CN111690567B - 一种海带白化病致病菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种海带白化病致病菌，为海水假交替单胞菌X‑8株(Pesudoalteromonas X‑8),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC20099，保藏日期为2020年06月17日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所提供的海水假交替单胞菌X‑8株可用于筛选抗白化病的海带品系。本发明所筛选获得的假交替单胞菌X‑8株经复染健康海带幼苗证实，可引起健康海带产生白化病症，是海带苗期白化病的致病菌；使用该菌株可以用于筛选具有抗白化病的海带品系。

Description

一种海带白化病致病菌
技术领域
本发明属于养殖海藻病害防治技术领域，具体涉及一种海带白化病致病菌。
背景技术
海带是我国重要的大型经济养殖海藻，年产量约为150万吨。海带养殖已成为我国海水养殖业的主要支柱产业之一。与高等农作物一样，海带的苗期及养殖期也会有病害发生，严重时可导致减产20-50％。由于藻类致病菌多为条件致病，即正常情况下，存在于健康藻体上，并不表现致病性，只有当环境因子发生变化时(如温度升高、光照变化以及环境污染等)才表现出致病性。随着海带养殖业的发展，海带育苗和养殖过程中频频爆发的病害引起越来越多的关注。
白化病是海带育苗开始后一个半月或两个月时经常爆发的一种细菌性病害。主要病症是在海带幼苗的尖端(远离基部生长点的组织)产生白色斑块，如得不到很好的控制，发病部位就会发生绿烂，极大地影响健康海带种苗的供应以及后续的养殖生产。
为了研究致病原因，传统上采用分离培养的方法来筛选致病菌，即从病害藻体分离、纯化致病菌，通过复染产生相同的病症，再次从病害的藻体上分离、纯化致病菌。但由于传统方法的局限性，鉴定到种的致病菌数量寥寥无几。到目前为止，很难确定海带病害的致病菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种海带白化病致病菌，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的海带白化病致病菌，为杀鱼假交替单胞菌X-8株(Pseudoalteromonas piscicida X-8),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20099，保藏日期为2020年06月17日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的杀鱼假交替单胞菌X-8株可用于筛选抗白化病的海带品系。
本发明所筛选获得的假交替单胞菌X-8株经复染健康海带幼苗证实，可引起健康海带产生白化病症，是海带苗期白化病的致病菌；使用该菌株可以用于筛选具有抗白化病的海带品系。
附图说明
图1：X-8侵染健康海带幼苗的图片，其中A显微镜观察下健康海带幼苗组织；B显微镜下观察侵染后白化病海带幼苗组织，Bar:20μm；
图2：16S DNA通用引物PCR扩增产物的电泳图谱图，其中泳道1为DNA markerDL2000；泳道2为16S DNA扩增的目的片段；经PCR扩增后用1％的琼脂糖凝胶电泳30min可观察到明亮的条带，大小为1400bp左右；
图3：X-8的菌落形态及扫描电镜图片图，其中a：X-8菌落形态特征，Bar：1cm；b：X-8的扫描电子显微镜图像，Bar：1μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：致病菌的分离、纯化
2017年12月从山东荣成某海带育苗场的白化病海带幼苗中分离细菌。选取白化病的海带幼苗，用无菌海水将其表面杂质冲掉，置于无菌的研钵中研磨成匀浆状。用无菌海水将匀浆液按10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释，分别取不同稀释液少许(0.5mL)，使用三角形无菌玻璃涂布棒涂布于Zobell 2216E固体培养基上。25℃恒温培养中培养24-72h，观察菌落的生长和形态。之后使用接种环挑取10-3稀释梯度平板上的菌落继续在Zobell 2216E固体培养基上分离划线，纯化直至分离到单菌落。在本次纯化实验中，共分离出10株纯化菌株，经健康海带幼苗侵染实验验证，只有X-8菌株具有致病性。纯化菌株编号后置于30％甘油、-80℃保存。
实施例2：菌株致病的研究
从-20℃冰箱取出保存的菌液，吸取1mL于100mL Zobell 2216E液体培养基中在振荡培养箱中培养，24h后吸取1mL于100mL Zobell 2216E液体培养基中继续培养，12h后吸取2mL过夜培养液于200mL Zobell 2216E液体培养基中继续培养，培养条件为25℃，转速为120r/min。4h后吸取菌液测量菌液的浓度。此时菌液生长处于对数生长期。
选取生长状态良好、健康的海带幼苗，置于盛有无菌海水的培养皿中，然后用灭菌刀片将孢子体切割成小块(1.0cmx1.0cm)。将海带组织块放入培养板中，并在培养板中加入1mL X-8菌液(浓度108cfu/mL)，置于光照培养箱中培养。培养温度为10±1℃，光照强度160μmol·m-2·s-1，光暗比L：D＝12h：12h。对照组加入1mL无菌海水。感染4小时后，发生率为8.3％。8小时后，发病率达到25％。10小时后，发病率达到83.3％(图1)。12小时后，全部致病。
选取X-8侵染的白化病海带幼苗，重复实施例1致病菌的分离、纯化步骤，分离出6株菌株，经16S rDNA分子鉴定是同一株细菌。
实施例3：致病菌株的分析
提取细菌基因组DNA，具体的引物序列信息如下：
27F:5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行16SrDNA的PCR扩增，扩增片段大小为1397bp(图2)。
经过NCBI比对，所筛选的菌株X-8株与来自美国特拉华州沿岸的两株杀鱼假交替单胞细菌--Pesudoalteromonas piscicida strain DE2-A和Pesudoalteromonaspiscicida strain DE2-B的相似度最高；因此命名为杀鱼假交替单胞菌X-8株(Pesudoalteromonas X-8),该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20099，保藏日期为2020年06月17日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
X-8菌落的颜色为橙色，不透明，凸起，且边缘规则。扫描电子显微镜显示X-8是杆状，具有极生单鞭毛(图3)。
X-8株的培养条件如下：将处于对数生长期的X-8菌液稀释成10-3，在Zobell 2216E固体培养基上涂布；培养基：Zobell 2216E固体培养基，培养条件：25℃，光暗比L：D＝12h：12h；培养时间：24h，可有效扩增X-8菌株。
本发明所筛选的假交替单胞菌X-8株可用于海带苗期抗白化病种苗的筛选，以期获得海带抗病种苗种质资源，预防海带苗期白化病的爆发。

Claims (2)

1.一种海带白化病致病菌，其特征在于，所述的海带白化病致病菌为杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonasp iscicida）X-8株，其保藏编号为CGMCC No.20099。
2.权利要求1所述海带白化病致病菌在筛选抗白化病的海带品系中的应用。
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