CN111826297A - 一种产琼胶酶菌株的选育方法 - Google Patents

一种产琼胶酶菌株的选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于产琼胶酶菌株选育领域，尤其是一种产琼胶酶菌株的选育方法，针对现有的产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的问题，现提出如下方案，其包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，本发明所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低，能够顺利纯化产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量。

Description

一种产琼胶酶菌株的选育方法
技术领域
本发明涉及产琼胶酶菌株选育技术领域，尤其涉及一种产琼胶酶 菌株的选育方法。
背景技术
琼胶是一种亲水性的红藻多糖，琼胶酶能够水解琼胶多糖，因此 琼胶酶在红藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程中具有重 要的价值，是海藻遗传工程的工具酶。
现有技术中，产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养 基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化 产琼胶酶菌株，因此我们提出了一种产琼胶酶菌株的选育方法，用来 解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在产琼胶酶菌株在琼脂 平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为 1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的缺点，而提出的一种 产琼胶酶菌株的选育方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、 II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种 浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯 种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂 Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单 菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃， 37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株， 挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩 增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序 公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相 似性为99.05％。
优选的，所述S1中，称量蛋白胨3-5g，琼脂10-20g，加Na+人 工海水补至1L，即可制得I型培养基。
优选的，所述S1中，称量琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得II型培养基。
优选的，所述S1中，称量蛋白胨1-2g，琼脂10-20g，加Na+人 工海水补至1L，即可制得III型培养基。
优选的，所述S3中，三种浓度的种子液的浓度分别为：10-1、 10-2、10-3。
优选的，所述S4中，在制备种子液时添加表面活性剂Tween20， 表面活性剂Tween20的浓度为6％，将种子液涂布于三种分离培养基 上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株。
优选的，所述S6中，24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产 琼胶酶的菌株，挑单菌落培养2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此 为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠 杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株， 序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA 基因序列相似性为99.05％。
优选的，在加Na+人工海水时，首先将蛋白胨和琼脂放进水箱内， 然后在水箱内设一个浮板，浮板上固定安装一个浮杆，浮杆的顶部固 定安装一个对射型光电传感器，在水箱的顶部再安装一个对射型关电 传感器，两个对射型光电传感器连上同一个控制器，当水箱内的溶液 到达1L时，此时两个对射型光电传感器正好连通，给控制发送信号， 控制器接收到信号关闭电磁阀，停止人工海水的加入，精准控制人工 海水加入量。
本发明中，所述一种产琼胶酶菌株的选育方法所用培养基为寡营 养培养基，有机营养物含量低，蛋白胨为0.5％，酵母粉为0％，在这 种寡营养配养基上顺利纯化了产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工 海水加入量，本发明所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低， 能够顺利纯化产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、 II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种 浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯 种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂 Tween20的浓度为3％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落 划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃， 37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：12h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑 单菌落培养1d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进 行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性为 99.05％。
本实施例中，称量蛋白胨3g，琼脂10g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得I型培养基；S1中，称量琼脂10g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得II型培养基；S1中，称量蛋白胨1g，琼脂10g，加Na+人工 海水补至1L，即可制得III型培养基。
实施例二
一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、 II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种 浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯 种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂 Tween20的浓度为4％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落 划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃， 37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：18h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑 单菌落培养1.5d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增 16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公 司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为： 与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性 为99.05％。
本实施例中，称量蛋白胨4g，琼脂15g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得I型培养基；S1中，称量琼脂15g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得II型培养基；S1中，称量蛋白胨1.5g，琼脂15g，加Na+ 人工海水补至1L，即可制得III型培养基。
实施例三
一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、 II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种 浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯 种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂 Tween20的浓度为6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落 划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃， 37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑 单菌落培养2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进 行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性为 99.05％。
本实施例中，称量蛋白胨5g，琼脂20g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得I型培养基；S1中，称量琼脂20g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得II型培养基；S1中，称量蛋白胨2g，琼脂20g，加Na+人工 海水补至1L，即可制得III型培养基。
本实施例一、二、三能够顺利纯化产琼胶酶菌株，且实施例三为 最佳实施例。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范 围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改 变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性为99.05％。
2.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S1中，称量蛋白胨3-5g，琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得I型培养基。
3.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S1中，称量琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得II型培养基。
4.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S1中，称量蛋白胨1-2g，琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得III型培养基。
5.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S3中，三种浓度的种子液的浓度分别为：10-1、10-2、10-3。
6.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S4中，在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株。
7.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S6中，24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性为99.05％。
8.根据权利要求2所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，在加Na+人工海水时，首先将蛋白胨和琼脂放进水箱内，然后在水箱内设一个浮板，浮板上固定安装一个浮杆，浮杆的顶部固定安装一个对射型光电传感器，在水箱的顶部再安装一个对射型关电传感器，两个对射型光电传感器连上同一个控制器，当水箱内的溶液到达1L时，此时两个对射型光电传感器正好连通，给控制发送信号，控制器接收到信号关闭电磁阀，停止人工海水的加入，精准控制人工海水加入量。
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