CN111721762B - 水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，包括如下步骤：步骤1：花生幼苗的培养；步骤2：磷活化效率的鉴定：具体的，步骤2.1：花生幼苗的磷处理；步骤2.2：植株难溶性钙磷处理；步骤2.3：植株难溶性钙磷的溶解；步骤2.4：取样测定，采用钼锑抗比色法测定营养液中的磷含量，利用公式：磷活化量＝加入的难溶性磷质量浓度—溶液中剩余磷质量浓度，进而得到花生对磷的活化速率(mg/pot/d)。本方法通过水培方式，提供的磷源为植物可以直接吸收利用的速效磷，因此可以排除活化难溶态磷对植物吸收的影响，测量结果准确可靠。

Description

水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法。

背景技术

磷是一种无机盐,无机盐是与水一起进入植物体内的。土壤中大部分磷以难溶性磷形式存在,是影响作物生产的重要限制因素之一。不同作物对磷的吸收活化速度不同，通过对磷活化速率的测定可以反应植物，如花生根系活化难溶态磷的效率。但传统的土培或大田培养方式，很难鉴定植物对难溶性磷的活化效率。目前也暂无很好的对水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，以水培为研究方法，提供的磷源为植物可以直接吸收利用的速效磷，因此可以排除活化难溶态磷和固定态磷对植物吸收的影响，并且水培条件下，植株的根系完整性较好，较土培和大田条件下不容易损伤根系。

本发明的技术方案如下：

一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：花生幼苗的培养；

步骤2：磷活化效率的鉴定：

步骤2.1：花生幼苗的磷处理，将花生幼苗分为两组，一组进行适磷处理 (HP)，另一组进行低磷处理(LP)；

步骤2.2：植株难溶性钙磷处理，将磷处理后的花生植株移至含难溶性钙磷的营养液中处理2～5d；

步骤2.3：植株难溶性钙磷的溶解，将处理完的植株小心冲洗干净根部吸附的难溶性钙磷，将冲洗液与营养液混匀后定容到黑色水培盒最大容量，加入浓盐酸搅拌至难溶性钙磷溶解完全；

步骤2.4：取样测定，取步骤2.3中的营养液采用钼锑抗比色法测定营养液中的磷含量，利用公式：

磷活化量＝加入的难溶性磷质量浓度—溶液中剩余磷质量浓度，进而可得到花生对磷的活化速率(mg/pot/d)。

上述鉴定方法中，步骤2.1具体为：将定植有花生幼苗的黑色水培盒分为两组，将花生幼苗取出放入营养液中进行磷处理，一组进行适磷处理(HP)，另一组进行低磷处理(LP)，营养液配好后用盐酸或氢氧化钠调整pH值，然后培养15～17d。进一步的，该步骤中，用盐酸或氢氧化钠调到pH6.5。

进一步的，在上述步骤2.1中，LP处理的营养液添加KCL补充K离子，

使两组不同磷水平处理的营养液中除P元素外其余营养元素完全一致。

上述鉴定方法中，步骤1中，种子萌发后在黑色水培盒中定植幼苗，定植数量不多于黑色水培盒孔数的一半，在黑色水培盒中加入去离子水，将花生幼苗在去离子水中培养3d。最佳的，种子萌发到子叶完全展开且幼根萌发出细小侧根时向黑色水培盒中移植。

根据本发明所述的一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，最佳的，在步骤2.1之后，步骤2.2之前还进行磷吸收效率的鉴定。

本发明的有益效果在于：

本发明公开的水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，以水培为研究方法，提供的磷源为植物可以直接吸收利用的速效磷，因此可以排除活化难溶态磷和固定态磷对植物吸收的影响，并且水培条件下，植株的根系完整性较好，较土培和大田条件下不容易损伤根系，对磷活化效率的鉴定更加准确。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。需要说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本发明一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：花生幼苗的培养；

步骤1.1：种子的准备，选择度过休眠期、大小均匀饱满、种皮完整的花生种子若干粒，将种子用酒精浸泡消毒后，用0.1％H₂O₂溶液浸种8-12h，浸种期间保持黑暗环境，双氧水有消毒、催芽的作用，但浸种时间不宜过长，否则将不利于种子萌发。优选的，本步骤中的酒精浓度在70～80％之间，浸泡消毒时间在27～33s之间，时间过长则会对花生造成伤害。

步骤1.2：发芽盒的准备，将发芽盒里外清洗干净，发芽盒底部用去离子水打湿，方便发芽盒内壁与保鲜膜贴紧，打湿后，用保鲜膜将发芽盒底部和内壁完全包裹，之后铺上一层基底层，并用去离子水浸湿，基底层上用于放置花生种子。该基底层的厚度设置在3～4mm之间，厚度太大则种子容易发霉且浪费资源，厚度太小则不存水，容易使种子萌发缺水。

步骤1.3：种子的萌发，将浸泡后的种子用去离子水清洗后，均匀排列在湿润的棉制品上，清洗次数以3次以上为宜，能够将种子完全洗净。最后用保鲜膜封口萌发4～6d，在此期间，种子萌发始终处于湿润环境。在种子萌发的前三天置于黑暗环境，3d后，左右子叶稍微张开，胚根萌发后移至光照环境中，否则，幼叶将发黄不产生叶绿素。因为开始储存在棉制品上的水分随种子萌发吸收和蒸发会有损失，因此在萌发期间还需补充一次水分。待子叶完全展开且幼根萌发出细小侧根时，取根系粗壮且大小均匀一致的幼苗移植到黑色水培盒中。

步骤1.4：花生幼苗的培养，在黑色水培盒中定植幼苗，定植数量不多于黑色水培盒孔数的一半，以避免花生植株生长后期水培盒内根系生长不开，在黑色水培盒中加入去离子水，将花生幼苗在去离子水中培养3d。由于刚刚移苗时花生植株太小，子叶中储存的营养物质够幼苗生长所需。3d左右幼苗生长过大，需要外界营养补充，培养天数少于3d，则花生幼苗后期不能很好的吸收营养液；而多于3d，花生幼苗生长会因营养不良而导致生长缓慢。而且先在去离子水中培养3d，给移苗后的花生幼苗提供了一个平衡、缓冲的时间。

该步骤中黑色水培盒数量不少于6盒。优选的，在步骤五中进行适磷处理和低磷处理的花生幼苗盒数，每种至少包括3盒。可保证每个磷水平处理能够进行 3个生物学重复，而增加黑色水培盒的话，增大了工作量，但效果不明显。

上述步骤中，在种子萌发期以及整个培养期间，生长室温度控制在20～ 26℃，光照强度为6000～7000LX，每天光照15～20h。

步骤2：磷活化效率的鉴定：

步骤2.1：花生幼苗的磷处理，将定植有花生幼苗的黑色水培盒分为两组，将花生幼苗取出放入营养液中进行磷处理，一组进行适磷处理(HP)，另一组进行低磷处理(LP)，除了KH₂PO₄外两个处理加入的其他营养物质完全一样，因HP处理的K离子多于LP处理，LP处理中多加入KCL使K离子与HP处理一致，使两组不同磷水平处理的营养液中除P元素外其余营养元素完全一致。具体的，K离子加入量按照HP处理KH₂PO₄中K离子的量。待营养液配好后用盐酸或氢氧化钠调到pH6.5，然后培养15～17d。天数过短，则两组不同磷水平处理的花生植株差异性表现不明显。

本步骤中所说的营养液包括KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、 KH₂PO₄、EDTA·Fe、H₃BO₃、MnSO₄、ZnSO₄·7H2O、Na₂MoO₄·2H₂O、 CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O，最佳的，营养液成分为KNO₃ 1mmol/L；Ca(NO₃) ₂·4H₂O 1mmol/L；MgSO₄·7H₂O 0.4mmol/L；EDTA·Fe0.01mmol/L；H₃BO₃ 0.1×10^-3μmol/L；MnSO₄ 0.15×10^-3μmol/L；ZnSO₄·7H2O 0.03×10^-3μmol/L； Na₂MoO₄·2H₂O 1×10^-6μmol/L；CuSO₄·5H₂O 0.16×10^-6μmol/L；CoCl₂·6H₂O 0.21×10^-6μmol/L。KH₂PO₄的含量根据HP和LP处理的不同，分别选择 0.6mmol/L和0.01mmol/L。

如上所述的水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，步骤五中在磷处理过程中每4d更换一次培养液，以补充氧气。

步骤2.2：植株难溶性钙磷处理，将磷处理后的花生植株移至含难溶性钙磷的营养液中处理2～5d。所述难溶性钙包括磷酸钙。

步骤2.3：植株难溶性钙磷的溶解，将处理完的植株小心冲洗干净根部吸附的难溶性钙磷，将冲洗液与营养液混匀后定容到黑色水培盒最大容量，加入浓盐酸搅拌至难溶性钙磷溶解完全。具体加入的浓盐酸的量以溶液无白色沉淀为宜。

步骤2.4：取样测定，取步骤七中的营养液采用钼锑抗比色法测定营养液中的磷含量，利用公式：

磷活化量＝加入的难溶性磷质量浓度—溶液中剩余磷质量浓度，进而可得到花生对磷的活化速率(mg/pot/d)。

进一步的，取样测定时，取样量至少能进行三次比色，具体的，可根据加入的难溶性钙磷估算溶液中的磷浓度和比色方法的标准曲线范围确定决定比色所用量。

实施例2

一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，在种子萌发期以及整个培养期间，生长室温度控制在24℃，光照强度为7000LX，每天光照17h。具体步骤如下：

步骤1：花生幼苗的培养；

步骤1.1：种子的准备，选择度过休眠期、大小均匀饱满、种皮完整的花生种子120粒，将种子用75％酒精浸泡消毒30s后，用0.1％H₂O₂溶液浸种10h，浸种期间保持黑暗环境。

步骤1.2：发芽盒的准备，将发芽盒里外清洗干净，发芽盒底部用去离子水打湿，方便发芽盒内壁与保鲜膜贴紧，打湿后，用保鲜膜将发芽盒底部和内壁完全包裹，之后铺上一层4mm厚的脱脂棉，并用去离子水浸湿，湿润程度以手指按压出水为宜。

步骤1.3：种子的萌发，将浸泡后的种子用去离子水清洗3次后，均匀排列在湿润的脱脂棉上，胚根统一朝向，以12*10方阵排列。最后用保鲜膜封口萌发 5d。在种子萌发的前三天置于黑暗环境，3d后，待子叶张开，胚根萌发后移至光照环境中，在萌发期间补充一次水分。待子叶完全展开且幼根萌发出细小侧根时，取根系粗壮且大小均匀一致的幼苗移植到黑色水培盒中。

步骤1.4：花生幼苗的培养，培养容器为12孔黑色水培盒，市面上方便购买。每盒定植6株幼苗。对多个品种的花生进行磷吸收速率鉴定时，每个花生品种移植6盒。在黑色水培盒中加入去离子水1.4L，先将花生幼苗在去离子水中培养3d，再进行磷处理。

步骤2：磷活化效率的鉴定：

步骤2.1：花生幼苗的磷处理，将定植有花生幼苗的黑色水培盒分为两组，每组3盒，将花生幼苗取出放入营养液中进行磷处理，一组进行适磷处理(HP， 0.6mmol/LKH₂PO₄)，另一组进行低磷处理(LP，0.01mmol/L KH₂PO₄)。

营养液其余成分采用KNO₃ 1mmol/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O 1mmol/L； MgSO₄·7H₂O0.4mmol/L；EDTA·Fe 0.01mmol/L；H₃BO₃ 0.1×10^-3μmol/L；MnSO₄ 0.15×10^-3μmol/L；ZnSO₄·7H2O 0.03×10^-3μmol/L；Na₂MoO₄·2H₂O 1×10^-6μ mol/L；CuSO₄·5H₂O 0.16×10^-6μmol/L；CoCl₂·6H₂O 0.21×10^-6μmol/L。

两组磷处理的营养液中，除了KH₂PO₄外其他营养物质完全一样，因HP处理的K离子多于LP处理，LP处理中需多加入KCL使K离子与HP处理一致，使两组不同磷水平处理的营养液中除P元素外其余营养元素完全一致。具体的， K离子加入量按照HP处理KH₂PO₄中K离子的量。待营养液配好后用盐酸或氢氧化钠调到pH6.5，然后培养16d。培养过程中，每4d更换1次培养液。

步骤2.2：植株难溶性钙磷处理，将磷处理后的花生植株移至含磷酸钙的营养液中处理4d。难溶性钙磷浓度为4mmol/pot，即0.62g磷酸钙，转化为纯磷浓度为124mg，即加入的难溶性磷质量浓度为124mg/盒。

步骤2.3：植株难溶性钙磷的溶解，将处理完的植株小心冲洗干净根部吸附的难溶性钙磷，将冲洗液与营养液混匀后定容到1.4L，加入10ml浓盐酸搅拌至难溶性钙磷溶解完全。

步骤2.4：取样测定，取2ml步骤七中的营养液采用钼锑抗比色法测定营养液中的磷含量，比色次数至少三次，然后利用公式：

磷活化量＝加入的难溶性磷质量浓度—溶液中剩余磷质量浓度，进而可得到花生对磷的活化速率(mg/pot/d)。

通过上述公式测得的不同花生品种分别在LP和HP的吸收速率参见下表：

实施例3：

在进行磷活化效率的鉴定之前，可先进行磷吸收效率的鉴定，有利于通过培养一次花生植株，先后实现磷吸收和磷活化效率的鉴定，既节省了花生植株培养时间，又提高了鉴定效率。本实施例在实施例1或实施例2的基础上，在步骤 2.1之后，步骤2.2之前进行磷吸收效率的鉴定，具体操作为：

取样测定，先将植株移入去离子水中饥饿20h以上，再将根系全部浸入含P 浓度为0.2mmol/L的吸收溶液中，处理完后，取出植株，采用钼锑抗比色法测定吸收前后吸收溶液中H₂PO₄浓度的变化，利用公式：Ip＝(Q₁-Q₂)/(h*N)得到该吸收阶段的平均吸收速率(μmol/h/株)，其中，Q₁：吸收前磷含量，Q₂：吸收后磷含量，h：吸收时间，N：每盒黑色水培盒内株数。

最佳的，在上述吸收溶液中的处理中，LP处理吸收7～9h(如8小时)， HP处理吸收22～25h(最好24小时)。

磷吸收效率测定完成后，先将各磷水平处理的植株移入去离子水中至少平衡12h，再执行步骤2.2。通过此平衡操作可使植株消耗速效磷处理时吸收的磷，有利于磷活化鉴定结果的准确性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或增减替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：花生幼苗的培养；

步骤2：磷活化效率的鉴定：

步骤2.1：花生幼苗的磷处理，将定植有花生幼苗的黑色水培盒分为两组，将花生幼苗取出放入营养液中进行磷处理，一组进行适磷处理（HP），另一组进行低磷处理（LP），低磷处理的营养液添加KCl补充钾离子，使两组不同磷水平处理的营养液中除磷元素外其余营养元素完全一致，营养液配好后用盐酸或氢氧化钠调整pH值，然后培养15～17d；

步骤2.2：植株难溶性钙磷处理，将磷处理后的花生植株移至含难溶性钙磷的营养液中处理2～5d；

步骤2.3：植株难溶性钙磷的溶解，将处理完的植株小心冲洗干净根部吸附的难溶性钙磷，将冲洗液与营养液混匀后定容到黑色水培盒最大容量，加入浓盐酸搅拌至难溶性钙磷溶解完全；

步骤2.4：取样测定，取步骤2.3中的营养液采用钼锑抗比色法测定营养液中的磷含量，利用公式：

磷活化量 = 加入的难溶性磷质量浓度—溶液中剩余磷质量浓度，进而可得到花生对磷的活化速率。

2.根据权利要求1所述的一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，用盐酸或氢氧化钠调到pH6.5。

3.根据权利要求1所述的一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，步骤1中，种子萌发后在黑色水培盒中定植幼苗，定植数量不多于黑色水培盒孔数的一半，在黑色水培盒中加入去离子水，将花生幼苗在去离子水中培养3d。

4.根据权利要求3所述的一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，种子萌发到子叶完全展开且幼根萌发出细小侧根时，向黑色水培盒中移植。

5.根据权利要求1所述的一种水培条件下花生种质磷活化效率的鉴定方法，其特征在于，在步骤2.1之后，步骤2.2之前还进行磷吸收效率的鉴定。