CN111676240A - 一种新疆杨遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以叶片为受体农杆菌介导的新疆杨遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，其通过利用农杆菌介导法，在共培养过程中，携带有目的基因的T‑DNA在农杆菌体内完成加工，向苗叶片的植物细胞转化，整合进植物基因组。本发明的优点是：省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立新疆杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。

Description

一种新疆杨遗传转化方法
技术领域
本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以叶片为受体农杆菌介导的新疆杨遗传转化方法。
背景技术
新疆杨是我国重要的造林、城市绿化和工业用材树种。在我国特别是西北的生态建设和商品林建设中占有不可替代的地位。在西北地区由于气候干旱、土壤盐碱化等环境的影响，杨树的生长、代谢和生产力备受影响，其中干旱是抑制植物生长和产量的主要因素之一。它在所有的非生物限制因子中占首要地位，对林木及农作物造成的损失仅次于病虫害类等生物胁迫的损失。培育耐旱、耐盐碱的林草品种是实现困难立地造林和植被恢复的前提，可以防止荒漠化、盐碱化进一步加剧。促进生态环境特别是脆弱生态环境的建设，保障社会经济发展和人民的生产生活安全。
新疆杨虽然具有一定的抗性，但在未经改良的盐碱地、沼泽地、戈壁滩等地均生长不良。随着森林遗传工程技术的不断完善，基因转化技术在提高杨树抗逆性和品质方面的应用日益增多。
目前新疆杨转基因研究的遗传转化条件难以统一，转化效率不高，影响杨树基因功能研究，并且一般必须要经过诱导愈伤组织阶段，培养程序复杂，培养周期较长，不利于大规模复制进行遗传转化。
发明内容
本发明的目的是根据上述现有技术的不足，提供了一种新疆杨遗传转化方法，通过采用无菌苗叶片为外植体进行遗传转化，提高转化率，为林木的遗传改良提供了一个新途径。
本发明目的实现由以下技术方案完成：
一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）以新疆杨的苗叶片为外植体，对所述苗叶片进行切口，并将切口后的所述苗叶片放置于培养基上进行预培养；
（2）将经步骤（1）处理过的所述苗叶片浸入含有目的基因的农杆菌侵染菌液中并持续一定时间；
（3）将经步骤（2）处理过的苗叶片接种于培养基中进行共培养；
（4）对经步骤（3）处理的所述苗叶片进行吸取农杆菌，并转移到培养基中进行诱导选择培养直至所述苗叶片上分化出抗性芽；
（5）当步骤（4）中的所述抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行增殖抗性芽培养；
（6）当步骤（5）中的所述增殖抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行生根培养实现所述目的基因向新疆杨的遗传转化。
所述步骤（1）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养期，其组分为：MS+TDZ 0.05mg/L+IBA 0.3mg/L。
所述步骤（2）中的侵染菌液为以农杆菌作为介导，并通过下述制备步骤：
农杆菌纯化培养：用接种环从-80℃保存好的农杆菌菌液中挑取一环，然后在附加卡那霉素的LB培养基平板上划线，将培养皿倒置放在恒温培养箱中，28℃培养2-3d即可获得分离的单菌落；在超净工作台上，挑取所述单菌落，接种到无菌离心管里，附加一定量抗生素及Rif的LB液体培养基中，在恒温摇床上小摇培养；
工程菌液的制备：在超净工作台上，将培养好的菌液取200-400μL转入无菌三角瓶中，附加一定抗生素的LB液体培养基中，放置恒温摇床上，振荡培养120h至OD=0.5-0.7，从而获得所述侵染菌液。
所述恒温摇床的培养温度为28℃，转速为150rpm。
所述步骤（2）中，将所述苗叶片浸入含有农杆菌的所述侵染菌液中振荡侵染10min，之后取出所述苗叶片放至无菌滤纸上吸取多余的侵染菌液。
所述步骤（3）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.3mg/L。
所述步骤（4）中的所述培养基为不定芽诱导选择培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.3mg/ L+Kan 50mg/L+Timentin 400mg/L。
所述步骤（5）中的所述培养基为增殖培养基，其组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.3mg/L+Kan 50mg/L+Timentin 200mg/L，pH值为5.95-5.98。
所述步骤（6）中的所述培养基为生根培养基，其组分为：1/2 MS+IBA 0.5mg/L+Kan50mg/L +Timentin 200mg/L。
根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）和所述步骤（6）中的培养温度为25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间为12h/d。
本发明的优点是：采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，它不通过诱导愈伤组织阶段而直接诱导不定芽，即省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立新疆杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
实施例：本发明提供了一种新疆杨遗传转化方法，包括如下步骤：
（1）从组培苗顶部的第1片叶往下数，选取充分展开、颜色为深绿色、大小、形状、色泽基本一致的叶片。用手术刀沿着主叶脉横切2-3个伤口，将新疆杨叶片背面向下放置与叶片诱导不定芽培养基上预培养2d。叶片诱导不定芽培养基为：MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.3 mg/L。
（2）农杆菌活化及菌液的制备
①农杆菌纯化培养：用接种环从-80℃保存好的菌液中挑取一环，然后在附加卡那霉素的LB培养基平板上划线，将培养皿倒置放在恒温培养箱中，28℃培养2-3d即可看到分离的单菌落。在超净工作台上，挑取单菌落，接种到无菌离心管里，附加相应抗生素及少量Rif的LB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃，150rpm小摇培养24h，
②工程菌液的制备：在超净工作台上，将上述培养好的菌液取200-400μL转入无菌三角瓶中，附加相应抗生素的LB液体培养基中，放置恒温摇床上，振荡培养12 h至OD=0.5-0.7备用。恒温摇床的培养温度为28℃，转速为150 r/min。
（3）将经步骤（1）预培养处理后的叶片浸入步骤（2）的侵染菌液中，振荡侵染10min，取出叶片放到无菌滤纸上吸取多余的菌液，接种于叶片诱导不定芽培养基上，在25℃下的暗处共培养3d；共培养基为MS+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.3mg/L。
（4）对共培养后的叶片用无菌滤纸吸取农杆菌，转移到不定芽诱导选择培养基上培养，每隔15d换一次新的培养基直到分化出抗性芽，其中，选择培养基为：MS+TDZ 0.1 mg/L+IBA 0.3 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+400 mg/ L Timentin
采用风光光度计测菌液浓度，在OD600=0.7时进行实验。结果如表1，控制好植物外植体的侵染时间有助于减轻后续培养，因农杆菌过度繁殖造成对外植体的毒害，从而降低转化率，一般侵染时间控制在数秒到数分钟内。杨树的侵染时间一般为10-60 min。本实施例的试验中将菌液侵染时间设计了4个不同梯度，来观察其对芽诱导频率的影响。结果表明，侵染时间为5 min时，转化率低，假阳性芽多，转化率仅为2.5%。侵染时间为10min时，转化率明显高于其他处理，转化率为20%。当侵染时间延长至15-20min时，在培养过程中，叶片表面及培养基上长有较多的农杆菌，有的叶片被包埋于乳白色的菌液中，将其转接到新的特美汀浓度为500mg/L培养基上，仍不能抑制农杆菌的过度增殖，最终叶片死亡，没有芽产生。实验结果表明，转化新疆杨时，用的菌液侵染时间为10 min，可获得较好的转化效果。
表1侵染时间对转化的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE001
采用上述相同方法对共培养时间进行试验，以OD600=0.7、浸染时间为10min时进行的该组实验。结果如表2所示，在共培养过程中，携带有目的基因的T-DNA在农杆菌体内完成加工，向植物细胞转化，从而整合进植物基因组。因此，共培养时间的长短直接影响目的基因的整合，从而影响转化效率。研究表明，农杆菌侵染叶片后并不能立即转化，只有在伤口处生存16h后的菌株才能诱发肿瘤，通称为“细胞调节期”，因此，共培养时间必须长于16h。本试验结果显，共培养时间对新疆杨叶片外植体产生kan抗性芽有较为明显的影响，在1-3d内，随着共培养时间的延长，其转化率逐渐增加，共培养3d时转化率最高，当共培养时间延长到4d时，叶片表面及培养基上均长有较多的农杆菌，有的叶片被包埋于乳白色的菌液中，将其转接到特美汀浓度为500 mg/ L的新培养基上，仍不能抑制农杆菌的过度繁殖，最终叶片死亡，没有芽产生。因此,新疆杨叶片转化过程中，共培养时间3d，转化效果较好。不同植物、不同外植体在转化过程中，所需共培养时间都不相同，一般到出现肉眼可见的菌落（3d）时即可获得较高的转化效率。
表2共培养时间对转化的影响
共培养天数（d） 外植体个数 农杆菌生长情况 诱导率%
2 80 少部分叶片上长少量菌斑 0
3 80 每片叶都长有少量菌斑 12
4 80 叶片被乳白色菌液包埋 0
（5）当步骤（4）的抗性芽长度达到1cm左右时，接种于增殖培养基中进行增殖抗性芽的培养，增殖培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/ L+Kan 50 mg/ L+200 mg/ LTimentin，pH值为5.95-5.98。
（6）当步骤（5）的增殖抗性芽长度达到1cm左右时，接种于生根培养基中进行培养，生根培养基为：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+Kan50 mg/L +200 mg/ L Timentin
步骤（5）（6）中培养温度为25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间为12h/d。
本发明的新疆杨遗传转化方法采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，它不通过诱导愈伤组织阶段而直接诱导不定芽，即省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立新疆杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。
虽然以上实施例已经对本发明目的的构思和实施例做了详细说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换故在此不一一赘述。

Claims (10)

1.一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）以新疆杨的苗叶片为外植体，对所述苗叶片进行切口，并将切口后的所述苗叶片放置于培养基上进行预培养；
（2）将经步骤（1）处理过的所述苗叶片浸入含有目的基因的农杆菌侵染菌液中并持续一定时间；
（3）将经步骤（2）处理过的苗叶片接种于培养基中进行共培养；
（4）对经步骤（3）处理的所述苗叶片进行吸取农杆菌，并转移到培养基中进行诱导选择培养直至所述苗叶片上分化出抗性芽；
（5）当步骤（4）中的所述抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行增殖抗性芽培养；
（6）当步骤（5）中的所述增殖抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行生根培养实现所述目的基因向新疆杨的遗传转化。
2.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（1）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养期，其组分为：MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.3mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中的侵染菌液为以农杆菌作为介导，并通过下述制备步骤：
农杆菌纯化培养：用接种环从-80℃保存好的农杆菌菌液中挑取一环，然后在附加卡那霉素的LB培养基平板上划线，将培养皿倒置放在恒温培养箱中，28℃培养2-3d即可获得分离的单菌落；在超净工作台上，挑取所述单菌落，接种到无菌离心管里，附加一定量抗生素及Rif的LB液体培养基中，在恒温摇床上小摇培养；
工程菌液的制备：在超净工作台上，将培养好的菌液取200-400μL转入无菌三角瓶中，附加一定抗生素的LB液体培养基中，放置恒温摇床上，振荡培养120h至OD=0.5-0.7，从而获得所述侵染菌液。
4.根据权利要求3所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述恒温摇床的培养温度为28℃，转速为150rpm。
5.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将所述苗叶片浸入含有农杆菌的所述侵染菌液中振荡侵染10min，之后取出所述苗叶片放至无菌滤纸上吸取多余的侵染菌液。
6.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（3）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1 mg/L+IBA 0.3mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（4）中的所述培养基为不定芽诱导选择培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1 mg/L+IBA 0.3mg/ L+Kan50mg/L+Timentin 400mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）中的所述培养基为增殖培养基，其组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Timentin200mg/L，pH值为5.95-5.98。
9.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（6）中的所述培养基为生根培养基，其组分为：1/2 MS+IBA 0.5mg/L+Kan 50mg/L +Timentin 200mg/L。
10.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）和所述步骤（6）中的培养温度为25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间为12h/d。
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