CN111808091A

CN111808091A - 一种二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物、制备方法及生物活性

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Publication number: CN111808091A
Application number: CN202010628296.7A
Authority: CN
Inventors: 段燕文; 黄勇; 龚邦
Original assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111808091B; WO2022002104A1

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种新的结构的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物及其制备方法。同时本发明还对所述二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物的生物活性进行了初步体外测试，发现其具有明显的细胞毒活性及抗革兰氏阳性菌活性。本发明的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物为首次发现的含二醇二氮烯鎓的天然铜配合物，在生物活性领域具有良好的应用前景，可作为潜在的抗癌药物和新型抗菌剂。

Description

一种二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物、制备方法及生物活性

技术领域

本发明涉及新型天然铜离子配合物、制备方法及其抗肿瘤应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

铜是活细胞中基本生物过程中必需的微量元素，是蛋白质必不可少的催化辅助因子，是氧化还原循环的催化剂。铜稳态对人类的重要性可以通过两种遗传病(门克斯和威尔逊(WD)疾病)的破坏性后果来说明，这两种疾病分别导致系统性铜缺乏或超负荷。铜离子配合物可作为蛋白酶体抑制剂，超氧化物歧化酶模拟物，DNA嵌入剂，并通过促进活性氧ROS产生凋亡诱导剂。铜(I)对硫醚和硫醇基具有亲和力，而铜(II)优先配位氧或咪唑氮基并与蛋白质结构相互作用，调节生化反应，并在高浓度时表现出毒性作用。同时，作为一种内源性金属，铜及其配合物的毒性要比非内源性金属(如铂)低。铜(I)配合物不稳定，作为抗肿瘤药的研究较少，相反，铜(II)配合物具有很大的抗癌潜力。铜在细胞健康功能中的重要性以及癌细胞中潜在的代谢改变已导致研究人员研究使用铜配合物作为抗癌药。早期的铜配合物如四硫代钼酸盐和氯喹醇，已在体外和临床前模型中显示出抗癌活性。人体临床试验继续评估铜配合物作为抗癌药的治疗效果，并且在了解其铜盐的药理要求方面取得了长足的进步。如目前正在复发性胶质母细胞瘤的II期临床试验中研究双硫仑和葡萄糖酸铜的协同作用。铜形成具有不同配位数、几何形状、氧化态和配体类别的复合物的能力使其在癌症治疗的背景下已经制备了许多铜配合物。癌症仍然是世界范围内主要的死亡原因之一。尽管在了解这种复杂疾病方面取得了许多进展，但仍需要新的方法来提高当前针对侵袭性肿瘤的治疗效果。

目前，化学药物是肿瘤治疗的主要手段之一。最著名且成功采用的抗癌化学药物是顺铂。1969 年，顺铂以其优异抗癌作用开创了金属配合物作为抗肿瘤药物研究的新领域。随后各种新型抗肿瘤金属配合物相继被合成，如新型铂配合物(卡铂，奥沙利铂等)、有机锡配合物、席夫碱过渡金属配合物等，并逐步投入临床应用。其中，席夫碱铜配合物大多具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性，在生化反应中起到转氨基作用，碳氮双键是该类铜配合物具有抗菌活性的效应基团。研究表明席夫碱金属配合物能够克服传统抗肿瘤药物(如顺铂)引起的耐药性及毒副作用，是具有潜力的新型抗肿瘤药物，是目前配位化学和生物无机化学研究的热点领域。

席夫碱是一类含有亚胺基或者甲亚胺基特性基团的有机铜配合物的统称。席夫碱金属配合物主要通过诱导细胞凋亡而发挥抗癌作用，其功效与其诱导细胞凋亡的能力有着密切联系。当配合物进入细胞中，与细胞中的微量金属元素生成药物-金属-酶的混合配合物从而阻止病毒的复制。与此同时，一些核酸和蛋白质又是很好的配位体，能与从配合物中解离出来的金属离子发生作用，使一些活性的官能团失活，因此具有明显的细胞毒活性。此外，席夫碱等过渡金属配合物因其可以和DNA定点发生作用，在生物无机化学研究中占据重要地位。DNA是生命重要的遗传物质，在抗癌研究中，它被认为是药物作用的主要靶点。绝大多数金属配合物切割DNA都是通过氧化还原机理进行的。金属配合物对DNA的氧化断裂按照断裂部位不同分为以糖环为靶的断裂和以碱基为靶的断裂，以碱基为靶的断裂的氧化虽不能直接引起DNA链的断裂，但在碱、加热、酶等作用下最终会产生位点特异性甚至一定程度上的序列特异性DNA的断裂。金属配合物与DNA的相互作用包括静电作用、共价结合， DNA嵌入、凹面结合、氢键结合、DNA断裂。利用这些相互作用来研究药物与肿瘤细胞的DNA结合作用机制一直是寻找新型金属药物，特别是金属抗癌药物的关键。

天然产物是最成功的药物线索来源之一。目前为止，天然铜离子配合物的报道仅有十几种。研究最深入的是甲烷氧化菌素(Methanobactin，Mbn)家族的成员，最初在Methylosinus trichosporium OB3b 中产生。Mbn具有作为治疗急性WD疾病的治疗剂的潜力。含N-亚硝基的小分子，例如细菌天然产物链脲佐菌素(Nanonitrosourea，SZN)，是突出的致癌物和重要的癌症化疗药物。2018年报道了一种新的二醇二氮烯鎓(N-亚硝基羟胺)铁载体Gramibactin，可作为一氧化氮的供体。仅有少数具有二醇二氮烯鎓的天然产物被分离出来，通常这些铜配合物表现出广泛的生物活性。目前还没有关于含有二醇二氮烯鎓的天然铜离子配合物的报道。

发明内容

针对现有技术未曾发现过二醇二氮烯鎓的天然铜离子配合物，本发明目的之一在于提供一种全新的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物。

本发明目的之二在于提供一种二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物的制备方法。

本发明目的之三在于对二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物的生物活性进行初步体外测试。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物，其结构式如下所示：

其中，铜以Cu(II)的形式占比90.52％-94.45％。

所述铜配合物中铜可以是Cu(II)、Cu(I)混合物，或者Cu(II)、Cu(0)混合物，或者Cu(II)、 Cu(I)和Cu(0)混合物，其中一价铜和零价铜为任意比例。

所述铜配合物定义为GE1。

所述铜配合物在100K温度下，在日本理学SuperNova单晶衍射仪上，采用Cu Kα射线收集衍射数据。本实施例所得产物的初始晶体结构用衍射仪的软件和Olex2通过直接法解出，并从试验结构中定位非氢原子，使用基于F²的全矩阵最小二乘法用SHELXL-2018进行各向异性精修。结果显示，所述铜配合物属于单斜晶系，P2₁空间群，

α＝90°，β＝93.782(6)°，γ＝90°，单胞体积

所述铜配合物中Cu中心处于四配位的平面四边形(O1N2O3O2)配位环境中。

所述环境由去质子化的吡咯酚盐氧(O1)、噁唑氮(N2)、去质子化的羟胺氧(O3)和N-亚硝基氧(O2)构成。所述铜配合物结构中N2-C5的键长为

为典型的席夫碱结构。

所述GE1的制备方法，包含以下步骤：

A、发酵：将链霉菌发酵，同时加入大孔树脂；

B、分离：将发酵结束后的树脂过滤、干燥、真空浓缩、萃取，得到可溶部分；后将可溶部分真空浓缩、洗涤，得到粗提物；再将粗提物溶解、过柱、洗脱、真空浓缩，得到三个组分(Fr.1-Fr.3)；进一步纯化Fr.2，得到3个组分(Fr.2.1-Fr.2.3)；进一步重结晶Fr.2.2得到铜配合物。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中所述链霉菌为Streptomyces sp.CB00271或Streptomyces sp. CB03629或其基因突变菌株。

所述链霉菌Streptomyces sp.CB00271的保藏号为CCTCC M 2020176，保藏时间为2020年6月2 日，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中所述大孔树脂为苯乙烯类树脂或丙烯腈类树脂中任一个或者组合。

在本发明的一个实施方案中，所述大孔树脂为HP20或DA201-H中任一个或者组合；

在本发明的一个实施方案中，所述大孔树脂的加入量为每100mL发酵培养基3g树脂。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中所述发酵用的培养基(每升)包含：可溶性淀粉15g，棉籽粉5g，CuSO₄ 0.1g，NaI 5mg，CaCO₃ 2g。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中所述发酵的条件为30℃，230-250rpm下7d。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中所述菌株预先培养在含有50mL胰蛋白酶大豆肉汤的平底烧瓶中。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中菌株预先培养物浓度为10vol％。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤B中发酵结束后的树脂通过离心分离，用H₂O洗涤并在室温下在空气中干燥。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中干燥后的树脂先用MeOH洗脱再进行真空浓缩。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中所述萃取用的溶液为PE:H₂O(1:1)溶液和EtOAc:H₂O (1:1)；分别萃取三次，得到乙酸乙酯可溶部分。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中所述粗提物溶解在MeOH中，并过硅胶色谱柱。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中所述洗脱用溶液为EtOAc:MeOH(10:1)。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中Fr.2通过Sephadex LH-20柱色谱法进一步纯化，得到3 个组分(Fr.2.1-Fr.2.3)。

所述铜配合物通过高分辨质谱(HRMS)、X射线光电子能谱(XPS)、单晶X射线衍射(Single crystal X-ray diffraction)、高效液相色谱分析(HPLC)进行检测。

在另一个实施方案中，提供了所述铜配合物的生物活性的初步体外测试，采用4类细胞系，包括小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10、小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1、肺癌细胞系A549、人乳腺肿瘤细胞系KPL-4。

在另一个实施方案中，提供了所述铜配合物在抗菌和抗肿瘤药物方面中的应用。

所述抗肿瘤药物包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌等，以及恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤的药物。

本发明提供的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物，具体是通过对链霉菌Streptomycessp.CB00271或 Streptomyces sp.CB03629或其基因突变菌株微生物发酵所得次级代谢产物中，分离得到一种新的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物。同时本发明还对新型天然铜离子配合物的生物活性进行了初步体外测试。更为重要的是，GE1稀有的二醇二氮烯鎓(N-亚硝基羟胺)结构是首次在天然铜离子配合物中报道。

下面对本发明做进一步的解释和说明：

二醇二氮烯鎓部分是一个引人入胜的官能团，包含两个O和两个N原子，并且具有该基团的铜配合物的发现已经有两个多世纪的时间了。但直到1966年，第一个具有二醇二氮烯鎓基团的天然产物才从Streptomyces alanosinicus中被分离出来，并将其命名为alanosine。该铜配合物显示出强大的抗病毒和抗肿瘤活性，并因其强大的抗代谢活性而进入II期临床研究。自从这一发现以来，仅发现了几种新的二醇二氮烯鎓天然产物，例如(-)-fragin，是从Pseudomonas fragi的培养上清液中分离出来的。该铜配合物具有抗真菌、抗肿瘤、抗菌和植物生长抑制作用。直到最近，在Burkholderia cenocepacia H111中才发现了首个二醇二氮烯鎓天然产物生物合成基因簇。2018年，Hertweck及其同事报道了一个新的二醇二氮烯鎓铁载体Gramibactin。目前还没有关于配合二醇二氮烯鎓的天然铜离子配合物的报道。所述二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物为链霉菌来源的含二醇二氮烯鎓的天然铜(II) 配合物，其生物活性研究为药物的研发提供了更多的选择。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种新型的二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物，具有微摩尔级别的体外细胞毒活性和与万古霉素相当的体外抗菌活性；且对肿瘤细胞系的细胞毒性与临床用药(多柔比星)为同浓度级别，且明显优于商业抗癌剂顺铂。

2、二醇二氮烯鎓(N-亚硝基羟胺)结构系首次在天然铜离子配合物中报道。

附图说明

图1是本发明的GE1的晶体结构(Single crystal X-ray diffraction)；

图2是本发明的GE1的紫外吸收光谱(UV)；

图3是本发明的GE1的高分辨质谱(HRMS)；

图4是本发明的GE1的X射线光电子能谱(XPS)。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

铜配合物的制备：

将菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271培养在含有50mL胰蛋白酶大豆肉汤的250mL的平底烧瓶中。而发酵培养基中每升含有可溶性淀粉15g，棉籽粉5g，CuSO₄ 0.1g，NaI5mg，CaCO₃ 2g，在高压灭菌前将pH调节至7.0。将种子培养物(10vol％)转移至发酵培养基中并在30℃和230-250 rpm下培养7天，同时将大孔吸附树脂HP20或DA201-H加入到发酵培养基中(加入的树脂量为每 100mL发酵液中3g)。

通过离心分离树脂，用H₂O洗涤并在室温下在空气中干燥。然后分别用3L MeOH洗脱三次并在真空下浓缩。在2L PE:H₂O(1:1)和3L EtOAc:H₂O(1:1)中萃取三次，得到乙酸乙酯可溶部分。然后将乙酸乙酯可溶的萃取物真空浓缩，得到粗提物。将粗提物(6.3g)溶解在20mL MeOH中，并进行硅胶柱色谱，用EtOAc:MeOH(10:1)洗脱，得到三个组分(Fr.1-Fr.3)，将其真空浓缩，分别得到4.3g，0.85g和1.0g原料。通过Sephadex LH-20柱色谱法进一步纯化Fr.2，得到3个组分(Fr.2.1-Fr.2.3)。对组分Fr.2.2进一步进行重结晶纯化，得到GE1(90mg)。

铜配合物的分析：

HRMS谱在LTQ-ORBITRAP-ETD仪器上记录。XPS图谱在ESCALAB250Xi(ThermoFisher-VG Scientific)仪器上记录。晶体结构通过使用SuperNova(检测器AtlasS2)单晶衍射仪进行分析。柱色谱使用的填料为100-200目和300-400目的硅胶(烟台江友硅胶开发有限公司，中国烟台)。在配备有PDA检测器和ACQUITY HPLC(Waters)，C18柱(2.7μm，4.6mm×50mm，Waters)的Waters 高效液相色谱(HPLC)系统上分析铜配合物GE1。流动相由缓冲液A(含有0.1％HCOOH的H₂O) 和缓冲液B(色谱级MeCN)以1mL/min的流速施加。线性梯度程序具体为：90％缓冲液A和10％缓冲液B至30％缓冲液A和70％缓冲液B 8分钟，30％缓冲液A和70％缓冲液B至0％缓冲液A和 100％缓冲液B 2分钟，保持0％缓冲液A和100％缓冲液B 2分钟，0％缓冲液A和100％缓冲液至90％缓冲液A和10％缓冲液B 4分钟，然后保持90％缓冲液A和10％缓冲液B 2分钟。

GE1的结构分析说明：

GE1通过全面的结构分析进行了完整的结构表征。

(1)紫外光谱分析证明了GE1含有两个特征吸收峰(最大波长分别为244和281nm)，244nm 对应的峰为C环的二氢吡咯酮系统(谱带Ⅱ)，281nm对应的峰为A、B环的吡咯-噁唑系统(谱带Ⅰ)。

(2)高分辨质谱(HRMS)分析得到GE1的[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为455.0497，与其标准分子式C₁₆H₁₇CuN₅O₇([C₁₆H₁₇CuN₅O₇+H]⁺,分子量分为455.0497)的数值一致。

(3)XPS分析表明，GE1中铜很可能是Cu(II)、Cu(I)混合物，或者Cu(II)、Cu(0)混合物，或者Cu(II)、Cu(I)和Cu(0)混合物。对于Cu(OH)₂或CuO(其中所有铜均处于Cu(II) 状态)获得可靠的A1s/Bs值，在表面上存在的Cu(I)和Cu(II)(或Cu(0)和Cu(II))相对浓度可以通过以下简单方程式获得包含这两种物质的信息：

％Cu(Ⅰ)＝A2/(A+B)*100＝(A-A1)/(A+B)*100＝(A-(A1_S/B_S)B)/(A+B)*100 (1)

％Cu(Ⅱ)＝(B+A1)/(A+B)*100＝B(1+(A1_S/B_S))/(A+B)*100 (2)

其中B是抖动峰的面积，A是主峰的总面积。

通过对GE1和标准CuO进行XPS谱图的分峰拟合处理及计算，GE1中铜以Cu(II)的形式占比为90.52％至94.45％(A1_S/B_S分别以文献参考值和实测值计算)。

(4)选取尺寸适中的绿色晶体置于SuperNova(检测器AtlasS2)单晶衍射仪上，采用石墨单色化的Mo-Kα

射线进行单晶测试。在100.00(10)K条件下，以

扫描方式在4.948°≤2θ≤49.958°范围内收集到衍射点。本实施例所得产物的初始晶体结构均采用SHELXS-97和Olex-2 直接法解出，几何加氢，非氢原子坐标及各向异性热参数采用SHELXL-97均经全矩阵最小二乘法精修。所述GE1属于单斜晶系，P2₁空间群，

α＝90°，β＝93.782(6)°，γ＝90°，单胞体积

GE1中的Cu(II)中心处于四配位的平面四边形(O1N2O3O2)配位环境中，该环境由去质子化的吡咯酚盐氧(O1)、噁唑氮(N2)、去质子化的羟胺氧(O3)和N-亚硝基氧(O2)构成。在其结构中N2-C5的键长为

为典型的席夫碱结构。所得晶体学和结构精修数据如下述表1所示，部分键长键角数据如下述表2所示，所得绿色晶体的晶体结构如图1所示，确定所得的绿色晶体为目标产物GE1配合物C₁₆H₁₇CuN₅O₇。

GE1：铜配合物颜色为绿色；UV(MeOH)：λ_max(logε)244nm,281nm,见图(2)；HRMS：C₁₆H₁₈CuN₅O₇ ⁺[M+H]⁺的计算值：455.0497，实测值：455.0497，见图(3)；XPS图谱见图(4)；晶体学数据分析见表1和表2。

表1 GE1的晶体学数据

表2 GE1的部分键长

和键角(°)数据

实施例2

GE1的细胞毒活性实验：

现对本发明的GE1进行四种不同类型的肿瘤细胞系B16-F10、4T1、A549、KPL-4的体外抗肿瘤活性测试。通过CCK8实验测定评估GE1的细胞毒性。Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐) 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，其工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)；颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比；使用酶标仪在450nm 波长处测定吸光值，间接反映活细胞数量。具体步骤为：将四种肿瘤细胞系的细胞悬液以100μL(约 5000个细胞)的密度接种在96孔板(Corning，Germany)中。每组设5个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时(37℃，5％CO₂)，使细胞贴壁；向培养板中加入100uL含药物培养基。将培养板在培养箱干预24、48、72h后，每孔加入110uL含CCK-8的培养基(每孔10uL CCK8)，在培养箱继续培养0.5-2h，酶标仪检测450nm处吸光值(A)，计算抑制率(抑制率＝(阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值)/阴性对照A值×100％)，使用分析软件GraphPad Prism 5.0进行数据处理和曲线拟合，得到细胞50％抑制率时所对应GE1浓度，也就是GE1对肿瘤细胞的IC₅₀值。表3为 CCK8实验测定GE1的细胞毒活性结果。整体来看，GE1针对所选的四种肿瘤细胞系的细胞毒性达到微摩尔级，与临床用药(如多柔比星)为同一个浓度级别，且明显优于商业抗癌剂顺铂(对人肺癌细胞系A549的IC₅₀值为21.74±1.52；Khan，Molecules，2019)。GE1对人正常结肠上皮细胞(NCM-460) 表现出略低但相同数量级(IC₅₀(μM)＝0.98±0.01)的细胞毒性。

表3 GE1的体外细胞毒活性

实施例3

GE1的体外抗菌活性测试：

本发明的GE1可以用于治疗细菌感染。

测试GE1对标准金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)，金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus 115)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus ATCC10240)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CMCC 63501)和大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌活性。使用微量肉汤稀释法确定其最小抑菌浓度(MIC)。将菌株培养过夜并在Mueller-Hinton肉汤中稀释至10⁶CFU/mL。将GE1溶解于 DMSO中，在每个96孔板上连续稀释至8个浓度(0.25,0.5,1,2,4,8,16,32μg/mL)。将万古霉素溶解在DMSO中，在每个96孔板上连续稀释至8个浓度(0.125-16μg/mL)。每孔混合50μL GE1或万古霉素和50μL菌液。万古霉素和未处理的培养基分别作为阳性和阴性对照。在每个96孔板上测试 GE1和万古霉素。将96孔板在37℃下孵育18小时。最后，向每个孔中加入50μL刃天青以显示结果。结果如表4所示。

正对照临床用药万古霉素针对标准标准金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度均为μg/mL浓度级别，实验对照组GE1的最小抑菌浓度普遍达到该浓度级别，显示出优异的体外抗菌活性。万古霉素显示抗菌无效的革兰氏阴性菌大肠杆菌，GE1在32μg/mL浓度级别下同样显示无效，说明GE1体外抗菌活性主要针对革兰氏阳性菌。

表4铜配合物GE1的抗菌活性

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims

1.一种如式(Ⅰ)所示二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物：

其中，铜以二价铜的形式占比90.52％-94.45％；

所述铜配合物中铜可以是二价铜、一价铜的混合物，或者二价铜、零价铜的混合物，或者二价铜、一价铜和零价铜的混合物。

2.根据权利要求1所述铜配合物，其特征在于，所述铜配合物在100K温度下，在日本理学SuperNova单晶衍射仪上，采用Cu Kα射线收集衍射数据。结果显示，所述铜配合物属于单斜晶系，P2₁空间群，

α＝90°，β＝93.782(6)°，γ＝90°，单胞体积

所述铜配合物结构中N2-C5的键长为

为典型的席夫碱结构。

3.根据权利要求1所述铜配合物，其特征在于，所述铜配合物中Cu中心处于四配位的平面四边形O1N2O3O2配位环境中。

4.根据权利要求3所述铜配合物，其特征在于，所述配位环境由去质子化的吡咯酚盐氧O1、噁唑氮N2、去质子化的羟胺氧O3和N-亚硝基氧O2构成。

5.制备权利要求1-4任一项所述二醇二氮烯鎓席夫碱铜配合物的方法，其特征在于，包含以下步骤：

A、发酵：将链霉菌发酵，同时加入大孔树脂；

B、分离：将发酵结束后的树脂过滤、干燥、真空浓缩、萃取，得到可溶部分；后将可溶部分真空浓缩、洗涤，得到粗提物；再将粗提物溶解、过柱、洗脱、真空浓缩，得到三个组分Fr.1-Fr.3；进一步纯化Fr.2，得到3个组分Fr.2.1-Fr.2.3；进一步重结晶Fr.2.2得到铜配合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A中所述链霉菌为Streptomycessp.CB00271或Streptomyces sp.CB03629或其基因突变菌株，所述链霉菌Streptomycessp.CB00271的保藏号为CCTCC M 2020176。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A中所述大孔树脂为苯乙烯类树脂或丙烯腈类树脂中任一个或者组合；优选的，所述大孔树脂为HP20或DA201-H中任一个或者组合；所述大孔树脂的加入量为每100mL发酵培养基3g树脂。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A中所述发酵用的每升培养基包含：可溶性淀粉15g，棉籽粉5g，CuSO₄ 0.1g，NaI 5mg，CaCO₃ 2g；所述发酵的条件为30℃，230-250rpm下7d。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B中发酵结束后的树脂通过离心分离，用H₂O洗涤并在室温下在空气中干燥；干燥后的树脂先用MeOH洗脱再进行真空浓缩；所述萃取用的溶液为体积比1:1的PE:H₂O溶液和体积比1:1的EtOAc:H₂O；分别萃取三次，得到乙酸乙酯可溶部分；所述粗提物溶解在MeOH中，并过硅胶色谱柱；步骤B中所述洗脱用溶液为初始体积比10:1的EtOAc:MeOH；步骤B中Fr.2通过Sephadex LH-20柱色谱法进一步纯化，得到3个组分Fr.2.1-Fr.2.3。

10.权利要求1-4任一项所述铜配合物在抗菌和抗肿瘤药物方面的应用。