CN111840360A - 补骨脂总苷提取物的抗骨质疏松新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉一种补骨脂总苷提取物的医药新用途，特别是以补骨脂苷、异补骨脂和以两者为主的补骨脂总苷提取物抗骨质疏松新用途，及其在制备防治骨质疏松症药物中的应用。补骨脂总苷提取物中补骨脂苷和异补骨脂苷的质量百分含量和大于50％。该提取物对去卵巢大鼠骨质疏松具有明显的防治作用，对泼尼松龙、维生素A酸以及地塞米松诱导的斑马鱼骨质疏松具有明显的防治作用；补骨脂苷和异补骨脂苷对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松具有防治作用。补骨脂总苷提取物可与临床上接受的药物载体或辅料配制成治疗骨质疏松症的片剂、胶囊、口服液等制剂形式。

Description

补骨脂总苷提取物的抗骨质疏松新用途
技术领域
本发明涉一种补骨脂总苷提取物的医药新用途，特别是以补骨脂苷和异补骨脂苷为主的补骨脂总苷提取物抗骨质疏松新用途。
背景技术
补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L.)的干燥成熟果实。具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻等功效。现代药理研究表明，补骨脂具有较好的抗骨质疏松活性。补骨脂成分复杂，主要含有香豆素类、黄酮类和单萜酚类。已有研究表明香豆素类成分中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂定具有抗骨质疏松作用(《补骨脂素对骨质疏松小鼠骨代谢指标和生物力学的影响》；黄奎，邹季；《生物骨科材料与临床研究》，2017年第14卷第6期:11-13+21。《异补骨脂素对氧化应激介导骨质疏松大鼠模型的作用及机制》；王军，王剑，鲁敏，牧亭亭，耿亚会；《疑难病杂志》，2019年第18卷第9期：940-944。《补骨脂定抗实验性绝经后骨质疏松的效应及作用机制研究》；李劲平，王小静，曾英，林清，莫新民，刘仕杰，杨军；《中国中药杂志》，2013年第38卷11期：1816-1819。)；黄酮类成分如补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂宁等具有促进成骨细胞增殖作用；补骨脂二氢黄酮、查尔酮化合物对成骨细胞的增殖、分化活性强于异黄酮；而二氢黄酮化合物强于查尔酮。(《补骨脂治疗骨质疏松的物质基础研究》；寿清耀；成都中医药大学，2006年。《补骨脂中9种黄酮类化合物的构效关系及对绝经后妇女成骨细胞的增殖、分化活性研究》；高倩倩，翁泽斌，颜翠萍，赵根华，陈志鹏，蔡宝昌，李伟东；《中国药学杂志》，2015年第50卷16期：1397-1401)。迄今为止尚未有补骨脂苷、异补骨脂苷及以补骨脂苷和异补骨脂苷为主的补骨脂总苷提取物防治抗骨质疏松症的报道。
发明内容
发明目的：通过对以补骨脂苷和异补骨脂苷为主的补骨脂总苷提取物进行药理活性研究，发现该提取物对去卵巢大鼠骨质疏松有明显的防治作用，发现该提取物、补骨脂苷和异补骨脂苷具有抗斑马鱼骨质疏松活性。发现补骨脂苷、异补骨脂苷和补骨脂总苷提取物具有抗骨质疏松新用途，提出补骨脂总苷提取物在制备防治骨质疏松症的药物制剂方面的应用。
采用的技术方案：以补骨脂苷和异补骨脂苷为主的补骨脂总苷提取物，其中补骨脂苷和异补骨脂苷的质量百分含量和大于50％，补骨脂总苷提取物可与临床上接受的药物载体或辅料配制成治疗骨质疏松的片剂、胶囊、口服液等制剂形式。
有益效果：本发明提取的补骨脂总皂苷提取物，其中含补骨脂苷和异补骨脂苷的含量高，对各种原因引起的骨质疏松，具有明显的防治作用。
附图说明
图1补骨脂总苷提取物的斑马鱼泼尼松龙模型幼鱼头骨茜素红染色放大100倍的显微成像图(8dpf)。
图2补骨脂总苷提取物的斑马鱼维生素A酸模型幼鱼头骨茜素红染色放大100倍的显微成像图(8dpf)。
图3补骨脂总苷提取物的斑马鱼地塞米松模型幼鱼头骨茜素红染色放大100倍的显微成像图(8dpf)。
图4补骨脂苷和异补骨脂苷的斑马鱼泼尼松龙模型幼鱼头骨茜素红染色放大100倍的显微成像图(8dpf)。
具体实施方式
本发明采取的技术方案为：
一、补骨脂总苷提取物对去卵巢大鼠质疏松的防治作用
50％以上的妇女绝经后会发生骨质疏松，因而是骨质疏松防治的重点。去卵巢大鼠模型是公认的研究绝经后骨质疏松症的一种较好的模型。
1.实验材料
补骨脂总苷提取物：补骨脂苷和异补骨脂苷的含量和为66.8％，江苏省中医药研究院中药制剂研究室自制。
实验动物：2月龄未生育的SD雌性大鼠，体重280-300g，SPF级。饲料为标准普通饲料，动物购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0005，合格证编号：20170005003587；大鼠饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2016-0018。所有动物在同等条件下喂养，自由饮水进食。饲养25±1℃，湿度65±5％。
2.实验方法
大鼠饲养一个月后进行双侧卵巢切除术。手术前一天晚上禁食。手术前称量体重，腹腔注射10％的水合氯醛麻醉后，取俯卧位，两侧背腹部分别剃毛，用碘伏局部消毒皮肤。在大鼠一侧背腹部距离腰椎一横指和肋下一横指交界处，手术刀做纵形切口，分离腹肌，用眼科镊暴露与宫角紧密相连的卵巢后将其结扎并切除。假手术组采用相同手术入路及显露，只摘除附着卵巢周围少量脂肪组织。手术后禁食，禁水，隔日早晨开始进食。所有手术大鼠术后肌肉注射40万IU/天青霉素3天以预防感染。
术后一个月开始灌胃给药，大鼠随机分组，分为6组，每组12只：假手术组、模型组、阳性药组(强骨胶囊)、补骨脂总苷提取物组(高、低剂量)。补骨脂总苷提取物组低、高组灌胃剂量10、40mg/kg；阳性药灌胃剂量78.75mg/kg；假手术组和模型组给予同剂量的纯净水。每周灌胃6天。每周称量体重，灌胃3个月后禁食1天，自由饮水，大鼠毛细管眼底静脉取血，离心取血清待测。取大鼠双侧股骨和胫骨，分别用于Micro-CT检测骨密度和骨形态分析；三点弯曲实验检测最大载荷等生物力学指标。
3.实验结果
3.1对股骨和胫骨松质骨骨密度的影响
与假手术组相比，双侧卵巢切除可使大鼠股骨及胫骨骨密度显著降低(P<0.01)，经补骨脂总苷提取物治疗后(高、低剂量组)，可明显提高卵巢切除大鼠股骨及胫骨松质骨骨密度(P<0.05，P<0.01)，差异有统计学意义。结果见表1。
表1补骨脂总苷提取物对去卵巢大鼠骨密度的影响
Figure BDA0002450001090000021
Figure BDA0002450001090000031
注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与去卵巢组比较#P<0.05，##P<0.01
3.2对股骨松质骨骨形态计量学静态参数的影响
模型组大鼠股骨松质骨BV/TV(骨小梁体积占骨组织体积百分比)显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略高于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。补骨脂总苷提取物高、低剂量组均高于模型组和阳性药组，其中高、低剂量组和模型组相比具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。
模型组大鼠股骨松质骨BS/BV(骨表面积和骨体积的比值)显著高于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略低于模型组(P<0.05)。高、低剂量组均低于模型组，其中高剂量组和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。
模型组大鼠股骨松质骨Tb.Th(骨小梁宽度)显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组高于模型组(P<0.05)。高、低剂量组均高于模型组，其中高剂量组和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。
模型组大鼠股骨松质骨Tb.N(骨小梁数量)显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组高于模型组，但差异无显著性(P>0.05)。高、低剂量组均高于模型组，具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。
模型组大鼠股骨松质骨Tb.Sp(骨小梁分离度)显著高于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略低于模型组，但差异无显著性(P>0.05)。高、低剂量组均低于模型组，其中低剂量组和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。
说明补骨脂总苷提取物可以增加骨质疏松大鼠股骨骨小梁的数量和厚度，减小骨小梁的分离度。结果见表2。
表2补骨脂总苷提取物对股骨松质骨骨形态计量学静态参数的影响
Figure BDA0002450001090000032
注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与去卵巢组比较#P<0.05，##P<0.01。
3.3对胫骨松质骨骨形态计量学静态参数的影响
模型组大鼠胫骨松质骨BV/TV骨小梁面积占骨组织体积显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略高于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。补骨脂总苷提取物高、低剂量组均高于模型组和阳性药组，和模型组相比均具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。
模型组大鼠胫骨松质骨BS/BV(骨表面积和骨体积的比值)显著高于假手术组(P<0.01)，和文献报道的一致，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略低于模型组(P>0.05)。高、低剂量组略低于模型组，具有统计学差异(P<0.05)。
模型组大鼠胫骨松质骨Tb.Th(骨小梁宽度)显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组高于模型组(P<0.05)。高、低剂量组均高于模型组，其中高剂量组和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。
模型组大鼠胫骨松质骨Tb.N(骨小梁数量)显著低于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组高于模型组(P>0.05)。高、低剂量组均高于模型组，有统计学差异(P<0.05)。
模型组大鼠胫骨松质骨Tb.Sp(骨小梁分离度)显著高于假手术组(P<0.01)，说明骨质疏松模型造模成功；阳性药组略低于模型组(P>0.05)。高、低剂量组均低于模型组，无统计学差异(P>0.05)。
说明补骨脂总苷提取物可以增加胫骨骨小梁的数量和厚度，减小骨小梁的分离度。结果见表3。
表3补骨脂总苷提取物对去胫骨松质骨骨形态计量学静态参数的影响
Figure BDA0002450001090000041
注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与去卵巢组比较#P<0.05，##P<0.01
3.4对胫骨松质骨骨形态计量学动态参数的影响
模型组MS/BS(矿化表面积)，MAR(矿化沉积率)，BFR/BS(新骨形成率)Ir.L Wi(所有双色荧光之间的平均距离)均显著高于假手术组(p<0.05)，说明模型组骨矿化沉积率和新骨形成率明显高于假手术组，符合双侧卵巢切除建立的骨质疏松模型骨高转换的特征。去卵巢模型为骨高转换模型，表现为骨小梁面积降低，骨小梁宽度变薄，而成骨细胞指数、破骨细胞指数、类骨质体积等骨重建指标升高，骨吸收大于骨形成，以骨丢失为主，由于骨的大量丢失，启动了骨的合成，骨合成的功能是增强的。阳性药组和补骨脂总苷提取物组MS/BS(矿化表面积)均高于模型组，有统计学差异(P<0.05,P<0.01)，且补骨脂总苷提取物组的效果优于阳性药组；阳性药组和补骨脂总苷提取物组BFR/BS(新骨形成率)均高于模型组，补骨脂总苷提取物组和模型组相比有统计学差异(P<0.05)；阳性药组和补骨脂总苷提取物组MAR(矿化沉积率)以及Ir.L Wi(所有双色荧光之间的平均距离)均略高于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。说明补骨脂总苷提取物成分可能通过促进骨形成抵抗骨丢失发挥抗骨质疏松的功效。结果见表4。
表4补骨脂总苷提取物对去胫骨松质骨骨形态计量学动态参数的影响
Figure BDA0002450001090000051
注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与去卵巢组比较#P<0.05，##P<0.01；Ir.LWi所有双色荧光之间的平均距离；MS/BS矿化表面积；MAR矿化沉积率；BFR/BS新骨形成率
3.5对生物力学指标的影响
假手术组最大载荷，弹性载荷，最大应力这三个指标均显著大于模型组(P<0.05)；阳性药组、高剂量组和低剂量组最大载荷，弹性载荷，最大应力这三个指标均显著大于模型组(P<0.05)并且高剂量组和低剂量组效果优于阳性药组，结果见表5。说明补骨脂香豆素成分可以增强股骨的生物力学强度。
表5补骨脂总苷提取物对去卵巢大鼠生物力学指标的影响
Figure BDA0002450001090000052
注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与去卵巢组比较#P<0.05，##P<0.01
综上所述，补骨脂总苷提取物防治骨质疏松症的作用主要是通过促进新骨形成矿化沉积实现的。
二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用
1.实验材料
1.1动物
斑马鱼成鱼(南京尧顺禹生物科技有限公司)，来自德国Tuebingen品系。
1.2试剂
补骨脂总苷提取物(补骨脂苷和异补骨脂苷的含量和为66.8％，江苏省中医药研究院中药制剂研究室自制)；依替膦酸二钠(上海源叶生物科技有限公司，批号20180412)；泼尼松龙(批号：FD050193,纯度98％，萨恩化学技术(上海)有限公司)；二甲基亚砜(上海泰坦科技股份有限公司，G75927B，P1265107)；茜素红(批号L01012DA14，上海源叶生物科技有限公司)；水为娃哈哈纯净水。
1.3仪器
显微镜：(Nikon ECLIPSE E100显微镜，日本Nikon尼康公司)；生化培养箱SPX-80(宁波海曙赛褔实验仪器厂)；Olypus stylus TG-4相机(日本Olypus公司)；KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLER TOLEDO AT201分析天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)。
2实验方法
2.1药物溶液的配制
泼尼松龙溶液的配制：精密称取泼尼松龙9.17mg，加1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成25mmol/L的储备液，吸取适量，用培养基配制成25μmol/L的溶液。
依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠6.09mg，加1mL培养基溶解，配制成6.09mg/mL储备液。吸取泼尼松龙和依替膦酸二钠储备液适量，加培养基配制成30μg/mL依替膦酸二钠的溶液(含25μmol/L泼尼松龙)。
取补骨脂总苷提取物供试液配制：精密称取补骨脂总苷提取物10.95mg，加50μLDMSO助溶，用培养基配制成储备液100μg/mL，分别吸取泼尼松龙和补骨脂总苷提取物储备液适量，用培养基配制成0.1、0.5、2.5μg/mL(含25μmol/L泼尼松龙)补骨脂总苷提取物溶液，即得。
2.2给药方法
将3dpf的健康斑马鱼幼鱼放入24孔板中，每孔8条，每个浓度组2孔共16条。实验组包括：0.4％DMSO空白培养基对照组、模型药物组(25μmol/L泼尼松龙)、阳性药物组(30μg/mL依替膦酸二钠)、补骨脂总苷提取物供试液组(0.1、0.5、2.5μg/mL)，每孔加入各浓度溶液2mL。将24孔板放入28.5℃恒温培养箱中培养。培养周期5天，隔天换1mL体积新溶液，培养至8dpf。
2.3斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法
斑马鱼幼鱼培养至8dpf用4％多聚甲醛处死固定过夜后，采用1％KOH配置的含1.5％H2O2漂白剂将鱼体漂白，磷酸盐缓冲液清洗后，加入茜素红染液对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色，最后用梯度比1:1的1％KOH和甘油的透明液透明，去除多余的染色剂。用专业的图像分析软件Image pro plus 6.0计算头部骨骼染色面积(Area)和累计光密度(IOD)。
2.4统计学分析
用Excel软件统计分析头部骨骼染色面积(Area)和累计光密度IOD数据，计算各组数据的平均值、标准偏差以及变异系数(n＝10-15)，t-test比较各自差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。
3实验结果
斑马鱼幼鱼(8dpf)的各浓度补骨脂总苷提取物头骨茜素红染色的显微成像(图1)和图像分析软件分析结果(表3)显示，与空白组相比，模型组泼尼松龙的骨染色矿化面积和累积光密度IOD值明显降低，均存在极显著性差异(P＜0.001)，表明泼尼松龙25μmol/L能够成功诱导斑马鱼骨量减少。与模型组相比，阳性药组依替膦酸二钠30μg/mL组中骨染色矿化面积和IOD值均显著升高(P＜0.05)。
补骨脂总苷提取物各浓度组(0.1、0.5、2.5μg/mL)斑马鱼头骨矿化面积和IOD值较泼尼松龙显著性增加(P＜0.05，P＜0.01)。提示补骨脂总苷提取物能显著阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨丢失。
表3斑马鱼幼鱼(8dpf)头骨茜素红染色面积和累积光密度(IOD)结果
Figure BDA0002450001090000071
注：与空白培养基组相比，***P＜0.001；与泼尼松龙组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
三、补骨脂总苷提取物对维生素A酸诱导斑马鱼骨丢失的防治作用
1.实验材料
1.1动物
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
1.2试剂
维生素A酸(纯度98％，批号：Y13A9C58479，上海源叶生物科技有限公司)；其余(除泼尼松龙外)同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
1.3仪器
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2实验方法
2.1药物溶液的配制
维生素A酸溶液的配制：精密称取维生素A酸6.23mg，加入1.038mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成20mmol/L储备液，吸取适量，用培养基配制成2.5μmol/L的溶液。
依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠6.0mg，加1mL培养基溶解，配制成6.0mg/mL储备液。分别吸取维生素A酸和依替膦酸二钠储备液适量，加培养基配制成30μg/mL依替膦酸二钠的溶液(含2.5μmol/L维生素A酸)。
取补骨脂总苷提取物供试液配制：精密称取补骨脂总苷提取物10mg，加50μLDMSO助溶，用培养基配制成储备液100μg/mL，分别吸取维生素A酸和补骨脂总苷提取物储备液适量，用培养基配制成0.1、0.5、2.5μg/mL(含2.5μmol/L维生素A酸)补骨脂总苷提取物溶液，即得。
2.2给药方法
将3dpf的健康斑马鱼幼鱼放入24孔板中，每孔8条，每个浓度组2孔共16条。实验组包括：0.4％DMSO空白培养基对照组、模型药物组(2.5μmol/L维生素A酸)、阳性药物组(30μg/mL依替膦酸二钠)、补骨脂总苷提取物供试液组(0.1、0.5、2.5μg/mL)，每孔加入各浓度溶液2mL。将24孔板放入28.5℃恒温培养箱中培养。培养周期5天，隔天换1mL体积新溶液，培养至8dpf。
2.3斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2.4统计学分析
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
3实验结果
斑马鱼幼鱼(8dpf)的各浓度补骨脂总苷提取物头骨茜素红染色的显微成像(图2)和图像分析软件分析结果(表4)显示，与空白组相比，模型组维生素A酸的骨染色矿化面积和IOD值明显降低，均存在极显著性差异(P＜0.001)，表明维生素A酸2.5μmol/L能够成功诱导斑马鱼骨量减少；与模型组比较，依替膦酸二钠30μg/mL组中鱼头骨染色矿化面积和IOD值均显著升高(P＜0.001)。
补骨脂总苷提取物0.5、2.5μg/mL浓度组斑马鱼头骨染色矿化面积和IOD值较维生素A酸组极显著性增加(P＜0.001)。提示补骨脂总苷提取物能显著阻止维生素A酸诱导的斑马鱼骨丢失。
表4斑马鱼幼鱼(8dpf)头骨茜素红染色面积和累积光密度(IOD)结果
Figure BDA0002450001090000081
注：与空白培养基组相比，***P＜0.001；与维生素A酸组相比，###P＜0.001。
四、补骨脂总苷提取物对地塞米松诱导斑马鱼骨丢失的防治作用
1.实验材料
1.1实验动物
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
1.2实验试剂
地塞米松：(批号：Y07D6C7163，上海源叶生物科技有限公司)，其余(除泼尼松龙外)同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
1.3实验仪器
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2实验方法
2.1药物溶液的配制
地塞米松溶液的配制：精密称取地塞米松4mg，加1mLDMSO溶解，配制成10mmol/L储备液，吸取储备液适量，用培养基配制成25μmol/L的溶液。
依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠6.1mg，加1mL培养基溶解，配制成6.1mg/mL储备液。分别吸取地塞米松和依替膦酸二钠储备液适量，加培养基配制成30μg/mL依替膦酸二钠的溶液(含25μmol/L地塞米松)。
取补骨脂总苷提取物供试液配制：精密称取补骨脂总苷提取物10mg，加50μLDMSO助溶，用培养基配制成储备液100μg/mL，分别吸取地塞米松和补骨脂总苷提取物储备液适量，用培养基配制成0.1、0.5、2.5μg/mL(含25μmol/L地塞米松)溶液，即得。
2.2给药方法
将3dpf的健康斑马鱼幼鱼放入24孔板中，每孔8条，每个浓度组2孔共16条。实验组包括：0.4％DMSO空白培养基对照组、模型药物组(25μmol/L地塞米松)、阳性药物组(30μg/mL依替膦酸二钠)、补骨脂总苷提取物供试液组(0.1、0.5、2.5μg/mL)，每孔加入各浓度溶液2mL。将24孔板放入28.5℃恒温培养箱中培养。培养周期5天，隔天换1mL体积新溶液，培养至8dpf。
2.3斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2.4统计学分析
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
3实验结果
斑马鱼幼鱼(8dpf)的各浓度补骨脂总苷提取物头骨茜素红染色的显微成像(图3)和图像分析软件分析结果(表5)显示，与空白组相比，模型组地塞米松的骨染色矿化面积和IOD值明显降低，均存在极显著性差异(P＜0.001)，表明地塞米松能够成功诱导斑马鱼骨量减少。
补骨脂总苷提取物各浓度组(0.1，0.5和2.5μg/mL)斑马鱼头骨矿化面积和IOD值较地塞米松显著性增加(#P＜0.05，##P＜0.01)。提示补骨脂总苷提取物能显著阻止地塞米松诱导的斑马鱼骨丢失。
表5斑马鱼幼鱼(8dpf)头骨茜素红染色面积和累积光密度(IOD)结果
Figure BDA0002450001090000091
Figure BDA0002450001090000101
注：与空白培养基组相比，***P＜0.001；与地塞米松组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
五、补骨脂苷和异补骨脂苷对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用
1实验材料
1.1实验动物
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
1.2实验试剂
补骨脂苷(Psoralenoside，批号：181129,纯度>98％，上海融禾医药技术有限公司)、异补骨脂苷(Isopsoralenoside，IPSS，批号：181120,纯度>98％，上海融禾医药技术有限公司)；依替膦酸二钠(上海源叶生物科技有限公司，批号20180412)；泼尼松龙(批号：FD050193,纯度98％，萨恩化学技术(上海)有限公司)；二甲基亚砜(上海泰坦科技股份有限公司，G75927B，P1265107)；茜素红(批号：L01012DA14，上海源叶生物科技有限公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
1.3实验仪器
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2实验方法
2.1药物溶液的配制
泼尼松龙溶液的配制：精密称定泼尼松龙9mg，加1mLDMSO溶解，配制成25mmol/L的储备液，吸取适量，用培养基配制成25μmol/L的溶液。
依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠6mg，加1mL培养基溶解，配制成6mg/mL储备液。吸取适量储备液，加培养基配制成30μg/mL依替膦酸二钠的溶液(含25μmol/L泼尼松龙)。
补骨脂苷和异补骨脂苷供试液配制：分别精密称取补骨脂苷9.14mg、异补骨脂苷8.906mg，加1mLDMSO溶解，配制成补骨脂苷9.14mg/mL、异补骨脂苷8.906mg/mL的溶液，分别吸取500μL，加培养基适量，分别配制成1mmol/L的储备液，分别吸取储备液20μL，分别加10mL培养基配制成2μmol/L的溶液。分别吸取补骨脂苷2μmol/L和异补骨脂苷2μmol/L的溶液适量，用斑马鱼培养基配制成0.04、0.2、1.0μmol/L(分别含25μmol/L泼尼松龙)的供试品溶液。
2.2给药方法
将3dpf的健康斑马鱼幼鱼放入24孔板中，每孔8条，每个浓度组2孔共16条。实验组包括：0.4％DMSO空白培养基对照组、模型药物组(25μmol/L泼尼松龙)、阳性药物组(30μg/mL依替膦酸二钠)、补骨脂苷、异补骨脂苷0.04、0.2、1.0μmol/L(分别含25μmol/L泼尼松龙)供试液组，每孔加入各浓度溶液2mL。将24孔板放入28.5℃恒温培养箱中培养。培养周期5天，隔天换1mL体积新溶液，培养至8dpf。
2.3斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
2.4统计学分析
同“二、补骨脂总苷提取物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的防治作用”。
3实验结果
斑马鱼幼鱼(8dpf)的各浓度补骨脂苷和异补骨脂苷斑马鱼头骨茜素红染色的显微成像(图4)和图像分析软件分析结果(表6)显示，与空白组相比，模型组泼尼松龙鱼的头骨染色矿化面积和IOD值明显降低，均存在极显著性差异(P＜0.001)，表明泼尼松龙25μmol/L能够成功诱导斑马鱼骨量减少。
补骨脂苷0.04、1.0μmol/L(P＜0.05，P＜0.01)斑马鱼头骨矿化面积和IOD值较泼尼松龙显著性增加；异补骨脂苷0.04、1.0μmol/L(P＜0.05，P＜0.01)斑马鱼头骨矿化面积和IOD值较泼尼松龙显著性增加。提示补骨脂苷和异补骨脂苷显著阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨丢失。
表6斑马鱼幼鱼(8dpf)头骨茜素红染色面积和累积光密度(IOD)结果
Figure BDA0002450001090000111
注：与空白培养基组相比，***P＜0.001；与泼尼松龙组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
以下为具体的实施例，主要目的在于证明本发明确实可行，鉴于实验开展的成本，本发明的实施并不限于如下有限列举的数据。
实施例1：
补骨脂总皂苷提取物的制备：取补骨脂饮片1kg，加入4-8倍药材重量的水煎煮2-3次，每次1-2小时，滤过，合并滤液，并浓缩成0.5～1g生药/ml的水溶液，滤过，滤液上大孔树脂柱层析，加水洗涤树脂，继用30％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，粉碎，过60-80目筛，即得补骨脂总苷提取物，重量为20.5g，其中含补骨脂苷和异补骨脂苷的含量和为63.9％。
实施例2：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加预胶化淀粉40g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例3：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素30g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例4：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素34.6g，二氧化硅2.3g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例5：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素34.3g，二氧化硅1.9g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例6：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素34.0g，二氧化硅1.5g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例7：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素27.6g，二氧化硅1.4g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例8：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加微晶纤维素22.2g，二氧化硅1.3g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。
实施例9：
补骨脂总苷提取物的制剂：将补骨脂总苷提取物40g，加糊精40g，混合均匀，填充胶囊或制粒后制成片剂。

Claims (4)

1.补骨脂总苷提取物防治骨质疏松症的新用途，所述补骨脂总苷提取物以补骨脂苷、异补骨脂苷为主。
2.如权利要求1所述的补骨脂总苷提取物，其特征在于补骨脂苷和异补骨脂苷的质量百分含量和大于50％。
3.补骨脂总苷提取物在制备治疗骨质疏松症的药中的应用。
4.如权利要求3所述的补骨脂总苷提取物，可与临床上接受的药物载体或辅料配制成治疗骨质疏松的片剂、胶囊、口服液等制剂形式。
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凌洁 等: "色谱捕获联合斑马鱼模型高效筛选补骨脂抗骨质疏松活性成分", 《中国药学杂志》 *

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