CN111733257A - 一种基于coi基因片段的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于COI基因序列的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法。该方法包含以下步骤：(1)分别提取蛇鮈和长蛇鮈的基因组DNA；(2)PCR扩增蛇鮈和长蛇鮈的细胞色素氧化酶亚基I基因；(3)扩增产物纯化后，直接测序，蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示。COI基因序列第4位点碱基是T的为蛇鮈，若该位点是C的为长蛇鮈。该方法可以简便、快速、准确、有效地鉴别蛇鮈和长蛇鮈，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别蛇鮈和长蛇鮈的空白，也有利于开展蛇鮈和长蛇鮈资源调查及渔业资源物种多样性和遗传多样性保护。
Description
技术领域
本发明属于遗传学领域，涉及一种基于COI基因片段的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法。
背景技术
蛇鮈(Saurogobio dabryi)和长蛇鮈(Saurogobio dumerili)是我国淡水水体中常见的两种小型鱼类，隶属于鲤形目鮈亚科蛇鮈属，常栖息于江河、湖泊的中下层水域。蛇鮈和长蛇鮈均为杂食性鱼类，分布广泛，数量较多，是鱼类群落结构中的常见种类。两种鱼类均可供食用，具有一定的经济价值。多年来，受过度捕捞、环境污染、水利工程建设等不利因素的影响，鱼类的栖息环境受到破坏，渔业资源量急剧下降，加强渔业资源保护迫在眉睫。开展渔业资源调查是保护及修复渔业资源的基础和前提。蛇鮈和长蛇鮈生态位相近，形态和体色相似，在鱼类调查中很难区分和鉴别。目前，分子生物学技术被广泛用于鱼类的种类鉴别。线粒体DNA具有进化速率快、母系遗传、几乎无重组等特点，是鱼类鉴别中常用的分子标记。但目前尚未见以细胞色素氧化酶亚基I(Cytochrome Oxidase subunit I，COI)基因作为检测靶点用于鉴别蛇鮈与长蛇鮈的报道。
发明内容
本发明的目的是针对鱼类形态区分和鉴定的困难，提供一种蛇鮈和长蛇鮈的分子遗传鉴别方法。
本发明的另一目的是提供一种用于蛇鮈和长蛇鮈的分子遗传鉴别的引物对。
本发明的又一目的是提供该引物对的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种蛇鮈和长蛇鮈的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：
(1)分别提取待鉴定的蛇鮈和长蛇鮈的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增蛇鮈和长蛇鮈的细胞色素氧化酶亚基I基因,所述的上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2；
(3)扩增产物纯化后，直接测序，蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示。COI基因序列第4位点碱基是T的为蛇鮈，若该位点碱基是C的为长蛇鮈。
作为本发明方法的优选，所述的PCR反应体系为50μL：100ng/μL的模板DNA1μL，PCR混合液25μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，灭菌去离子水22μL。所述的PCR混合液由1.25IU的Taq酶，20mmol/L Tris-HCl，pH8.9，100mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.4mmol/LdNTP组成。PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，经30个循环后再72℃延伸8min。
一种用于蛇鮈与长蛇鮈的分子遗传鉴别的引物对，所述的引物对由能够同时扩增出包含蛇鮈和长蛇鮈COI基因第4位点的基因片段的PCR上游引物和下游引物组成；蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明的一种优选，用于蛇鮈与长蛇鮈的分子遗传鉴别的引物对由上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2组成。
本发明所述的引物对在分子遗传鉴别蛇鮈与长蛇鮈中的应用。
本发明所述的引物对在制备蛇鮈与长蛇鮈分子遗传鉴别试剂中的应用。
一种蛇鮈与长蛇鮈分子遗传鉴别试剂，包含本发明所述的引物对。
所述的蛇鮈与长蛇鮈分子遗传鉴别试剂，还优选包括PCR混合液，所述的PCR混合液由1.25IU的Taq酶，20mmol/L Tris-HCl，pH8.9，100mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP组成。
COI基因第4位点作为检测靶点在鉴别蛇鮈和长蛇鮈中的应用。
COI基因第4位点作为检测靶点在制备蛇鮈和长蛇鮈鉴别试剂中的应用。
有益效果：
本发明针对蛇鮈与长蛇鮈细胞色素氧化酶亚基I(Cytochrome Oxidase subunitI，COI)基因序列差异，首次以蛇鮈与长蛇鮈的COI基因序列作为依据，从而定性鉴别蛇鮈与长蛇鮈。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别蛇鮈与长蛇鮈，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别蛇鮈与长蛇鮈的空白，也有利于开展渔业资源调查及鱼类物种多样性和遗传多样性研究。
附图说明
图1为本发明中COI基因测序序列比对结果，相同的碱基用连接号标识，差异的碱基用星号标识。蛇鮈与长蛇鮈从第4位点(COI-4)开始，碱基序列出现差异，其中蛇鮈的第4位点碱基为T，长蛇鮈的第4位点碱基为C。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步阐明本发明，但并不是对本发明做任何形式的限定，仅仅作示例说明。
实施例1
1、引物设计
设计一对特异性PCR扩增引物，引物序列为：F：5’-TCAACCAACC-ACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物为R：5’-TAGACTTCTG-GGTGGCCAAAGAATCA-3’(SEQ ID NO.2)。
2、样本采集
取待鉴定的蛇鮈与长蛇鮈个体各40尾。
3、基因组DNA提取
利用基因组提取试剂盒提取蛇鮈与长蛇鮈的基因组DNA，将DNA溶于TE溶液。DNA完整性采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其OD值并稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。
4、PCR扩增与检测
已提取的DNA为模板，用上述引物(F和R)进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(100ng/μL)；PCR混合液25μL(1.25IU的Taq酶，20mmol/L Tris-HCl，pH8.9，100mmol/LKCl，3mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL；灭菌去离子水22μL。扩增反应程序为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，经30个循环后再72℃延伸8min。
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及特异性。
5、测序比对
检测后的PCR扩增产物纯化后送至生物公司纯化双向测序，经分析获得长度为630bp基因序列片段，蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示。比对分析后可以发现COI基因从第4位点(COI-4)的碱基序列存在差异：40尾蛇鮈第4位点(COI-4)碱基是T，40尾长蛇鮈第4位点(COI-4)碱基是C。
实施例2
按照实施例1方法，将样本扩大到蛇鮈和长蛇鮈个体各80尾，结果依然显示蛇鮈的COI基因第4位点(COI-4)碱基是T，长蛇鮈第4位点(COI-4)碱基是C。
序列表
<110> 江苏省淡水水产研究所
<120> 一种基于COI基因片段的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26
<210> 2
<211> 26
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<210> 3
<211> 630
<212> DNA
<213> 蛇鮈(saurogobio dabryi)
<400> 3
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Claims (10)
1.一种蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)分别提取待鉴定的蛇鮈和长蛇鮈的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增蛇鮈和长蛇鮈的细胞色素氧化酶亚基I基因，PCR扩增蛇鮈或长蛇鮈上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2；
(3)扩增产物纯化后，直接测序，蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第4位点碱基是T的为蛇鮈，若该位点是C的为长蛇鮈。
2.根据权利要求1所述的分子鉴别方法，其特征在于所述的PCR反应体系为50μL：100ng/μL的模板DNA 1μL，PCR混合液25μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，灭菌去离子水22μL；所述的PCR混合液由1.25IU的Taq酶，20mmol/L Tris-HCl，pH8.9，100mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，经30个循环后再72℃延伸8min。
3.一种用于蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别的引物对，其特征在于所述的引物对由能够同时扩增出包含蛇鮈和长蛇鮈COI基因第4位点的基因片段的PCR上游引物和下游引物组成；蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，长蛇鮈的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2。
5.权利要求3或4所述的引物对在分子鉴别蛇鮈和长蛇鮈中的应用。
6.权利要求3或4所述的引物对在制备蛇鮈和长蛇鮈分子鉴别试剂中的应用。
7.一种蛇鮈和长蛇鮈分子鉴别试剂，其特征在于包含权利要求3或4所述的引物对。
8.根据权利要求7所述的蛇鮈和长蛇鮈分子鉴别试剂，其特征在于还包括PCR混合液，所述的PCR混合液由1.25IU的Taq酶，20mmol/L Tris-HCl，pH8.9，100mmol/L KCl，3mmol/LMgCl2，0.4mmol/L dNTP组成。
9.COI基因第4位点作为检测靶点在鉴别蛇鮈和长蛇鮈中的应用。
10.COI基因第4位点作为检测靶点在制备蛇鮈和长蛇鮈鉴别试剂中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201002 |