reproductive behaviour", 《INSECT MOL BIOL》 * |
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