CN111675772A - 一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用。本发明发现，现有技术公开的从小球藻中分离得到的纯化多糖F1具有酪氨酸酶抑制活性，还可以通过抑制黑色素合成关键蛋白MITF、TYR的表达抑制黑色素的合成，最终导致细胞中的黑色素含量降低。可见，纯化多糖F1具有美白活性，具有开发成美白化妆品(包括但不限于洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等)的前景。

Description

一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用
技术领域
本发明属于化妆品领域，涉及一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用。
背景技术
黑色素是一种由细胞本身所合成、分泌的不溶于水溶于碱性溶液的生物色素，属于蛋白质衍生物，可以吸收紫外线从而保护肌肤免受紫外线所带来的各种损伤，包括光老化、炎症和癌症等。但黑色素的过度合成或者合成失常，譬如雀斑和白癜风等，则会对面容产生一定影响，甚至给患者带来心理和精神压力，严重影响患者的生活状态。黑色素是由神经嵴细胞发育而来的位于表皮基底细胞层中的黑色素细胞所合成，再通过树突结构运输至角质形成细胞中并在其中进行重新排列分布。因此黑色素颗粒会随着角质形成细胞的分化而向上迁移，最终落于角质层中，而角质层中的黑色素构成了肉眼可见的色素沉积(参考文献：黑色素的合成与美白产品的研究进展，华东师范大学学报·自然科学版，2016年3月)。
酪氨酸酶家族即TYR、TRP1和TRP2在黑色素合成和色素沉积中起着非常重要的作用。TYR是一种含铜离子的跨膜糖蛋白，其基因在细胞核中转录成mRNA之后，进入到细胞质中，在核糖体上经酶催化作用后翻译成肽链。然后在内质网上经过一系列的修饰如糖基化修饰，再进入高尔基体，最终转移至黑素小体中，成为有活性的TYR，之后便可以催化底物酪氨酸变成多巴，从而开启黑色素的合成(参考文献：黑色素的合成与美白产品的研究进展，华东师范大学学报·自然科学版，2016年3月)。
因此，抑制黑色素的合成是美白的重要方法，而抑制酪氨酸酶活性又是抑制黑色素合成最常用的手段。市面上大多数美白化妆品都是围绕这个思路实现的美白效果。
小球藻(Chlorella)是绿球藻目中的常见植物，属绿藻门，小球藻属，又称绿藻，它是地球上最早的生命形式之一，也是东方的一种替代药物，更是日本、中国等亚洲国家的传统食品。多糖是小球藻中重要的营养物质，占小球藻粉的10％～20％，具有抗衰老、抗氧化及增强免疫等生物活性功能。史瑞琴等从小球藻中分离得到三种高均一度的纯化多糖F1、F2、F3(小球藻多糖的分离纯化及理化性质，食品科学，2019年9月)，目前没有纯化多糖F1在抑制黑色素合成、抑制酪氨酸酶活性和美白方面的研究。
发明内容
本发明是为了提供一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用。
本发明技术方案如下：
一种天然成分小球藻多糖，通过如下步骤制备：
步骤S1，提取：将小球藻粉与蒸馏水按照液料质量比为20:1混匀，超声30min后添加1.45％复合酶(纤维素:木瓜蛋白酶＝1:1)并调pH为5，酶解30min后灭酶；使溶液置于70℃条件下浸提4h，4500r/min离心15min，取上清液与3倍体积乙醇混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S2，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)，剧烈震荡20min，移入分液漏斗中静置20min，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S3，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，从而除去样液中的盐类及小分子物质，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S4，阴离子交换柱层析：将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，用去离子水洗脱，流速2mL/min，收集200mL，透析、浓缩、冻干，即得。
上述天然成分小球藻多糖的美白用途。
上述天然成分小球藻多糖用于制备美白化妆品的用途。
优选地，所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
有益技术效果：
本发明发现，现有技术公开的从小球藻中分离得到的纯化多糖F1具有酪氨酸酶抑制活性，还可以通过抑制黑色素合成关键蛋白MITF、TYR的表达抑制黑色素的合成，最终导致细胞中的黑色素含量降低。可见，纯化多糖F1具有美白活性，具有开发成美白化妆品的前景，包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
附图说明
图1为各组B16F10细胞中黑色素相对含量；
图2为各组B16F10细胞中黑色素合成相关蛋白的表达水平比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
纯化多糖F1按照文献方法(小球藻多糖的分离纯化及理化性质，食品科学，2019年9月)制备，具体制备步骤如下：
步骤S1，提取：将小球藻粉与蒸馏水按照液料质量比为20:1混匀，超声30min后添加1.45％复合酶(纤维素:木瓜蛋白酶＝1:1)并调pH为5，酶解30min后灭酶；使溶液置于70℃条件下浸提4h，4500r/min离心15min，取上清液与3倍体积乙醇混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S2，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)，剧烈震荡20min，移入分液漏斗中静置20min，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S3，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，从而除去样液中的盐类及小分子物质，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S4，阴离子交换柱层析：将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，用去离子水洗脱，流速2mL/min，收集200mL，透析、浓缩、冻干，即得纯化多糖F1。
实施例1：酶试验
一、试验材料
纯化多糖F1按照上述文献方法制备，-20℃冻存。
阳性对照β-熊果苷的纯度不低于98％。
实验过程中使用的水为哇哈哈纯净水，化学试剂均为常规试剂。
二、试验方法
参考文献方法(肉桂酸-香豆素酯类似物的合成及抑制酪氨酸酶活性研究，有机化学，Chin.J.Org.Chem.2020,40)测定纯化多糖F1和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率：
将纯化多糖F1和阳性对照分别用50％DMSO水溶液溶解，并稀释成不同浓度的溶液。将130μL磷酸缓冲溶液(50mM，pH＝6.8)、10μL酪氨酸酶溶液(终浓度33.3U/mL)和10μL待测多糖或阳性对照混匀后，加入50μL L-Dopa(终浓度0.5mM)混匀，10min后于490nm波长下测定OD值。同时设置对照组，对照组加入10μL溶媒代替多糖或阳性对照溶液。各设5个复孔，计算均值，根据如下公式计算不同浓度多糖或阳性对照对酪氨酸酶的抑制率：
抑制率(％)＝(OD对照-OD药物)/OD对照×100％。
三、试验结果
不同浓度纯化多糖F1和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率如表1所示，纯化多糖F1具有较强的酪氨酸酶抑制活性，且略强于阳性对照β-熊果苷。
表1不同浓度纯化多糖F1和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率
Figure BDA0002604547470000041
实施例2：细胞试验
一、试验材料
纯化多糖F1按照上述文献方法制备，-20℃冻存。
小鼠黑色素瘤B16-F10细胞购自ATCC。
DMEM高糖培养基、FBS购自Gibco。
二、试验方法
1、细胞培养
将小鼠黑色素瘤B16F10细胞用含有10％FBS、1％双抗的DMEM高糖培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养、传代。
2、抑制黑色素含量的测定
参考文献方法(莪术醇的结构修饰以及抑制黑色素含量研究，天然产物研究与开发，Nat Prod Res Dev 2020,32)，采用NaOH裂解法测定细胞内的黑色素含量：
取对数生长期B16F10细胞，消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；24h后，药物组更换为含有50、100μg/mL纯化多糖F1的完全培养基，对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基，各设3个复孔，继续培养72h后，弃去上清液，PBS洗涤3次，使用细胞刮收集细胞后每孔加入细胞裂解液200μL，4℃充分裂解40min后，12000rpm离心20min，转移上清至EP管测定蛋白浓度。沉淀物中加入190μL1mol/L的NaOH(含10％DMSO)裂解液，并于80℃水浴1h充分溶解后，在405nm处测定吸光值，最终的黑色素含量按如下公式使用相对蛋白浓度归一化处理。
黑色素相对含量＝(OD405药物组/蛋白浓度)/(OD405对照组/蛋白浓度)×100％。
3、抑制黑色素合成相关蛋白的表达
取对数生长期B16F10细胞，消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；24h后，药物组更换为含有50、100μg/mL纯化多糖F1的完全培养基，对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基，各设3个复孔，继续培养72h后，弃去上清液，PBS洗涤收集细胞，裂解，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶80V、30min，分离胶90min，将凝胶湿转到PVDF膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下一抗MITF、TYR、GAPDH孵育过夜，PBST洗膜3次，每次约15min，取相应的二抗常温孵育1.5h，PBST洗膜3次，每次15min，PVDF膜采用碧云天ECL发光液，用发光仪进行显影，拍照分析。
4、统计学分析
数据以平均值±SD表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表具有显著性差异。
三、试验结果
1、纯化多糖F1对黑色素含量的影响
各组B16F10细胞中黑色素相对含量如表2和图1所示，与对照组相比，50、100μg/mL纯化多糖F1组B16F10细胞中黑色素含量显著降低。这说明纯化多糖F1抑制了黑色素含量。
表2各组B16F10细胞中黑色素相对含量
Figure BDA0002604547470000051
2、纯化多糖F1对黑色素合成相关蛋白表达的影响
Western blot结果如图2所示，与对照组相比，50、100μg/mL纯化多糖F1组MITF、TYR蛋白的表达水平均下调。这说明纯化多糖F1可能通过抑制黑色素合成相关蛋白的表达进而抑制黑色素的合成，使得细胞中的黑色素含量降低。

Claims (4)

1.一种天然成分小球藻多糖，其特征在于，通过如下步骤制备：
步骤S1，提取：将小球藻粉与蒸馏水按照液料质量比为20:1混匀，超声30min后添加1.45％复合酶(纤维素:木瓜蛋白酶＝1:1)并调pH为5，酶解30min后灭酶；使溶液置于70℃条件下浸提4h，4500r/min离心15min，取上清液与3倍体积乙醇混合并于4℃过夜，离心收集醇沉物，蒸馏水复溶后浓缩至原体积的1/2；
步骤S2，脱蛋白：向浓缩液中加入1/2体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)，剧烈震荡20min，移入分液漏斗中静置20min，弃去中间与下层物质，多次重复上述工艺至观察到无明显的中间蛋白层；
步骤S3，除杂：脱除蛋白的多糖溶液浓缩并去除有机试剂后，透析48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，从而除去样液中的盐类及小分子物质，再浓缩、冻干，得粗多糖；
步骤S4，阴离子交换柱层析：将经预处理的50g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入层析柱(1.6cm×30cm)，去离子水以12mL/min流速冲柱5min，再调流速至8mL/min，平衡10h以上；将10mL 5mg/mL粗多糖过0.45μm水系一次性针头滤器；上样后，用去离子水洗脱，流速2mL/min，收集200mL，透析、浓缩、冻干，即得。
2.权利要求1所述天然成分小球藻多糖的美白用途。
3.权利要求1所述天然成分小球藻多糖用于制备美白化妆品的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述化妆品包括洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。
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Applicant after: Guangdong fanmilin Biotechnology Co., Ltd

Address before: 223005 Eastern District of Huai'an Economic and Technological Development Zone, qingjiangpu District, Huai'an City, Jiangsu Province

Applicant before: Huai'an Weiermei Cosmetics Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
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PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
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Denomination of invention: A natural component inhibiting melanin synthesis and its application in cosmetics

Effective date of registration: 20210706

Granted publication date: 20201218

Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Guangzhou Baiyun Branch

Pledgor: Guangdong fanmilin Biotechnology Co., Ltd

Registration number: Y2021440000232