CN111748554B - 烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用 - Google Patents

烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草miRNA基因Nt‑miRNA203在烟草烟碱含量调节中的应用的专利申请。Nt‑miRNA203成熟体长度为24bp，该miRNA基因的基因组序列长度为401bp，序列如SEQ ID NO.3所示。Nt‑miRNA203与烟草中烟碱转运蛋白MATE1调节相关，进而调节烟碱含量分布情况。进一步地对该基因的功能验证表明，超表达该基因后，可抑制烟碱转运通路有关的靶基因，从而调节烟碱分布情况，最终呈现烟叶中烟碱含量降低的技术效果。基于此技术效果，可为烟草中烟叶烟碱含量调节、以及低烟碱品种的培育奠定一定技术基础。

Description

烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用
技术领域
本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草miRNA基因Nt-miRNA203在烟草烟碱含量调节中的应用的专利申请。
背景技术
烟碱（尼古丁）是烟草中含量最高的生物碱，约占总生物碱含量的 90%左右，也是吸烟成瘾的主要原因之一。已有研究认为，烟碱主要在烟草根系中合成，随后再通过木质部运输到其他组织器官中。
随着烟草基因组测序工作开展，以及通过对相关功能基因研究，目前已获得了部分与烟碱含量调节的相关基因，这些基因的功能涉及烟碱转运、降解和转运等多个方面，为解析烟碱代谢机制奠定了较好基础。但进一步统计归类表明，目前有关烟碱代谢的基因报道绝大部分都是编码蛋白基因，而已有生物研究认为，一些miRNA对于部分代谢产物含量的调节也具有十分重要的影响，因此，对于烟碱代谢通路中的相关功能基因、以及相关非编码基因的进一步研究，对于进一步地烟草品种的改良以及烟草新品种培育具有十分重要的技术意义。
发明内容
本申请目的在于提供一个对烟草中烟碱含量具有调节作用的miRNA基因Nt-miRNA203，从而为低烟碱烟草新品种的培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
烟草Nt-miRNA203，成熟体长度为24bp，序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
AAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGU；
该miRNA基因的前体RNA序列长度108bp，序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
UGGAAGGAAUUAACCCAACAACCUUGGGCAACAGUGAGGGGAUUAAAUUCCUUAAGGAAACACAAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGUUGUUCAUCUAAUUCUCUUUCU
该miRNA基因的基因组序列长度为401bp（包括上游151bp，下游142bp），序列如SEQID NO.3所示，具体为：
TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTCTACATTTCTGCATTGTTTTCCAAAAGTAAAAACATAAGCATCAGTGTAGTTCATTGACGTTTGTTGAGTTCGACGAAGTCCTATAATTTTCATTGTAGGTATTACAGAATAGTTGTTCCGTTCTATCCTGGAAGGAATTAACCCAACAACCTTGGGCAACAGTGAGGGGATTAAATTCCTTAAGGAAACACAATTTTCTGTTGGGCTCGGAACGTTGTTCATCTAATTCTCTTTCTATCTTTTGTTTCTGATTTCGTTTTATTTTGCAGAAATTATATTTTCGAATACAAATACTAACAAGCTTAAGGAATTTAGTTTTTTTTATATTCTGTATTCATCTTACTTTCTGCTTTGGGAGACTAAAATCCTAGTGATTTT。
所述烟草Nt-miRNA203的基因组（401bp）的制备方法，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：
（1）提取基因组
以烟草红花大金元品种叶片为样品，利用CTAB法提取其基因组DNA；
（2）设计扩增用引物序列如下：
Nt-miRNA203-F：5’- TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTC -3’，
Nt-miRNA203-R：5’- AAAATCACTAGGATTTTAGTCTCCC -3’；
（3）PCR进行扩增
以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为Nt-miRNA203的401bp长度的基因组。
含有所述Nt-miRNA203的超表达载体，以pCAMBIA2300s作为载体，重组有401bp长度的Nt-miRNA203。
所述烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用，Nt-miRNA203与烟草中烟碱转运蛋白MATE1调节相关（Nt-miRNA203可与烟碱转运蛋白MATE1结合，进而降低烟碱转运蛋白MATE1转运烟碱能力），进而调节烟碱含量分布情况；进一步而言，通过利用基因工程技术手段将Nt-miRNA203超表达后，可最终降低烟草烟叶中的烟碱含量。
一种培育低烟碱含量的烟草新品种的培育方法，利用基因工程技术手段，将Nt-miRNA203基因在烟草内进行超表达，从而降低烟叶中烟碱含量；
具体而言：通过将含有401bp长度的Nt-miRNA203的重组超表达载体转化烟草后，进一步筛选获得转基因植株，该转基因植株烟叶中烟碱含量相较于原始出发植株烟叶中烟碱含量明显降低；
所述重组超表达载体的原始出发载体例如为pCAMBIA2300s；
转化烟草时所述烟草对象为烟草驯化品种，具体例如为：红花大金元。
在对烟草中相关miRNA筛选鉴定过程中，发明人通过小RNA测序获得了系列未知功能的miRNA核酸序列，进一步对其功能分析和研究后，发明人初步认为Nt-miRNA203能够干扰烟碱转运通路有关的靶基因。进一步地对该基因的功能验证表明，超表达该基因后，可抑制烟碱转运通路有关的靶基因，从而调节烟碱分布情况，最终呈现烟叶中烟碱含量降低的技术效果。基于此技术效果，可为烟草中烟叶烟碱含量调节、以及低烟碱品种的培育奠定一定技术基础。
附图说明
图1 Nt-miRNA203过表达载体构建菌落PCR阳性检测；
图2为过表达Nt-miRNA203转基因株系Nt-miRNA203的相对表达量；
图3为过表达Nt-miRNA203转基因株系靶基因QPT的相对表达量；
图4为过表达Nt-miRNA203转基因株系烟碱平均相对含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。
生物材料：
烟草材料：红花大金元（Nicotiana tobacum），常见烟草品种；
过表达载体：pCAMBIA2300s，武汉天问生科科技有限公司提供；
实验试剂：
RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、KOD DNA聚合酶、胶回收试剂盒、重组试剂盒、质粒抽提试剂盒、限制性内切酶、TBE电泳液、MS培养基、LB培养基、6-BA、NAA、卡那霉素等，均为分子生物实验中常用物料，或者参考现有技术常规配制即可，不再赘述；
实验仪器：
离心机（5424型），Eppendorf产品；
PCR仪（2720），AB GeneAmp PCR System；
电泳仪DYY-7C，北京六一；
凝胶成像系统1600，Tanon产品；
电转化仪（1652100），BIO-RAD MicroPulser产品。
实施例1
结合已有的烟草基因组测序工作，通过利用相关软件的的初步预测分析结果，发明人初步获得了Nt-miRNA203的信息。为对该基因进行进一步分析和研究，发明人进一步克隆获得了Nt-miRNA203基因，本实施例就该基因的获得过程简要介绍如下。
（一）提取基因组
以烟草红花大金元品种叶片为样品，利用CTAB法提取烟草叶片总DNA备用；具体操作可参考如下：
将叶片样品清水冲洗干净后，用75％的酒精表面消毒4-5min，再用去离子水冲洗3次；随后将样品放在灭菌的研钵中，加入液氮捣碎，再迅速转入1.5ml离心管中，加入600mlCTAB；
65℃水浴1h（每20min反转摇匀一次）；
加等体积的氯仿－异戊醇（体积比24：1），颠倒混匀，6500rpm离心30min，取上清于新管中（可重复一次）；
向上清中加入2倍体积的无水乙醇以沉淀DNA，-20℃放置不少于20min；
加75％的乙醇清洗DNA，每次12000rpm 2min，去上清； 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA；取2ul溶液电泳检测，以确保满足后续PCR扩增时的质量需要。
（二）根据前期分析结果，设计扩增用引物序列如下（设计引物时，考虑扩增上游151bp，下游142bp需要）：
Nt-miRNA203-F：5’- TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTC -3’，
Nt-miRNA203-R：5’- AAAATCACTAGGATTTTAGTCTCCC -3’。
（三）PCR进行扩增
以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增。PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：
模板DNA，1μL；
10×Buffer，5 μL；
dNTP Mixture ，1 μL(10 mM)；
Primer F，1 μL(10 μM)；
Primer R，1 μL (10 μM)；
KOD，1 μL (1U/μL)；
ddH2O加至50 μL；
PCR反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性30s，56℃退火30s，68℃延伸2 min，32个循环；68℃延伸5 min，25℃冷却1 min。
对PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，进一步提纯测序，即可获得Nt-miRNA203基因组，具体如下：
TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTCTACATTTCTGCATTGTTTTCCAAAAGTAAAAACATAAGCATCAGTGTAGTTCATTGACGTTTGTTGAGTTCGACGAAGTCCTATAATTTTCATTGTAGGTATTACAGAATAGTTGTTCCGTTCTATCCTGGAAGGAATTAACCCAACAACCTTGGGCAACAGTGAGGGGATTAAATTCCTTAAGGAAACACAATTTTCTGTTGGGCTCGGAACGTTGTTCATCTAATTCTCTTTCTATCTTTTGTTTCTGATTTCGTTTTATTTTGCAGAAATTATATTTTCGAATACAAATACTAACAAGCTTAAGGAATTTAGTTTTTTTTATATTCTGTATTCATCTTACTTTCTGCTTTGGGAGACTAAAATCCTAGTGATTTT；
进一步分析可知，Nt-miRNA203的前体RNA序列为：
UGGAAGGAAUUAACCCAACAACCUUGGGCAACAGUGAGGGGAUUAAAUUCCUUAAGGAAACACAAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGUUGUUCAUCUAAUUCUCUUUCU；
Nt-miRNA203的成熟体为：AAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGU。
实施例2
前期分析基础上，发明人认为Nt-miRNA203可与烟碱转运蛋白MATE1结合，并进而影响烟草中烟碱分布情况，并最终降低烟叶中烟碱含量。为进一步验证此假设，发明人进一步构建了超表达载体，通过在烟草中对Nt-miRNA203进行超表达，以对该基因功能进行进一步分析验证，具体实验情况简介如下。
（一）构建过表达载体
以pCAMBIA2300s质粒作为超表达载体，对其进行SacI、BamHI双酶切后，回收酶切片段，并进一步与实施例1中所回收PCR扩增产物（即Nt-miRNA203基因）进行连接；将连接产物进一步转化大肠杆菌感受态细胞，并进行抗性筛选，挑选阳性克隆子进行菌落PCR验证（验证结果如图1所示）后，进一步提取质粒进行测序验证，确保超表达质粒载体重组正确（具体操作参考现有技术即可），将最终构建正确的重组质粒超表达载体命名为：pCAMBIA2300s-Nt-miR203。
具体菌落PCR验证时，引物序列设计如下（18RI09-F前20个碱基为载体接头序列，后面为基因组DNA片段序列）：
18RI09-F，5’-TCTCGAGCTTTCGCGAGCTCTGCATATTCTCCCTTCTTTCTTC-3’，
pCB-seqE，5’-GCACCCCAGGCTTTACACTT-3’。
（二）转化工程菌
将步骤（一）中所构建的重组过表达载体pCAMBIA2300s-Nt-miR203转化农杆菌LBA4404，进一步筛选、验证获得转化正确的过表达工程菌LBA4404-pCAMBIA2300s-Nt-miR203，具体操作可参考如下。
取1μg左右步骤（一）中所构建的重组过表达载体pCAMBIA2300s-Nt-miR203，加入到100μL 农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min，液氮中放置10min；再37℃水浴5min，接着冰浴2min；加入800mL的YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3h后涂在含50μg/mL 卡那霉素的YEB平板上，28℃培养到形成单菌落。进一步进行菌落PCR鉴定，并提取质粒进行SacI与BamHI双酶切鉴定，以确保获得正确重组的过表达工程菌。
（三）转化、筛选
采用组织培养方式进行侵染，以及筛选获得纯合转基因幼苗，具体过程参考如下：
首先，获得无菌红大烟草幼苗；然后用打孔器取0.5cm左右的叶片作为叶盘预培养1d；随后，利用步骤（二）中农杆菌菌液侵染叶盘，侵染结束后再进一步采用组织培养方式形成愈伤组织、并筛选、诱导分化成苗、生根形成再生完整转基因植株（具体操作参考现有技术即可）。
对再生植株进行PCR检测，确保转基因植株转化有正确的重组过表达载体pCAMBIA2300s-Nt-miR203。
具体PCR检测时，利用CTAB法提取再生植株叶片DNA作为模板，利用nptII特异引物进行PCR扩增，具体引物序列为：
F：5’-ACTGGGACAACAGACAATCG-3’，
R：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’；
20μL扩增体系设计如下：
DNA模板，1μL；
10×PCR buffer，2μL；
dNTP mixture，0.4μL(2mmol/L each)；
F primer，0.2μL(10μmol/L)，
R primer，0.2μL (10μmol/L)，
rTaq DNA polymerase， 0.2μL(1 U/μL)；
ddH2O 加至20μL；
PCR反应程序：93℃预变性3 min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10 min。
（四）靶基因表达量及烟碱含量情况
待步骤（三）中再生转基因幼苗在生根培养基中根长至10cm左右长度时，移栽到营养土中，22℃、16h光/8h 暗条件下进行日常肥水管理等；
待继续生长4-5周后，选取长势一致的6 盆烟草幼苗（3盆阳性苗，3盆对照（相同操作，采用空质粒载体pCAMBIA2300s进行侵染））3-4片叶子作为样品，检测Nt-miRNA203、靶基因NtMATE1表达量（采用real-time PCR 技术）和烟碱含量情况。
定量PCR（real-time PCR 技术）时，具体操作参考如下：
首先，将烟叶样品于液氮中研磨成粉末，采用Trizol法提取RNA，并反转录为cDNA备用；
qPCR检测分析时，以上述cDNA（30倍稀释液）为模板，以烟草U6、26S基因为内参基因进行qPCR，20μL体系参考设计如下：
2×SYBR Green Mix，10μl；
Primer F，2μl(2μM)；
Primer R，2μl(2μM)；
cDNA模板，4 μl,；
ddH2O，2μl；
反应程序为：95℃、10min；95℃、15s，60℃、50s，40个循环；
qPCR时，具体引物序列如下：
Nt-miRNA203-qRTF:5’-GGAAGGAATTAACCCAACAACC-3’，
Nt-miRNA203-qRTR: 5’-GTTCCGAGCCCAACAGAAA-3’；
NtU6-qRTF：5’-TGGCTATGGCAGTGGAATG-3’，
NtU6-qRTR：5’-ATAACCATGACCGTGATAATTCG-3’；
NtMATE1-qRTF: 5’-TGCTGGTTCGGCTGTTATG-3’，
NtMATE1-qRTR: 5’-GCTCGTTGCTCACTCTCAC-3’；
Nt26S-qRTF：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’，
Nt26S -qRTR：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。
烟碱含量的测定，具体参考如下方法进行：
将新鲜烟叶冷冻干燥后，称取0.15 g冻干鲜叶粉于15 mL螺口耐压试管中，加入1.75 mL 5％氢氧化钠溶液，湿润试样，静置15 min；
加入10 mL 0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加盖密封后置于超声波发生器内室温下超声萃取15 min，然后在6000转/min条件下离心5 min；
取2 mL有机相进行GC/MS分析，检测烟碱含量。
对Nt-miRNA203表达量检测结果如图2所示，从图2可以看出，过表达植株Nt-miRNA203基因表达量明显升高，表明Nt-miRNA203成功被过表达。而同步对NtMATE1基因表达量检测结果如图3所示，从图3可以看出，过表达植株NtMATE1基因表达量较低，表明NtMATE1基因成功被Nt-miRNA203抑制。综合这两个结果可以看出，Nt-miRNA203的过表达，导致了NtMATE1蛋白的降低，而NtMATE1蛋白作为烟碱转运蛋白，对于烟碱分布显然具有直接影响。
对植株体内烟碱含量检测结果如图4所示。从图4中可以看出，过表达植株中烟碱含量约是对照植株烟碱含量的约38%；即，过表达Nt-miRNA203后，植株中烟碱含量下降了约62%左右。
综合上述结果可以看出，Nt-miRNA203可抑制烟碱转运相关基因NtMATE1的表达进而降低烟碱含量，利用这一成果，可为低烟碱含量烟草新品种培育奠定良好基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用
<130> none
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
aauuuucugu ugggcucgga acgu 24
<210> 2
<211> 108
<212> RNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
uggaaggaau uaacccaaca accuugggca acagugaggg gauuaaauuc cuuaaggaaa 60
cacaauuuuc uguugggcuc ggaacguugu ucaucuaauu cucuuucu 108
<210> 3
<211> 401
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 3
tgcatattct cccttctttc ttctacattt ctgcattgtt ttccaaaagt aaaaacataa 60
gcatcagtgt agttcattga cgtttgttga gttcgacgaa gtcctataat tttcattgta 120
ggtattacag aatagttgtt ccgttctatc ctggaaggaa ttaacccaac aaccttgggc 180
aacagtgagg ggattaaatt ccttaaggaa acacaatttt ctgttgggct cggaacgttg 240
ttcatctaat tctctttcta tcttttgttt ctgatttcgt tttattttgc agaaattata 300
ttttcgaata caaatactaa caagcttaag gaatttagtt ttttttatat tctgtattca 360
tcttactttc tgctttggga gactaaaatc ctagtgattt t 401

Claims (8)

1.一种烟草miRNA，其特征在于，所述烟草miRNA为Nt-miRNA203成熟体，其序列如SEQID NO.1所示，具体为：
AAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGU。
2.权利要求1中的所述Nt-miRNA203成熟体的前体RNA，其特征在于，所述前体RNA的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
UGGAAGGAAUUAACCCAACAACCUUGGGCAACAGUGAGGGGAUUAAAUUCCUUAAGGAAACACAAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGUUGUUCAUCUAAUUCUCUUUCU。
3.权利要求1中的所述Nt-miRNA203的基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTCTACATTTCTGCATTGTTTTCCAAAAGTAAAAACATAAGCATCAGTGTAGTTCATTGACGTTTGTTGAGTTCGACGAAGTCCTATAATTTTCATTGTAGGTATTACAGAATAGTTGTTCCGTTCTATCCTGGAAGGAATTAACCCAACAACCTTGGGCAACAGTGAGGGGATTAAATTCCTTAAGGAAACACAATTTTCTGTTGGGCTCGGAACGTTGTTCATCTAATTCTCTTTCTATCTTTTGTTTCTGATTTCGTTTTATTTTGCAGAAATTATATTTTCGAATACAAATACTAACAAGCTTAAGGAATTTAGTTTTTTTTATATTCTGTATTCATCTTACTTTCTGCTTTGGGAGACTAAAATCCTAGTGATTTT。
4.权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列制备方法，其特征在于，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：
（1）提取基因组
以烟草红花大金元品种叶片为样品，提取其基因组DNA；
（2）设计扩增用引物序列如下：
Nt-miRNA203-F：5’- TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTC -3’，
Nt-miRNA203-R：5’- AAAATCACTAGGATTTTAGTCTCCC -3’；
（3）PCR进行扩增
以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为Nt-miRNA203的401bp长度的基因序列。
5.含有权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列的超表达载体，其特征在于，以pCAMBIA2300s作为载体，重组有401bp长度的Nt-miRNA203基因序列。
6.权利要求1所述烟草miRNA在烟碱含量调节中的应用，其特征在于，所述Nt-miRNA203成熟体与烟草中烟碱转运蛋白MATE1调节相关，进而调节烟碱含量分布情况。
7.一种培育低烟碱含量的烟草品种的培育方法，其特征在于，通过将含有权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列重组超表达载体转化烟草后，进一步筛选获得转基因植株，该转基因植株烟叶中烟碱含量相较于原始出发植株烟叶中烟碱含量明显降低。
8.如权利要求7所述培育低烟碱含量的烟草品种的培育方法，其特征在于，所述重组超表达载体的原始出发载体为pCAMBIA2300s；
转化烟草时所述烟草对象为红花大金元。
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