CN111670047A - 抗pd-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗PD‑1抗体和抗原结合片段，及这些抗体和抗原结合片段在癌症或传染病的治疗中的用途。

Description

抗PD-1抗体
相关申请的交叉引用
申请要求于2018年2月1日提交的国际序列号 PCT/CN2018/074916的优先权权益，其公开内容通过引用整体合并于此。
技术领域
本发明涉及通过对抗肿瘤介导的免疫抑制而改善的病症的治疗。更具体地，本发明涉及抗PD-1抗体，以及这些抗体在诸如癌症和传染病的疾病的治疗中的用途。
背景技术
PD-1被公认为是免疫调节和外周耐受维持中的重要分子。PD-1 在幼稚的T、B和NKT细胞上适度表达，并通过淋巴细胞、单核细胞和髓细胞上的T/B细胞受体信号传导上调(1)。
PD-1的两个已知配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，在各种组织产生的人类癌症中表达。在例如卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤的大样品集中，PD-L1的表达显示为与不良的预后和总体生存期降低相关，而与后续治疗无关(2-13)。类似地，在肿瘤浸润淋巴细胞上的PD-1表达发现标志着在乳腺癌和黑色素瘤中功能异常的T细胞(14-15)和与肾癌的不良预后相关(16)。因此，已经提出表达PD-L1的肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞相互作用以减弱 T细胞激活和逃避免疫监视，从而导致针对肿瘤的免疫反应受损。
本领域需要拮抗PD-1活性的高效治疗性抗体，其可用于产生对肿瘤的强力免疫反应。
发明内容
本发明提供了抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含具有或不具有CDRH2区中的S61N糖基化位点校正和/或G56A脱酰胺位点校正(顺序编号)的人源化08A亲和力成熟的Fab98、99、100、101、 102、103或104的重链和/或轻链CDR区。本发明还提供了抗PD-1 抗体或其抗原结合片段，其包含具有或不具有CDRH2区中的S61N 糖基化位点校正和/或G56A脱酰胺位点校正的人源化08A亲和力成熟的Fab98、99、100、101、102、103或104的重链和/或轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含具有CDRH2区中的S61N糖基化位点校正和/或G56A脱酰胺位点校正的人源化08A的重链和/或轻链CDR区。在另一方面，本发明提供了抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含具有CDRH2区的的 S61N糖基化位点校正和/或G56A脱酰胺位点校正的人源化08A的重链和/或轻链可变区。
在另外的方面，本发明还提供了抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含具有或不具有CDRH2区中的S61N糖基化位点校正和/或 G56A脱酰胺位点校正的人源化08A亲和力成熟的Fab128、133、138 或139的重链和/或轻链CDR区。在另外的方面，本发明还提供了抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含具有或不具有CDRH2区中的 S61N糖基化位点校正和/或G56A脱酰胺位点校正的人源化08A亲和力成熟的Fab128、133、138或139的重链和/或轻链可变区。
本发明还提供了分离的核酸，其编码本发明的任一种抗PD-1抗体或抗原结合片段。本发明还提供了包含这种核酸的表达载体(其中所述多肽可以任选地包含前导序列)。这些分离的核酸和包含它们的表达载体可以用于在重组宿主细胞中表达本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明还提供了包含这种分离的核酸的宿主细胞。
附图说明
图1：在工程化的Jurkat.hPD-1.IL2luc+THP-1.PD-L1分析中测试本发明的Fab和双特异性抗体。双特异性抗体和Fabs能够逆转通过 PD1-PDL1相互作用产生的免疫抑制。当抗体/Fab与Jurkat细胞(PD1 +ve)和THP1PDL1细胞(+LPS，IFNg，aCD3)孵育时，这作为IL2介导的荧光素酶水平的增加来测量。
图2：混合淋巴细胞反应中由双特异性抗体诱导的IL-2(下图) 和IFN-γ产生(上图)。
图3：通过双特异性抗体导致的用PD-L1转染的JY细胞再刺激的CD4+T细胞克隆4-49的IFN-γ产生。
图4：引入AzymetricTM突变后在90ASU或18ASS双特异性抗体的抗PD1臂中形成的CH1(灰色)和CL(白色)界面的3-D表示。在抗LAG3第二臂中引入了一组不同的突变以驱动正确配对的界面的选择性形成并避免重-轻链错配。
图5：引入AzymetricTM突变(棒)后在90ASU或18ASS双特异性抗体的抗LAG3第二臂中形成的CH1(灰色)和CL(白色)界面的3-D表示。在抗PD-1第一臂中引入一组不同的突变以驱动正确配对的界面的选择性形成并避免重-轻链错配。
图6：引入AzymetricTM突变(棒)后，在双特异性抗体(18ASS 和90ASU)中通过重链1(灰色)和重链2(白色)形成的CH3异二聚体界面的3D表示。
具体实施方式
缩略词
在整个本发明的详述和实施例中，将使用以下缩略词：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义
CHO 中国仓鼠卵巢
ELISA 酶联免疫吸附分析
FR 抗体框架区：排除CDR区的免疫球蛋白可变区
IFN 干扰素
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)开创的免疫球蛋白比对和编号系统
mAb或Mab或MAb 单克隆抗体
V区 不同抗体之间序列可变的IgG链的区段。其在轻链中延伸至Kabat残基109和在重链中延伸至Kabat残基113
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
定义
为了可更容易理解本发明，在下文中具体地定义某些技术和科学术语。除非在本文件中别处具体地定义，否则本文所使用的所有其它技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
除非上下文另外清楚地规定，否则如本文(包括随附权利要求) 中所用的，词语的单数形式诸如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括其对应的复数指代物。
“施用”和“处理”在应用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该动物、人类、个体、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理涵盖使试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中该流体是与细胞接触的。“施用”和“处理”也意指通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一细胞的体外和离体处理，例如细胞的处理。
“治疗”或“处理”意指在内部或外部向具有一种或多种疾病症状或怀疑患有治疗剂对其具有治疗活性的疾病的受试者或患者施用该治疗剂，如含有本发明的任一抗体或抗原结合片段的组合物。通常，药剂以有效缓解所治疗受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度诱导此类症状的消退或抑制其进展。有效缓解任何特定疾病症状的治疗剂的量可根据诸如疾病状态、患者的年龄和体重以及药物在受试者中引发所需反应的能力的因素而变化。是否疾病症状已缓解可通过医师或其它熟练医疗护理提供者通常用于评价该症状的严重程度或进展状态的任何临床测量来评价。
抗体、多特异性抗体和抗原结合片段
本发明包括抗PD-1抗体和其使用方法。如本文所用，术语“抗体”是指展现所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广泛的含义使用，且特别地涵盖，但不限于，单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体和嵌合抗体。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。各四聚体包括两个相同的多肽链对，各对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70 kDa)。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可定义主要负责效应子功能的恒定区。
当用于抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211至217个氨基酸。通常，基于恒定域的氨基酸序列，人轻链分类为kappa(κ)和lambda(λ) 轻链。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。轻链可以是人轻链。
当用于抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120-130个或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型(例如，同种型)之一，称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。不同的重链大小不同：α、δ和γ包含约450个氨基酸，而μ和ε包含约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的免疫球蛋白 (Ig)类别(例如同种型)，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG 的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区相连接，重链也包括约10个以上氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))。
各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。
术语“可变区”、“可变域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其一般位于轻链或重链的氨基末端并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度和在轻链中具有约100至 110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。该Ig链的区段在不同抗体之间序列是可变的。在一些情况下，它延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。重链的可变区可以称为“VH”。轻链的可变区可以称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。 V区介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性在可变区的110个氨基酸跨度中不是均匀分布的。相反，V区由约15-30个氨基酸的可变性较低(例如，相对不变)的片段(称为构架区(FR))组成，其被大约9-12个氨基酸长的具有较高可变性(例如，极端可变性)的较短区域(称为“高变区”)分隔。重链和轻链的可变区各包含四个FR，主要采取β折叠构型，并通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β折叠结构的环，且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FR紧密保持在一起，并且与另一条链中的高变区一起，促成抗体的抗原结合位点的形成(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest (1991年，第5版))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区在不同抗体之间序列差异很大。在特定的实施方式中，可变区是人可变区。
术语“如Kabat中的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于Kabat等，同上中抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可在残基52之后包括单个氨基酸插入 (根据Kabat的残基52a)和在残基82之后的三个插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体的序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。当提及可变域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等，同上)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等，同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。例如， AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon已描述了其他编号系统。
通常，重链和轻链两者的可变域包括位于相对保守的框架区 (FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过框架区对齐，从而使得能够与特定表位结合。通常，从N末端到C 末端，轻链和重链可变域包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4。通常，根据Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat等；NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.；第五版；NIH公开No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等, (1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等,(1987)J Mol.Biol. 196:901-917或Chothia等,(1989)Nature 342:878-883中的定义；及对于EU编号，参见Edelman,G.M.等,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85 (1969)，将氨基酸分配到每个结构域。
高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3及重链可变域中的 CDRH1、CDRH2和CDRH3)。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区之一(H1、H2或H3)，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区之一(L1、L2或L3)。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员众所周知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变 (V)域内具有最高变异性的区域(Kabat等，1997，J.Biol.Chem.252： 6609-16；Kabat，1978，Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(按照序列定义抗体的CDR区))。Chothia还在结构上将CDR区序列定义为不是保守的β-折叠框架的部分的那些残基，且因此能够采取不同的构象 (Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(按照结构定义抗体的CDR区)。两种术语命名在本领域中是众所周知的。CDR区序列也通过AbM、Contact和IMGT定义。通过比较众多结构确定了规范抗体可变区内CDR的位置(Al-Lazikani等，1997，J.Mol.Biol. 273：927-48；Morea等，2000，Methods 20：267-79)。由于不同抗体中高变区内的残基数有所不同，因此通常，相对于规范位置的另外的残基用在规范可变区编号方案中残基编号之后的a、b、c等等编号 (Al-Lazikani等，同上)。类似地，这样的命名法对于本领域技术人员是众所周知的。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变区的区域，其序列是超变的和/或形成结构上限定的环。通常，抗体包括六个高变区，VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、 L2、L3)。多种高变区划界在使用，并且在本文中涵盖。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性并且是最常用的(参见，例如，Kabat 等，同上)。相反，Chothia是指结构环的位置(参见，例如Chothia 和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-17)。对ChothiaCDR-H1环的末端使用Kabat编号规则编号时根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将放置H35A和H35B的插入；如果 35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在 33处结束；如果同时存在35A和35B，则环在34处结束)。AbM高变区代表了Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件使用(参见，例如，Antibody Engineering Vol.2(Kontermann和Dübel编辑,2d ed.2010))。“contact”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。这些高变区或CDR各自的残基如下所示。
最近，已经开发并广泛采用了通用编号系统，ImMunoGeneTics (IMGT)Information
Figure BDA0002612288200000091
(Lafranc等，2003，Dev.Comp.Immunol. 27(1)：55-77)。IMGT是专门用于人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC) 的集成信息系统。在本文中，CDR涉及氨基酸序列和在轻链或重链内的位置两个方面。由于CDR在免疫球蛋白可变域内的“位置”在物种之间是保守的并存在于称为环的结构中(通过使用根据结构特征比对可变域序列的编号系统)，CDR和框架残基容易识别。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基嫁接和替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun，2001，J.Mol.Biol.， 309：657-70开发了另外的编号系统(AHon)。编号系统之间的对应关系，包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统，是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Kabat，上文；Chothia和Lesk，上文； Martin，上文；Lefranc等，同上)。在一些实施方式中，CDR如通过IMGT编号系统所定义。在其他实施方式中，CDR如Kabat编号系统所定义。在某些实施方式中，CDR如AbM编号系统所定义。在其他实施方式中，CDR如Chothia系统所定义。在再其他的实施方式中， CDR如Contact编号系统所定义。
<u>IMGT</u> <u>Kabat</u> <u>AbM</u> <u>Chothia</u> <u>contact</u>
V<sub>H</sub> CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
高变区可包括如下“扩展高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、 46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35 或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102 (H3)。如本文所用，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。
如本文所用，术语“框架”或“FR”是指CDR侧翼的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合、人源化、人、结构域抗体、双体抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是指除本文定义为CDR 残基的高变区残基以外的那些可变域残基。
“Fc”区含有两个重链片段，其包含抗体的CH3和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及其他相互作用(包括CH3 结构域的疏水相互作用)保持在一起。Fc区定义为免疫球蛋白重链的 C-末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去。因此，完整抗体的组成可以包括去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体以及具有带和不带K447 残基的抗体的混合物的抗体群体。
术语“恒定区”或“恒定域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指相对于包含抗原结合位点的免疫球蛋白的其他部分(可变区)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定区可能包含重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的 CL区。“IgG1恒定域”包括具有或不具有C端赖氨酸(K)的重链IgG1蛋白的所有同种异型，包括但不限于G1m3、G1m17,1、G1m17、 G1m17,1,2、G1m(f)、G1m(z,a)和G1m(z,a,x)。参见Jefferis等，MAbs 1：4，1-7；2009的表1，以及Lefranc G和Lefranc MP,
Figure BDA0002612288200000111
国际
Figure BDA0002612288200000112
信息系统(万维网: imgt.org/textes/IMGTrepertoire/Proteins/allotypes/human/IGH/IGHC/ Hu_IGHCallotypes1.html)。在一个实施方式中，没有C末端赖氨酸的IgG1 恒定域是SEQ IDNO：124。
“κ恒定区”包括轻链κ蛋白的所有同种型，包括但不限于Km1、 Km2和Km3。参见Jefferis等，MAbs 1：4，1-7；2009。在一个实施方式中，κ恒定域是SEQ ID NO：125。
术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合所需的结构。有关scFv的综述参见Pluckthun(1994) ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和 Moore编辑，Springer-Verlag,New York,pp.269-315。另参见国际公开No.WO 88/01649和美国专利No.4,946,778和5,260,203。在一个实施方式中，scFv从N到C末端包含VH区、肽接头和VL区。在另一个实施方式中，scFv从N到C末端包含VL区、肽接头和VH区。
如本文所用，术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链中连接至轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448中充分描述。对于工程抗体变体的综述一般参见Holliger 和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
“Fab”由重链的VH和CH1区以及轻链的VL和CL区组成，它们通常通过二硫键接合在一起并具有单个抗原结合位点。Fab中的 VH、CH1、VL和CL区可以以各种方式排列以赋予按照本公开的抗原结合能力。例如，VH和CH1区可以在一个多肽上，而VL和CL 区可以在单独的多肽上。可选地，VH、CH1、VL和CL区全部可以在同一多肽上，任选地以不同顺序排列。
本发明还包括抗-PD-1scFv片段及其使用方法。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun(1994)The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑， Springer-Verlag，New York，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。在一个实施方式中，scFv从N到C末端包含VH区、肽接头和VL区。在另一个实施方式中，scFv从N到C末端包含VL区、肽接头和VH区。
本发明包括抗-PD-1双体抗体及其使用方法。如本文所用，术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与在同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域 (VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短以使得同一链上的两个可变结构域之间不能配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，且产生两个抗原结合位点。双体抗体充分描述于例如，EP 404,097； WO 93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448中。关于工程化抗体变体的综述，一般参见Holliger和 Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
本发明的“双特异性抗体”包含抗PD-1抗原结合臂(其包含任何所要求保护的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区) 及识别不同抗原的另一抗原结合臂。在优选的实施方式中，双特异性抗体是具有包含重链和轻链的抗PD-1抗原结合臂和包含重链和轻链的结合不同抗原的另一抗原结合臂的异二聚体。两个抗原结合臂经由在CH3区中具有突变的两个重链恒定区缔合以形成异二聚体(参见例如图6)。“多特异性抗体”包含抗PD-1双特异性抗体，并且还包含另外的抗原结合臂，其包含靶向至少另一抗原的重链和轻链可变区。
本发明还包括抗PD-1抗原结合片段及其使用方法。如本文所用，除非另有说明，“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体或双特异性抗体的抗原结合片段，即保持与全长抗体所结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；半双特异性分子，其包含一个抗原结合臂的重链和轻链。
通常，以一定方式修饰的本发明的抗体、双特异性抗体或抗原结合片段在活性基于摩尔量表示时保留其结合活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或双特异性抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的PD-1结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、 90％、95％或100％或更多。还意欲本发明的抗体、双特异性抗体或抗原结合片段可包括不实质上改变其生物活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
本发明包括分离的抗-PD-1抗体和其抗原结合片段及其使用方法。“分离”的抗体或双特异性抗体或其抗原结合片段至少部分地不含来自产生其的细胞或细胞培养物的其它生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其它物质，诸如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段还可以至少部分地不含表达系统组分，诸如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”不意指完全不存在此类生物分子或不存在水、缓冲剂或盐，或不存在包括抗体或片段的药物制剂的组分。
“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”意指基因组、mRNA、 cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其不与其中该分离的多核苷酸天然存在的多核苷酸的全部或一部分关联，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。出于本发明的目的，应理解“包含(特定核苷酸序列)的核酸分子”不涵盖完整染色体。除指定序列之外，“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子可包括多达十种或甚至多达二十种或更多种其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调控序列，和/或可包括载体序列。
短语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸或多核苷酸处于与另一核酸序列的功能关系中时，其为“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，但未必总是，“可操作地连接”意味着所连接的DNA 序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的和在阅读相中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在适宜限制性位点处接合来实现。如果此类位点不存在，则根据常规操作使用合成寡核苷酸衔接体或接头。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用且所有此类名称均包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和来源于其的培养物，而无论转移次数。还应理解，由于有意或无意突变，不是所有子代都具有精确相同的DNA内含物。包括具有与最初转化细胞中所筛选的相同的功能或生物活性的突变子代。在预期不同名称的情况下，其从上下文来看将是清楚的。
如本文所用，“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用未重排的免疫球蛋白序列的任何合适的来源。人类种系序列可获自例如美国国立卫生研究院(United States National Institutes of Health)的美国国立关节炎和肌肉骨骼和皮肤病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal andSkinDiseases)网站上的 JOINSOLVER种系数据库。小鼠种系序列可例如如Giudicelli等(2005) Nucleic Acids Res.33:D256-D261中所述获得。
抗PD-1抗体和抗原结合片段
本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一方面，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:15、18、21、25、29、32或35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5、22或26的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在又一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列轻链可变区CDR3。
在又一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在再进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在再进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一方面，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9、79或86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
该轻链可变区包含选自以下的轻链CDR：
a.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含 SEQ ID NO:4、15、18、29、32或35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2 和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
b.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和
c.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
该轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在进一步的方面，抗体或抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10 的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:22 的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在再进一步的方面，抗体或抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10 的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:22 的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一方面，本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段其中抗体或抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10 的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含与SEQ ID NO:21具有至少约57％、71％或85％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含与SEQ ID NO:22具有至少约67％、78％或89％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7 或88中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14、17、 20、24、28、31、34或76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14、17、20、24、28、 31、34中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段是包含含有SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:13、16、19、23、 27、30或33中所示的氨基酸序列的轻链的Fab。在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在再进一步的实施方式中，本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段是包含含有SEQ ID NO:84或90中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的轻链的Fab。
在另一方面，本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:9、79、86或91的氨基酸序列的重链可变区 CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41或10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 75、78、81或88中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO: 76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段为包含含有SEQ ID NO:74、77、80、82、89或94中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有 SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO: 76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在再进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段为包含含有SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。在再进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段为包含含有SEQ ID NO: 89中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。在再进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段为包含含有SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。
在进一步的方面，本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:40或53的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:9或54的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4、42、47或60的氨基酸序列的轻链可变区 CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5、48或55的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链和轻链可变区的CDR选自：
a.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含 SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41 的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
b.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含 SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41 的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
c.包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含 SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3；和
d.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含 SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，和包含SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3。
在进一步的方面，本发明提供结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区，其包含：
包含与SEQ ID NO:40具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含与SEQ ID NO:9具有至少约70％、76％、 82％、88％或94％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含与SEQ ID NO:60具有至少约57％、71％或85％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区 CDR2和包含与SEQ ID NO:5具有至少约67％、78％或89％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
a.包含SEQ ID NO:37或119中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列的轻链可变区；
b.包含SEQ ID NO:44或121中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的轻链可变区；
c.包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含 SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的轻链可变区；和
d.包含SEQ ID NO:57或123中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在前述实施方式的一个方面，抗体或其片段在BIACORE分析中以低于50pM的KD结合人PD-1。在前述实施方式的另一方面，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的抗体。在另一实施方式中，抗体包含IgG1亚型的重链区域。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区还包含CH2区中的L234A或L234D；L235A或L235D；D265S或D265A；G237A突变的一个或多个(EU编号)。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区还包含CH2区中的L234A、L235A和D265S突变(EU编号)。在进一步的实施方式中，IgG1重链恒定区还包含CH2 区中的L234A、L235A和D265A突变(EU编号)。在再进一步的实施方式中，IgG1重链恒定区还包含CH2区中的L234A、L235A和G237A 突变(EU编号)。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区还包含突变 N297A、N297Q或N297D(EU编号)。在进一步的实施方式中，抗PD-1 抗体或抗原结合片段包含IgG4亚型的重链恒定区，任选地具有S228P 突变(EU编号)。在一个实施方式中，IgG4恒定域还包含突变F234A； L235A；D265S或D265A中的一个或多个。在一个实施方式中，IgG4 恒定域还包含F234A、L235A和D265S突变。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含通过哺乳动物细胞表达特征性的糖基化模式。
在再进一步的方面，本发明提供包含前述抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。在一个实施方式中，组合物进一步包含选自以下的药剂：
a.抗LAG3抗体或其抗原结合片段；
b.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；
c.抗VISTA抗体或其抗原结合片段；
d.抗BTLA抗体或其抗原结合片段；
e.抗TIM3抗体或其抗原结合片段；
f.抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；
g.抗HVEM抗体或其抗原结合片段；
h.抗CD70抗体或其抗原结合片段；
i.抗OX40抗体或其抗原结合片段；
j.抗CD28抗体或其抗原结合片段；
k.抗PDL1抗体或其抗原结合片段；
l.抗PDL2抗体或其抗原结合片段；
m.抗GITR抗体或其抗原结合片段；
n.抗ICOS抗体或其抗原结合片段；
o.抗SIRPα抗体或其抗原结合片段；
p.抗ILT2抗体或其抗原结合片段；
q.抗ILT3抗体或其抗原结合片段；
r.抗ILT4抗体或其抗原结合片段；
s.抗ILT5抗体或其抗原结合片段；
t.抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；
u.抗NK2GA抗体或其抗原结合片段；
v.抗NK2GC抗体或其抗原结合片段；
w.抗NK2GE抗体或其抗原结合片段；
x.抗TSLP抗体或其抗原结合片段；
y.抗IL10抗体或其抗原结合片段；及
z.STING激动剂；
aa.CXCR2拮抗剂；和
bb.PARP抑制剂。
在一个实施方式中，药剂是抗LAG3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗VISTA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗BTLA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TIM3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗 HVEM抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CD70 抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗PDL1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗PDL2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗GITR抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗SIRPα抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗4-1BB抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗NK2GA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗NK2GE抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗IL10抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TSLP抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是STING激动剂。在一个实施方式中，药剂是CXCR2拮抗剂。在一个实施方式中，药剂是PARP抑制剂。
本公开包括以下表8中描述的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段包含表8中列出的CDR 序列。在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段包含表8 中列出的VH序列所示的CDR和表8中列出的VL序列所示的CDR。在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段包含表8中列出的VH序列和表8中列出的VL序列。在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段包含表8中列出的重链序列和表8中列出的轻链序列。
示例性抗体的物理和功能特性
“保守修饰变体”或“保守置换”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得可时常进行该变化而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非关键区域中的单一氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如，Watson等人(1987) MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第 224页(第4版))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物学活性。示例性保守置换示于表1中。
表1.示例性保守氨基酸置换
原始残基 保守置换
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基被改变而不改变所需特性 (如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。此类变体包括，但不限于氨基酸被具有类似特性的氨基酸替代，如表1的保守氨基酸置换。还提供具有多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸置换(优选在框架区中)的分离的本发明抗PD-1抗体或抗原结合片段。
多核苷酸和多肽
本发明进一步包括编码本发明的抗-PD-1抗体及其抗原结合片段的多肽或免疫球蛋白链中任一种的多核苷酸。例如，本发明包括编码 SEQ ID NO:1-95和118-123任一个中描述的氨基酸的多核苷酸。在进一步的方面中，本发明提供编码以下的分离的核酸：上述抗体或抗原结合片段中的任一种，和包含所述核酸的表达载体，和包含所述抗体或抗原结合片段和/或表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞、人细胞、哺乳动物细胞、毕赤酵母细胞、植物细胞、HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
在一个实施方式中，提供分离的多核苷酸，例如DNA，其编码本文中给出的分离的抗体或抗原结合片段的多肽链。在一个实施方式中，分离的多核苷酸编码包含一个根据本发明的成熟免疫球蛋白轻链和一个根据本发明的成熟免疫球蛋白重链的抗PD-1抗原结合片段。在一些实施方式中，分离的多核苷酸在单一多核苷酸分子上编码轻链与重链两者，且在其它实施方式中，轻链和重链在单独的多核苷酸分子上编码。在另一实施方式中，多核苷酸进一步编码信号序列。在另一实施方式中，分离的多核苷酸编码其抗PD-1抗原结合片段，包括至少一个成熟单链Fv。
本发明还提供载体，例如表达载体，如质粒，其包含本发明的分离的多核苷酸，其中当宿主细胞用该载体转染时，该多核苷酸可操作连接至宿主细胞识别的控制序列。还提供包含本发明的载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括在培养基中培养携带编码抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的表达载体或核酸的宿主细胞，且从宿主细胞或培养基分离抗体或其抗原结合片段。
在另一实施方式中，本发明提供了一种产生抗体或抗原结合片段的方法，包括：
a.在有利于包含编码前述抗体或抗原结合片段中任一的重链和/ 或轻链的多核苷酸表达的条件下培养包含该多核苷酸的宿主细胞；和
b.任选地，从宿主细胞和/或培养基回收抗体或抗原结合片段。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
本文公开的抗体也可以重组产生(例如，在大肠杆菌/T7表达系统、哺乳动物细胞表达系统或低等真核生物表达系统中)。在一个实施方式中，编码本发明的抗体分子(例如，scFv、VH或VL)的核酸可插入基于pET的质粒中并在大肠杆菌/T7系统中表达。例如，本发明包括用于在宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，如大肠杆菌，如BL21或 BL21DE3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，其包括在还包含可操作连接至T7启动子的编码免疫球蛋白链的多核苷酸的细胞中表达T7 RNA聚合酶。例如，在本发明的实施方式中，细菌宿主细胞如大肠杆菌包括编码可操作连接至lac启动子的T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸，且聚合酶和链的表达通过宿主细胞与 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)一起孵育来诱导。
存在几种本领域中已知的通过其产生重组抗体的方法。用于重组产生抗体的方法的一个实例公开于美国专利号4,816,567中。
转化可通过任何已知用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域中众所周知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封、基因枪注射和 DNA至细胞核中的直接显微注射。另外，核酸分子可通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。
因此，本发明包括用于制备本发明的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，其包括引入编码抗体或片段的一条或多条免疫球蛋白链(例如，免疫球蛋白重链和/或轻链，scFv)的多核苷酸；在有利于此类表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母)且任选地从宿主细胞和/或宿主细胞在其中生长的培养基分离抗体或片段或免疫球蛋白链。
作为用于表达本文公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的宿主的真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)是本领域中众所周知的，且包括许多可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如 Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。特别优先的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择。可使用的其它细胞系为昆虫细胞系如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆毕赤酵母 (Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、Pichiaopuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母 (Pichia pijperi)、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母属 (Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰孢菌(Fusariumgramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酵母属、多形汉逊酵母、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌、任何曲霉菌属、里氏木菌、金孢子菌、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母和粗糙脉孢菌。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段或者scFv的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，抗体通过将宿主细胞培养足以允许抗体或片段或链在宿主细胞中表达或分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的一段时间来产生。
抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链可使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收。此外，可使用许多已知的技术增强本发明的抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链(或来自其的其它部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为用于增强在某些条件下表达的常用方法。GS系统整体或部分地结合欧洲专利号0216846、0256055和0323997及欧洲专利申请号89303964.4进行讨论。因此，在本发明的实施方式中，哺乳动物宿主细胞(例如，CHO) 缺乏谷氨酰胺合成酶基因并在培养基中不存在谷氨酰胺的情况下生长，然而其中编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含补偿宿主细胞中该基因的缺乏的谷氨酰胺合成酶基因。
通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有该细胞系或转基因动物产生的糖蛋白特征性的一组糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体均构成本发明，而无论抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在具体实施方式中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已证明通常在体外和体内显示比其岩藻糖基化对应物更高的功效(参见例如Shinkawa等，J.Biol.Chem.278:3466-3473 (2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。具有非岩藻糖基化N- 聚糖的这些抗体因为其碳糖结构为人血清IgG中存在的群体的正常组分而不太可能是免疫原性的。
免疫球蛋白可根据其重链恒定域的氨基酸序列而分配至不同类别。在一些实施方式中，不同恒定域可以附接于VL、VH或VL-VH区。存在至少五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可进一步分成亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4；IgA1和IgA2。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，如λ或κ人轻链区或其变体。
在一个实施方式中，抗PD-1抗体或抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区还包含CH2区中的L234A或L234D；L235A或L235D；D265S或D265A；G237A 突变中的一个或多个(EU编号)。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区进一步包含CH2区中的L234A、L235A和D265S突变(EU编号)。在进一步的实施方式中，IgG1重链恒定区在CH2区中进一步包含 L234A、L235A和D265A突变(EU编号)。在再进一步的实施方式中，IgG1重链恒定区进一步包含CH2区中的L234A、L235A和G237A 突变(EU编号)。在另一实施方式中，IgG1重链恒定区还包含突变 N297A、N297Q或N297D(EU编号)。在另一实施方式中，抗PD-1 抗体或抗原结合片段包含IgG4亚型的重链恒定区，任选地具有S228P 突变(EU编号)。在一个实施方式中，IgG4恒定域还包含F234A； L235A；D265S或D265A突变中的一个或多个。在一个实施方式中， IgG4恒定域还包含F234A、L235A和D265S突变。在前述实施方式的另一方面，IgG1或IgG4恒定域还包含M252Y、S254T和T256E 突变。
抗体工程
进一步包括其中抗体及其抗原结合片段是工程化抗体以包括本文对提供的序列的可变结构域内框架残基的修饰(例如，以改善抗体或片段的特性)的实施方式。通常，进行此类框架修饰以降低抗体或片段的免疫原性。这通常通过将亲本(例如，啮齿动物)抗体或片段的可变域中的非CDR残基(即框架残基)用来自抗体将在其中使用的物种的免疫库的类似残基(例如在人类治疗剂的情况下的人残基)替换来实现。这种抗体或片段被称为“人源化”抗体或片段。一种方法是使一个或多个框架残基突变成相应种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体或片段可含有不同于抗体所来源的种系序列的框架残基。此类残基可通过比较抗体或片段框架序列与该抗体或片段所来源的种系序列来鉴定。另一方法是在工程化(例如人源化)抗体的一个或多个位置处回复至原始亲本(例如，啮齿动物)残基，例如以恢复在替换框架残基的过程中可能损失的结合亲和力(参见例如美国专利号 5,693,762、美国专利号5,585,089和美国专利号5,530,101)。
在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段被工程化(例如人源化)以包括框架和/或CDR中的修饰而改善其特性。此类工程化的变化可以是基于分子建模。亲本(非人)抗体序列的可变区的分子模型可被构建以理解抗体的结构特征并用于鉴定抗体上可与抗原相互作用的潜在区域。常规CDR基于免疫球蛋白序列的比对和鉴定可变区。Kabat 等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等； NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公开号 91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等，(1977)J. Biol.Chem.252:6609-6616。Chothia和同事仔细地检查抗体的晶体结构中环的构型且提出了高变环。Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883。归类为“CDR”和“高变环”的区域之间存在变异。后来的研究(Raghunathan等，(2012) J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了几种抗体-抗原晶体复合物且观察到抗体中的抗原结合区不必然严格地符合“CDR”残基或“高变”环。非人抗体的可变区的分子模型可用于指导可潜在结合于抗原的区域的选择。实际上，基于模型的潜在抗原结合区不同于常规的“CDR”或“高变”环。商业的科学软件如MOE(Chemical Computing Group) 可用于分子建模。人框架可基于框架中和CDR中与非人类序列的最佳匹配来选择。对于VH中的FR4(框架4)，将人种系的VJ区与对应非人区域相比较。在VL中的FR4(框架4)的情况下，将人种系序列的 J-κ和J-λ区与对应非人区域相比较。一旦鉴定合适的人框架，将CDR 嫁接至所选择的人框架中。在一些情况下，VL-VH界面中的某些残基可如在非人(亲本)序列中保留。分子模型也可用于鉴定可潜在地改变CDR构型且因此改变与抗原的结合的残基。在一些情况下，这些残基如在非人(亲本)序列中得到保留。分子模型也可用于鉴定溶剂暴露的氨基酸，其可导致不需要的作用，如糖基化、脱酰胺作用和氧化。可在设计阶段早期引入可开发性过滤器(developability filter)以消除/ 最小化这些潜在问题。
另一类型的框架修饰涉及将框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫”，且进一步详细描述于美国专利号 7,125,689中。
在具体实施方式中，需要将包含暴露的侧链的某些氨基酸改变成另一氨基酸残基以提供最终抗体的更大化学稳定性，从而避免脱酰胺或异构化。天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺和/或异构化可在DG、NG、 NS、NA、NT、QG或QS序列上发生，且导致产生异天冬氨酸残基(其将扭结引入多肽链中且降低其稳定性(异天冬氨酸效应))。异构化可在DG、DS、DA或DT序列处发生。在某些实施方式中，本公开的抗体不含脱酰胺或天冬酰胺异构位点。在一个实施方式中，抗 PD-1重链CDRH2包含G56A校正以去除脱酰胺位点。
例如，天冬酰胺(Asn)残基可改变成Gln或Ala以降低任何 Asn-Gly序列处(特别是CDR内)形成异天冬氨酸的潜能。相似的问题可在Asp-Gly序列处发生。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:1281。异天冬氨酸形成可减弱或完全消除抗体与其靶抗原的结合。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731，第734页。在一个实施方式中，天冬酰胺改变成谷氨酰胺(Gln)。也可能需要改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基相邻的氨基酸以降低脱酰胺 (其在小氨基酸与天冬酰胺或谷氨酰胺相邻出现时以较大速率发生) 的可能性。参见Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261。另外， CDR中任何甲硫氨酸残基(通常溶剂暴露的Met)可改变成Lys、Leu、 Ala或Phe或其它氨基酸以降低甲硫氨酸硫氧化(其可降低抗原结合亲和力且还造成最终抗体制备物中的分子异质性)的可能性。同上。另外，为了防止或最小化潜在易切断的Asn-Pro肽键，可能需要将在 CDR中发现的任何Asn-Pro组合改变成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类置换的抗体以确保该置换不使抗体对PD-1的亲和力或特异性或者其它所需生物学活性降低至不可接受的水平。
表2.示例性的稳定化CDR变体
Figure BDA0002612288200000351
Fc区的抗体工程
本文公开的抗体及其抗原结合片段也可以工程化以包括Fc区内的修饰，从而通常改变抗体的一种或多种特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文公开的抗体及其抗原结合片段可被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可连接至抗体)或进行修饰以改变其糖基化，以再次改变抗体或片段的一种或多种特性。这些实施方式中的每一种进一步详细描述于下文中。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
本文公开的抗体及其抗原结合片段也包括具有修饰(或阻断)的 Fc区以提供改变的效应子功能的抗体和片段。参见例如美国专利号 5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，其具有在诊断和疗法中的可能有益作用。Fc区的改变包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化及添加多个Fc区。Fc的变化也可改变治疗性抗体中抗体的半衰期，从而能够实现不太频繁的给药且因此提高的便利性和减少的材料使用。参见Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol. 116:731，第734-35页。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段是在重链恒定区的铰链区中对应于位置228的位置处包含丝氨酸至脯氨酸的突变 (S228P；EU索引)的IgG4同种型抗体或片段。该突变已报告为消除铰链区中重链间二硫桥的异质性(Angal等，同上；位置241是基于 Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方式中，铰链区被修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目增加或减少。该方法进一步描述于美国专利号 5,677,425中。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如以促进轻链和重链的组装或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段的Fc铰链区被突变以缩短抗体或片段的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得抗体或片段相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有受损的SpA结合。此方法进一步详细描述于美国专利号6,165,745中。
在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段被修饰以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，可引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如美国专利号6,277,375中所述的。或者，为了增加生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内进行改变以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的拯救受体结合表位，如美国专利号5,869,046和6,121,022中所述的。
在再其它的实施方式中，Fc区通过将至少一个氨基酸残基用不同氨基酸残基替换以改变抗体或抗原结合片段的效应子功能来改变。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可用不同的氨基酸残基替换，以使得抗体具有改变的对效应子配体的亲和力且保留亲本抗体的抗原结合能力。对其发生亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步详细描述于美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可用不同的氨基酸残基替换，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于美国专利号6,194,551中。
在另一实例中，氨基酸位置123和239内的一个或多个氨基酸残基被改变，由此改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述于PCT 公开WO 94/29351中。
在再另一实例中，Fc区通过改变以下位置处的一个或多个氨基酸而被修饰以降低本发明的抗体或抗原结合片段介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或降低抗体或片段对Fcγ受体的亲和力：238、 239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、 292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、 315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、 337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、 416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述于 PCT公开WO 00/42072中。而且，人IgG1上对FcγR1、FcγRII、FcγRIII 和FcRn的结合位点已定位且已描述具有提高的结合的变体(参见 Shields等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在本发明的一个实施方式中，Fc区通过改变残基243和264进行修饰以降低本发明的抗体介导效应子功能的能力和/或提高抗炎性特性。在一个实施方式中，抗体或片段的Fc区通过将位置243和264 的残基改变成丙氨酸进行修饰。在一个实施方式中，Fc区通过改变残基243、264、267和328而进行修饰以降低抗体或片段介导效应子功能的能力和/或提高抗炎性特性。
效应子功能调节
如本文所用，术语“效应子功能”意指以下的一种或多种：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性 (CDC)介导的反应、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP)和经由FcRn受体的抗体再循环。
据信抗原结合蛋白的恒定区和各种Fc受体(FcR)(包括FcγRI (CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))之间的相互作用介导抗原结合蛋白的效应子功能，如ADCC和CDC。Fc受体对于抗体交联也是重要的，所述抗体交联对于抗肿瘤免疫性可能是重要的。
效应子功能可用许多方式测量，包括例如经由FcγRIII与自然杀伤细胞的结合或经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量 ADCC效应子功能。例如，可在自然杀伤细胞分析中评估本发明的抗原结合蛋白的ADCC效应子功能。此类分析的实例可见于Shields等， 2001J.Biol.Chem.，第276卷，第6591-6604页；Chappel等,1993J. Biol.Chem.，第268卷，第25124-25131页；Lazar等,2006PNAS,103； 4005-4010。
本发明的抗体的ADCC或CDC特性或其交联特性可以通过多种方式降低。已显示在残基Asn297上含有特定突变或改变的糖基化的人IgG1恒定区减少与Fc受体的结合。在其它情况下，这些突变也已显示增强ADCC和CDC(Lazar等PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等Mol Immunol,2007, 44；1815-1817)。另外，L234A或L235A、L236A、G237A突变导致FcγRII识别的降低。Lund等，Journal ofImmunology，147，2657-2663 (1991)。
在本发明的一个实施方式中，此类突变在选自239、332和330 (IgG1)的一个或多个位置中或其它IgG同种型中的等同位置中。合适突变的实例为S239D和I332E和A330L。在一个实施方式中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在位置239和332处突变，例如S239D和I332E，或在另外的实施方式中，在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变(例如S239D和I332E和A330L)(EU索引编号)。
具有改变的糖基化的抗体的产生
在再另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包含特定糖基化模式。例如，可制备无岩藻糖基化或无糖基化抗体或片段(即，抗体分别缺乏岩藻糖或糖基化)。抗体或片段的糖基化模式可被改变以例如提高抗体或片段对PD-1抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可通过例如改变抗体或片段序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸置换，其导致去除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可增加抗体或片段对抗原的亲和力或亲合力。参见例如美国专利号5,714,350 和6,350,861。在一个实施方式中，抗PD-1CDRH2区具有S61N糖基化校正。
本文公开的抗体和抗原结合片段可进一步包括在低等真核生物宿主细胞中产生的那些，特别地已被遗传工程化以产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白的真菌宿主细胞如酵母和丝状真菌(参见例如Choi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027；Hamilton等， (2003)Science 301:1244-1246；Hamilton等，(2006)Science 313: 1441-1443；Nett等，Yeast 28(3):237-52(2011)；Hamilton等，Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5):387-92(2007))。这些遗传修饰的宿主细胞相对于当前使用的哺乳动物细胞系的特定优势是能够控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化模式，使得可产生其中特定N-聚糖结构占优势的糖蛋白的组合物(参见例如美国专利号7,029,872和美国专利号 7,449,308)。这些遗传修饰的宿主细胞已用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见例如Li等，(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
在具体实施方式中，本文公开的抗体及其抗原结合片段进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的那些且其包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化的杂合和复合N-聚糖，包括二等分和多天线种类，包括，但不限于，N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2； Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2； NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在具体实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段可以包含具有至少一个选自以下的杂合N-聚糖的抗体和片段： GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定的方面，杂合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。
在具体实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含具有至少一个选自以下的复合N-聚糖的抗体和片段： GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2； GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2； NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定的方面，复合N-聚糖组合物中的主要N-聚糖种类。在进一步的方面，复合N-聚糖是占组合物中复合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、 97％、98％、99％或100％的特定N-聚糖。在一个实施方式中，本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段包含复合N-聚糖，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖包含结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中这种结构是无岩藻糖基化的。此类结构可例如在工程化巴斯德毕赤酵母宿主细胞中产生。
在具体的实施方式中，N-聚糖是岩藻糖基化的。一般地，岩藻糖处于与N-聚糖的还原末端的GlcNAc的α1,3-连接中、与N-聚糖的还原末端的GlcNAc的α1,6-连接中、与N-聚糖的非还原末端的Gal的α1,2-连接中、与N-聚糖的非还原末端的GlcNac的α1,3-连接中或与N-聚糖的非还原末端的GlcNAc的α1,4-连接中。
因此，在以上糖蛋白组合物的特定方面，糖型为α1,3-连接或α1,6- 连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、 GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；为α1,3-连接或α1,4-连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、 GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、 Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或为α1,2-连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、 Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、 Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的 N-聚糖。
在以上的进一步方面，复合N-聚合还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化的二等分和多天线种类。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用且是指N-连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键附接至多肽的天冬酰胺残基的N-连接的寡糖。N-连接的糖蛋白含有连接至蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰基葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的主要糖为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N- 乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白，糖基团的加工在ER的内腔中与翻译同时发生，并在翻译后在高尔基体中继续。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2的共同五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；且“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺)。通常，N-聚糖结构以非还原末端在左侧且以还原末端在右侧出现。N-聚糖的还原末端为包含蛋白质上的糖基化位点的附接至 Asn残基的末端。N-聚糖在包含添加至Man3GlcNAc2("Man3")核心结构(其也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖”核心)的周围糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(天线)数目方面不同。N-聚糖根据其分枝组分(例如高甘露糖、复合或杂合)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常具有至少一个附接至“三甘露糖”核心的1,3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖也可具有任选地用唾液酸或衍生物(例如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸且“Ac”是指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”) 或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合N-聚糖也可具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖也可在“三甘露糖核心”上具有多个天线，经常被称为“多天线聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上具有至少一个 GlcNAc且在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上具有零或多个甘露糖。各种N-聚糖也称为“糖型”。
关于复合N-聚糖，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1" 和"A2"意思如下。"G-2"是指可以表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G-1"是指可以表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G0"是指可以表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G1" 是指可以表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G2" 是指可以表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"A1" 是指可以表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；和术语"A2"是指可以表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另外指明，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1" 和"A2"是指缺乏连接到N-聚糖的还原末端的GlcNAc残基的岩藻糖的 N-聚糖种类。当术语包括"F"时，"F"指示N-聚糖种类包含N-聚糖的还原末端的GlcNAc残基上的岩藻糖残基。例如，G0F、G1F、G2F、 A1F和A2F都表明N-聚糖还包括连接到N-聚糖的还原末端处的 GlcNAc残基的岩藻糖残基。低等真核生物如酵母和丝状真菌通常不产生生成岩藻糖的N-聚糖。
关于多天线N-聚糖，术语“多天线N-聚糖”是指在甘露糖残基上进一步包含GlcNAc残基(其包含N-聚糖的1,6-臂或1,3-臂的非还原末端)或者每个甘露糖残基上的GlcNAc残基(其包含N-聚糖的1,6 臂和1,3臂的非还原末端)的N-聚糖。因此，多天线N-聚糖可以通过下式表征：GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。术语“1-4”是指1、2、3 或4个残基。
关于二等分N-聚糖，术语“二等分N-聚糖”是指其中GlcNAc残基与N-聚糖的还原末端处的甘露糖残基连接的N-聚糖。二等分的N-聚糖可以通过式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征，其中每个甘露糖残基在其非还原末端与GlcNAc残基连接。相反，当多天线N-聚糖被表征为GlcNAc3Man3GlcNAc2时，该式表明两个GlcNAc残基与N-聚糖的两个臂之一的非还原末端处的甘露糖残基连接，并且一个GlcNAc残基连接至N-聚糖的另一臂的非还原末端处的甘露糖残基。
抗体物理性质
本文公开的抗体及其抗原结合片段可在轻链或重链免疫球蛋白可变区中进一步含有一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可导致抗体或片段的增加的免疫原性，或由于改变的抗原结合而导致的改变的抗体pK(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和 Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等(1985) Nature 316:452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含N-X-S/T序列的基序处发生。
各抗体或抗原结合片段具有独特的等电点(pI)，其通常落在6和 9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，且IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。
各抗体或抗原结合片段具有特征性熔融温度，其中较高熔融温度指示较高的体内总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning MC(2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，TM1(初始解折叠温度)可高于 60℃、高于65℃或高于70℃。抗体或片段的熔点可使用差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等(1999) ImmunolLett 68:47-52)或圆二色性(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)测量。
在进一步的实施方式中，选择不迅速降解的抗体及其抗原结合片段。可使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS测量抗体或片段的降解 (Alexander AJ和Hughes DE(1995)AnalChem 67:3626-32)。
在进一步的实施方式中，选择具有最小聚集效应的抗体及其抗原结合片段，所述聚集效应可导致不希望的免疫反应的触发和/或改变的或不利的药代动力学特性。通常，聚集度为25％或更少、20％或更少、 15％或更少、10％或更少或者5％或更少的抗体和片段是可接受的。聚集可通过几种技术测量，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC) 和光散射。
抗体缀合物
本文公开的抗体及其抗原结合片段也可与化学部分缀合。化学部分可尤其为聚合物、放射性核素或结合免疫调节剂的小分子。在具体实施方式中，化学部分是增加抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括，但不限于亲水性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、 30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee 等(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。 Wen等(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了用具有连接至放射金属螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))的PEG的缀合抗体。
本文公开的抗体及其抗原结合片段也可用如以下的标记缀合：99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
本文公开的抗体和抗原结合片段也可聚乙二醇化，例如以增加其生物(例如，血清)半衰期。为了将抗体或片段聚乙二醇化，通常使抗体或片段与聚乙二醇(PEG)的反应性形式，如PEG的反应性酯或醛衍生物，在其中一个或多个PEG基团变成附接于抗体或抗体片段的条件下反应。在具体实施方式中，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生化其它蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，待聚乙二醇化的抗体或片段是无糖基化的抗体或片段。用于聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域中已知的，且可应用于本发明的抗体。参见例如EP 0154316和EP 0401384。
本文公开的抗体和抗原结合片段也可与荧光或化学发光标记缀合，包括荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰基、伞形酮、荧光素、鲁米那标记、异鲁米那标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母素标记、2,3-二氢酞嗪二酮类、生物素/抗生素蛋白、自旋标记和稳定自由基。
可采用本领域中已知用于将本发明的抗体及其抗原结合片段与各种部分缀合的任何方法，包括由Hunter等(1962)Nature 144:945； David等(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等(1981)J.Immunol.Meth. 40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.andCytochem.30:407描述的那些方法。用于缀合抗体和片段的方法是本领域中常规和非常众所周知的。
抗体的治疗用途
还提供了用于治疗需要用本文公开的抗体或其抗原结合片段治疗的受试者，包括人类受试者，的方法。在一个实施方式中，这样的受试者患有癌症或传染病。
“受试者”可以是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠、猴(例如食蟹猴，例如猕猴(Macaca fascicularis))或兔。在某些实施方式中，所述受试者是人类受试者。
术语“与...结合”表示可以将本文提供的方法中施用的组分配制成用于同时递送的单一组合物，或分别配制成两种或更多种组合物 (例如，试剂盒)。每种组分可以在与施用其他组分不同的时间向受试者施用。在某些实施方式中，在给定时间段内以几个间隔非同时(例如，单独地或顺序地)给予每个施用。此外，可以通过相同或不同的途径将单独的组分施用于受试者。
还提供了用于治疗需要用本文公开的分离的抗体或抗原结合片段进行治疗的受试者包括人类受试者的方法。在一个实施方式中，这样的受试者患有感染或传染病。在一些实施方式中，本文提供了用于治疗癌症的抗体或抗原结合片段。在其他实施方式中，本文提供了用于治疗感染或传染病的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，本文提供了抗体或抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在其他实施方式中，本文提供了抗体或抗原结合片段在制备用于治疗感染或传染病的药物中的用途。在一个实施方式中，本文提供一种治疗人类受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文提供的抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，本文提供了一种治疗人类受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的包含编码本文提供的抗体或抗原结合片段的核酸的表达载体。在某些实施方式中，本文提供的方法进一步包括另外的治疗剂或治疗程序或者另外地与其相结合。
在一个实施方式中，另外的治疗剂选自：(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)抗VISTA抗体或其抗原结合片段；(iii)抗BTLA 抗体或其抗原结合片段；(iv)抗TIM3抗体或其抗原结合片段；(v)抗 CTLA4抗体或其抗原结合片段；(vi)抗HVEM抗体或其抗原结合片段；(vii)抗CD70抗体或其抗原结合片段；(viii)抗OX40抗体或其抗原结合片段；(ix)抗CD28抗体或其抗原结合片段；(x)抗PDL1 抗体或其抗原结合片段；(xi)抗PDL2抗体或其抗原结合片段；(xii) 抗GITR抗体或其抗原结合片段；(xiii)抗ICOS抗体或其抗原结合片段；(xiv)抗SIRPα抗体或其抗原结合片段；(xv)抗ILT2抗体或其抗原结合片段；(xvi)抗ILT3抗体或其抗原结合片段；(xvii)抗ILT4 抗体或其抗原结合片段；(xviii)抗ILT5抗体或其抗原结合片段；(xix) 抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；(xx)抗NK2GA抗体或其抗原结合片段；(xxi)抗NK2GC抗体或其抗原结合片段；(xxii)抗NK2GE抗体或其抗原结合片段；(xxiii)抗TSLP抗体或其抗原结合片段；(xxiv) 抗IL10抗体或其抗原结合片段；(xxv)STING激动剂；(xxvi)CXCR2 拮抗剂；和(xxvii)PARP抑制剂。
在一个实施方式中，药剂是抗LAG3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗VISTA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗BTLA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TIM3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗 HVEM抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CD70 抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗PDL1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗PDL2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗GITR抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗SIRPα抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT3抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗ILT5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗4-1BB抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗NK2GA抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗NK2GE抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗IL10抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是抗TSLP抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，药剂是STING激动剂。在一个实施方式中，药剂是CXCR2拮抗剂。在一个实施方式中，药剂是PARP抑制剂。
在另一实施方式中，受试者患有癌症。在一个实施方式中，癌症是例如骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、维尔姆氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌瘤癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在一个实施方式中，癌症是转移性癌，例如上述种类的转移性癌。
可以通过本文提供的抗体或抗原结合片段、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：心脏癌症：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺癌症：支气管原癌(鳞状细胞癌、未分化的小细胞癌、未分化的大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道癌症：食道癌(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌症(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺癌症(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠癌症(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠癌症(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；结肠直肠癌症；泌尿生殖道癌症：肾癌(腺癌、维尔姆斯瘤[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道癌症(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌症(腺癌、肉瘤)、睾丸癌症 (精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌症：肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤；骨骼癌症：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌症：颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、畸形性骨炎)、脑脊膜癌症(脑脊膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、脑癌症(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑脊膜瘤、胶质瘤、肉瘤)；妇科癌症：子宫癌症(子宫内膜癌)、子宫颈癌症(宫颈癌、瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌症(卵巢癌[浆液囊腺癌、粘液囊腺癌、未分类癌]、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞-莱细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴癌症(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道癌症(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管癌症(癌)，乳腺癌症；血液系统癌症：血液癌症(髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤癌症：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；以及肾上腺癌症：成神经细胞瘤。因此，本文提供的术语“癌性细胞”包括遭受上述病症任一种的细胞。
在一个实施方式中，可以通过本文提供的抗体或抗原结合片段、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：肺癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、甲状腺癌、骨髓增生异常综合征、膀胱癌、表皮癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、卵巢癌、脑癌、间质源的癌症、肉瘤、畸胎瘤(tetracarcinomas)、神经母细胞瘤、肾癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和间变性甲状腺癌。
在一个实施方式中，提供了使用本文提供的抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有病毒感染。在一个实施方式中，病毒感染是选自人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒，HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒的病毒感染。
在一个实施方式中，提供了使用本文公开的抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有细菌感染。在一个实施方式中，细菌感染是选自以下的细菌的感染：衣原体(Chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌 (staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团杆菌(Legionella)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌 (Mycobacteriumlepromatosis)和包柔氏螺旋体(Borriella)。
在一个实施方式中，本文提供了使用本文提供的抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有真菌感染。在一个实施方式中，真菌感染是选自以下的真菌的感染：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌 (Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属 (Mucorales)(毛霉菌(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
在一个实施方式中，本文提供了使用本文提供的抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有寄生虫感染。在一个实施方式中，寄生虫感染是选自以下的寄生虫的感染：溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)、福氏纳格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba)、篮氏贾第虫(Giardia lambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独或与其它另外的治疗剂和/或治疗过程相结合使用，用于在需要此类治疗或预防的受试者中治疗或预防任何疾病如癌症，例如如本文中所讨论的。也设想包含与另外的治疗剂相结合的此类抗体和片段的组合物，例如包含药学上可接受的载体的药物组合物。
因此，本文提供了治疗人受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，施用与另外的治疗剂或治疗过程相结合。
还提供了治疗人受试者的感染或传染病的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，施用与另外的治疗剂或治疗过程相结合。
在另一实施方式中，提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段，其与另外治疗剂组合用于治疗癌症；或用于治疗感染或传染病。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗感染。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗传染病。在某些实施方式中，治疗包括另外的治疗剂。
在进一步的实施方式中，提供了本文公开的抗体或抗原结合片段制备与另外的治疗剂组合用于治疗癌症；或用于治疗感染或传染病的药物的用途。在另一实施方式中，提供了本发明的抗体或抗原结合片段与用于治疗癌症或治疗感染或传染病的另外的治疗剂的组合。在一个实施方式中，提供了用于制备治疗癌症的药物的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，提供了用于制备治疗感染的药物的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，提供了用于制备治疗传染病的药物的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，该药物与另外的治疗剂一起配制。
在其他实施方式中，提供了一种在人类受试者中治疗癌症或治疗感染或传染病的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段，或者本文公开的表达载体或宿主细胞，任选地与另外的治疗剂或治疗程序结合。在一个实施方式中，提供了一种在人类受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在另一实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的感染的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在又一实施方式中，提供了一种在人类受试者中治疗传染病的方法，包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，提供了一种在人类受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸的表达载体。在另一实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的感染的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸的表达载体。在又一实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的传染病的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸的表达载体。在一个实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。在另一实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的感染的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。在又一实施方式中，提供了一种治疗人类受试者的传染病的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。在某些实施方式中，该方法进一步包括另外的治疗剂的施用。在其他实施方式中，该方法进一步包括另外的治疗程序。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独或与肿瘤疫苗相结合使用。肿瘤疫苗的实例包括但不限于用于人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的癌症的疫苗，如
Figure BDA0002612288200000531
和
Figure BDA0002612288200000532
预防乙型肝炎病毒引起的肝癌的疫苗，如
Figure BDA0002612288200000533
和
Figure BDA0002612288200000541
引发免疫反应的溶瘤病毒疗法，如
Figure BDA0002612288200000542
DNA 疫苗如Synchotrope MA2M质粒DNA疫苗和ZYC101；乳腺珠蛋白 -DNA疫苗(参见Clinical Cancer Res.2014 20(23):5964-75)；基于载体的疫苗，如PSA-TRICOM(prostvac)、PANVAC-VF、基于单核细胞增生李斯特氏菌的PSA疫苗(参见TherapeuticAdvances in Vaccines, 2014,2(5)137-148)、李斯特菌-间皮素Adeno-CEA；同种异体疫苗如GVAX、BLP-25(抗-Ankara-粘蛋白1)、Belagenpumatucel-L、 TG4010、CIMAvax表皮生长因子疫苗、NY-ESO、GM.CD40L-CCL21；自体疫苗，如：Adeno-CD40L、BCG、INGN-225、树突细胞疫苗如
Figure BDA0002612288200000543
(Sipuleucel-T)、rF-CEA-MUC1-TRICOM(panvac-DC)；抗原疫苗如MUC-1(stimuvax)、NY-ESO-1、GP-100、MAGE-A3(黑素瘤抗原编码基因A3)、INGN-225(参见Pharmacology&Therapeutics 153(2015)1-9)。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独或与化疗剂相结合使用。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独或与放射疗法相结合使用。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独或与靶向疗法相结合使用。靶向疗法的实例包括：激素疗法、信号转导抑制剂(例如，EGFR抑制剂，如西妥昔单抗
Figure BDA0002612288200000544
和埃罗替尼
Figure BDA0002612288200000545
)；HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗
Figure BDA0002612288200000546
和帕妥珠单抗
Figure BDA0002612288200000547
)；BCR-ABL抑制剂(如伊马替尼
Figure BDA0002612288200000548
和达沙替尼
Figure BDA0002612288200000549
)；ALK抑制剂(如克里唑替尼
Figure BDA00026122882000005410
和色瑞替尼
Figure BDA00026122882000005411
)；BRAF抑制剂(如维罗非尼
Figure BDA00026122882000005412
和达拉菲尼
Figure BDA00026122882000005413
)、基因表达调节剂、细胞凋亡诱导剂(例如，硼替佐米
Figure BDA00026122882000005414
和卡非佐米
Figure BDA00026122882000005415
)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗
Figure BDA00026122882000005416
和雷莫芦单抗
Figure BDA00026122882000005417
)、与毒素连接的单克隆抗体(例如，本妥昔单抗
Figure BDA00026122882000005418
和阿多曲妥珠单抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)
Figure BDA00026122882000005419
)。
在具体实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗癌治疗剂组合使用。在其他实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与免疫调节药物组合使用。在一些实施方式中，免疫调节药物是免疫调节受体抑制剂。在某些实施方式中，免疫调节药物是特异性结合受体的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段与以下一种或多种相结合使用：抗PDL1抗体、抗TIGIT抗体、抗CTLA4抗体、抗CS1抗体(例如，埃罗珠单抗)、抗KIR2DL1/2/3抗体(例如，利瑞鲁单抗(lirilumab))、抗CD137抗体(例如，乌鲁单抗(urelumab))、抗GITR抗体(例如，TRX518)、抗PD1抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、帕立珠单抗(CT-011))、抗PD-L1抗体(例如，BMS-936559、度伐单抗、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2抗体、抗ILT1抗体、抗ILT2抗体、抗ILT3抗体、抗ILT4抗体、抗ILT5抗体、抗 ILT6抗体、抗ILT7抗体、抗ILT8抗体、抗CD40抗体、抗OX40 抗体、抗ICOS、抗SIRPα、抗KIR2DL1抗体、抗KIR2DL2/3抗体、抗KIR2DL4抗体、抗KIR2DL5A抗体、抗KIR2DL5B抗体、抗 KIR3DL1抗体、抗KIR3DL2抗体、抗KIR3DL3抗体、抗NKG2A抗体、抗NKG2C抗体、抗NKG2E抗体、抗4-1BB抗体(例如， PF-05082566)、抗TSLP抗体、抗IL-10抗体、IL-10或聚乙二醇化的 IL-10或此类靶标的任何有机小分子抑制剂。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 PDL1抗体(例如，BMS-936559、度伐单抗、MSB0010718C或 MPDL3280A)相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 CTLA4抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗CS1 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR2DL1/2/3抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 CD137(例如，乌鲁单抗)抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 GITR(例如，TRX518)抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 PD-L2抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL1 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL2 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL3 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL4 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL5 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL6 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL7 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗ITL8 抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 CD40抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 OX40抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR2DL1抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL2/3抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR2DL4抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR2DL5A抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR2DL5B抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR3DL1抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR3DL2抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 KIR3DL3抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 NKG2A抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 NKG2C抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 ICOS抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 SIRPα抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 4-1BB抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 IL-10抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗 TSLP抗体相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与IL-10 或PEG化IL-10相结合使用。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抑制剂(例如，有机小分子或者抗体或其抗原结合片段)相结合使用，如：MTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒性剂、铂试剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、CD20 抑制剂、CD52抑制剂、CD30抑制剂、RANK(核因子κ-B的受体激活物)抑制剂、STING激动剂、CXCR2拮抗剂、RANKL(核因子κ-B 配体的受体激活物)抑制剂、ERK抑制剂、MAP激酶抑制剂、AKT 抑制剂、MEK抑制剂、PARP抑制剂、PI3K抑制剂、HER1抑制剂、 HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、Bcl2抑制剂、CD22抑制剂、CD79b抑制剂、ErbB2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与以下的任何一种或多种相结合使用：13-顺式-视黄酸、(3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮)、4-羟基他莫昔芬、5-脱氧尿苷、5'-脱氧-5- 氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基星孢菌素、A-443654、醋酸阿比特龙、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、ABT-578、阿考比芬、 ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺、阿米福汀、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬、AS-252424、AS-605240、天冬酰胺酶、AT-9263、阿曲生坦、阿西替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)疫苗、batabulin、BC-210、besodutox、贝伐单抗、比卡鲁胺、Bio111、BIO140、博莱霉素、BMS-214662、 BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜树碱、卡奈替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CC8490、西地尼布、CG-1521、CG-781、查米多星(chlamydocin)、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西米替丁、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸盐、COL-3、CP-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、醋酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、达卡巴嗪、达西司特、放线菌素D、 dalotuzumab、达鲁舍替、达沙替尼(dasatanib)、道诺霉素、地卡塔尼 (decatanib)、鱼藤素、地尼白介素、脱氧柯福霉素、缩酚肽、二芳基丙腈、二乙基己烯雌酚、diftitox、多西他赛、多韦替尼、阿霉素、屈洛昔芬、艾特咔林(edotecarin)、钇-90标记的艾多替德(yttrium-90 labeled-edotreotide)、艾多替德(edotreotide)、EKB-569、EMD121974、内皮抑素、恩杂鲁胺、enzastaurin、表柔比星、埃博霉素B、ERA-923、爱必妥、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、ficlatuzumab、非那雄胺、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷、氟达拉宾、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟维司群、 galeterone、吉非替尼、吉西他滨、吉马替康、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、棉酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羟孕酮、羟基脲、IC87114、伊达比星、idoxyfene、异环磷酰胺、IM862、伊马替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干扰素(IFN)、白介素-12、伊匹单抗、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包覆的紫杉醇、洛莫司汀、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、 LY317615、马立马司他、氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮乙酸酯、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、陶扎色替、MLN8054、癌立消、来那替尼、neuradiab、尼罗替尼、nilutimide、诺拉曲特、NVP-BEZ235、 oblimersen、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕尼、奥戈伏单抗、orteronel、奥沙利铂、紫杉醇、帕博西尼、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、 PD0325901、PD184352、PEG-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福新、苯丙氨酸氮芥、PI-103、pictilisib、PIK-75、哌喷昔芬、PKI-166、普卡霉素、卟吩姆(porfimer)、泼尼松、丙卡巴肼、孕酮、PX-866、 R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、razoxin、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地辛、RTA744、鲁比替康、scriptaid、Sdx102、seliciclib、司美替尼、司马沙尼(semaxanib)、SF1126、西罗莫司、SN36093、索拉非尼、螺内酯、角鲨胺、SR13668、链脲菌素、SU6668、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanalide hydroxamic acid)、舒尼替尼、合成雌激素、他仑帕奈、塔利拉维(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、替米利芬、睾酮(testosterone)、粉防己碱(tetrandrine)、 TGX-221、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替西单抗(ticilimumab)、替匹法尼、替沃扎尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、曲贝替定(trabectedin)、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素A、磷酸曲西立滨单水合物、双羟萘酸曲普瑞林、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼(vatalanib)、VEGF trap、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、vitaxin、vitespan、伏立诺他、VX-745、渥曼青霉素、Xr311、zanolimumab、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
与本文提供的抗体或其抗原结合片段组合使用的合适抗癌剂的非限制性实例包括细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、对抗癌症和肿瘤疾病的靶向治疗剂(小分子、生物制剂、siRNA和微RNA)。在一个实施方式中，该药剂是抗代谢物(如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、氟达拉滨、卡培他滨)。在一个实施方式中，该药剂是烷化剂，如替莫唑胺或环磷酰胺。在一个实施方式中，该药剂是DNA相互作用或DNA损伤剂，如顺铂、奥沙利铂或阿霉素。在一个实施方式中，该药剂是电离辐射，如放射治疗。在一个实施方式中，该药剂是拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷或多柔比星。在一个实施方式中，该药剂是拓扑异构酶I抑制剂，如伊立替康或托泊替康。在一个实施方式中，该药剂是微管蛋白相互作用剂，如紫杉醇、多西他赛、Abraxane 或埃博霉素。在一个实施方式中，该药剂是驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是纺锤检查点抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，如奥拉帕尼、 niraparib或维利帕尼。在一个实施方式中，该药剂是基质金属蛋白酶 (MMP)抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是蛋白酶抑制剂，如组织蛋白酶D或组织蛋白酶K抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是蛋白酶体或泛素化抑制剂，如硼替佐米。在一个实施方式中，该药剂是突变体p53恢复其野生型p53活性的激活剂。在一个实施方式中，该药剂是腺病毒-p53。在一个实施方式中，该药剂是Bcl-2抑制剂，如ABT-263。在一个实施方式中，该药剂是热休克蛋白(HSP)调节剂，如格尔德霉素和17-AAG。在一个实施方式中，该药剂是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，如伏立诺他(SAHA)。在一个实施方式中，该药剂是性激素调节剂。在一个实施方式中，该药剂是抗雌激素，如他莫昔芬或氟维司群。在一个实施方式中，该药剂是选择性雌激素受体调节剂(SERM)，如雷洛昔芬。在一个实施方式中，该药剂是抗雄激素，如比卡鲁胺或氟他胺。在一个实施方式中，该药剂是LHRH激动剂，如亮丙瑞林。在一个实施方式中，该药剂是5α-还原酶抑制剂，如非那雄胺。在一个实施方式中，该药剂是细胞色素P450 C17裂解酶(CYP450c17，也称为17αC)。在一个实施方式中，该药剂是芳香酶抑制剂，如来曲唑、阿那曲唑或依西美坦。在一个实施方式中，该药剂是EGFR激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼或拉帕替尼(laptinib)。在一个实施方式中，该药剂是双重erbB1和erbB2抑制剂，如拉帕替尼。在一个实施方式中，该药剂是多靶点激酶(丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸激酶)抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是ABL激酶抑制剂，伊马替尼和尼罗替尼或达沙替尼。在一个实施方式中，该药剂是 VEGFR-1、VEGFR-2、PDGFR、KDR、FLT、c-Kit、Tie2、Raf、MEK 或ERK抑制剂，如舒尼替尼、索拉非尼、凡德他尼、帕唑帕尼、 PLX-4032、阿西替尼、PTK787或GSK-1120212。在一个实施方式中，该药剂是Polo-样激酶抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是极光激酶抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是JAK抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是c-MET激酶抑制剂。在一个实施方式中，该药剂是PI3K或mTOR抑制剂，如GDC-0941、BEZ-235、BKM-120或 AZD-8055。在一个实施方式中，该药剂是雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如替西罗莫司、依维莫司或42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素 (deforolimus)。在一个实施方式中，该药剂是STING(干扰素基因的刺激物)激动剂。在一个实施方式中，该药剂是CXCR(CXC趋化因子受体)抑制剂，CXCR2拮抗剂。
其他抗癌(也称为抗肿瘤)药物，包括但不限于ara-C、亚德里亚霉素、癌得星、卡铂、尿嘧啶芥末、氮芥(Clormethine)、异环磷酰胺(Ifosfsmide)、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、替尼泊苷、阿糖胞苷、培美曲塞、伊达比星、光神霉素、脱氧同型霉素、丝裂霉素C、L-天冬酰胺酶、替尼泊苷、乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾酮、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、泼尼松龙、去炎松、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羟基孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、氟他胺醋酸甲羟孕酮、托瑞米芬、戈舍瑞林、卡铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、屈洛昔芬(Drolloxafine)、六甲嘧胺、百克沙
Figure BDA0002612288200000621
泽瓦林
Figure BDA0002612288200000622
三氧二砷
Figure BDA0002612288200000623
卟菲尔钠(Porfimer)、噻替派、六甲蜜胺、Doxil、 Ontak、Depocyt、Aranesp、
Figure BDA0002612288200000624
在一个实施方式中，该药剂是法呢基蛋白转移酶抑制剂，如 SARASARTM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]] 环庚并[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-哌啶甲酰胺，替匹法尼。在一个实施方式中，该药剂是干扰素，如Intron A或Peg-Intron。在一个实施方式中，该药剂是抗-erbB1抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗。在一个实施方式中，该药剂是抗-erbB2抗体，如曲妥珠单抗在一个实施方式中，该药剂是抗-CD52抗体，如阿仑单抗。在一个实施方式中，该药剂是抗-CD20抗体，如利妥昔单抗。在一个实施方式中，该药剂是抗-CD33抗体，如吉妥珠单抗奥唑米。在一个实施方式中，该药剂是抗-VEGF抗体，如阿瓦斯丁。在一个实施方式中，该药剂是 TRIAL配体，如来沙木单抗、mapatumumab或AMG-655。在一个实施方式中，该药剂是抗-CTLA-4抗体，如伊匹单抗。在一个实施方式中，该药剂是抗CTA1、CEA、CD5、CD19、CD22、CD30、CD44、 CD44V6、CD55、CD56、EpCAM、FAP、MHCII、HGF、IL-6、MUC1、PSMA、TAL6、TAG-72、TRAILR、VEGFR、IGF-2、FGF中任一的抗体。在一个实施方式中，该药剂是抗-IGF-1R抗体，如dalotuzumab (MK-0646)或robatumumab(SCH717454)。
“雌激素受体调节剂”是指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，无论其机理如何。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”是指干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物，无论其机理如何。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其他 5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和醋酸阿比特龙。
“类视黄醇受体调节剂”是指干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，无论其机理如何。这些类视黄醇受体调节剂的实例包括蓓萨罗丁、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、 ILX23-7553、反式-N-(4'-羟基苯基)视黄酰胺和N-4-羧基苯基视黄酰胺。
“细胞毒性/细胞生长抑制剂”是指主要通过直接干扰细胞功能化性或者抑制或干扰细胞有丝分裂(cell myosis)而引起细胞死亡或抑制细胞增殖的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、缺氧可激活化合物、微管抑制剂/微管稳定剂、有丝分裂驱动蛋白抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、参与有丝分裂进程的激酶的抑制剂、参与生长因子和细胞因子信号转导途径的激酶的抑制剂、抗代谢物、生物反应调节剂、激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、泛素连接酶抑制剂和极光激酶抑制剂。
细胞毒性/细胞生长抑制剂的实例包括但不限于铂配位化合物、 sertenef、恶病质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼莫司汀、dibromodulitol、雷诺氮芥、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、舒铂、estamustine、甲苯磺酸英丙舒凡、曲洛磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、赛特铂、profiromycin、顺铂、伊洛福芬、dexifosfamide、顺式-胺二氯(2-甲基-吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式,反式,反式)-双-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、二吖啶基精胺、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3'-脱氨基-3'-吗啉代-13-脱氧 -10-羟基卡明霉素，安霉素(annamycin)、加柔比星(galarubicin)、依利奈法德(elinafide)、MEN10755、4-去甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-4- 甲基磺酰基-柔红霉素(参见WO 00/50032)。
低氧活化化合物的实例是替拉扎明。
蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于乳胞素和MLN-341 (Velcade)。
微管抑制剂/微管稳定剂的实例包括总体的紫杉烷。具体化合物包括紫杉醇
Figure BDA0002612288200000641
硫酸长春地辛，3',4'-二脱氢-4'-脱氧 -8'-norvincaleukoblastine、多西他赛
Figure BDA0002612288200000642
根霉素、海兔毒素、 mivobulin羟乙基磺酸盐、阿里他汀、西马多丁、RPR109881， BMS184476、长春氟宁、念珠藻素、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱、N,N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、 ("L-valyl-L-valyl-N-methyl-L-valyl-L-prolyl-L-proline"，公开为SEQ ID NO:128)、TDX258、埃博霉素(参见例如美国专利号6,284,781和 6,288,237)和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例是拓扑替康、hycaptamine、伊立替康、鲁吡替康、6-乙氧基丙酰基-3',4'-O-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':b,7]-indolizino[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N- 异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、 BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2'-二甲氨基-2'-脱氧 -依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H- 吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并(3’,4’:6,7)萘并(2,3-d)-1,3-二氧杂环戊烯 -6-酮、2,3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓、6,9- 双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5,10-二酮、5-(3-氨基丙氨基)-7,10-二羟基-2-(2-羟乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6- 酮、N-[1-[2-(二乙氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基] 甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基) 乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。
有丝分裂驱动蛋白，特别是人有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的实例描述于公开WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、 WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、 WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、 WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、 WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、 WO05/017190、US2005/0176776中。在一个实施方式中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP的抑制剂、MKLP1的抑制剂、 CENP-E的抑制剂、MCAK的抑制剂和Rab6-KIFL的抑制剂。
“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括但不限于SAHA、TSA、 oxamflatin、PXD101、MG98和scriptaid。其他组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的进一步参考可在以下手稿中找到：Miller,T.A.等J.Med.Chem. 46(24):5097-5116(2003)。
“参与有丝分裂进展的激酶的抑制剂”包括但不限于极光激酶的抑制剂、Polo样激酶的抑制剂(PLK；特别是PLK-1的抑制剂)、bub-1 的抑制剂和bub-R1的抑制剂。“极光激酶抑制剂”的实例是VX-680。
“抗增殖剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸如G3139、ODN698、 RVASKRAS、GEM231和INX3001，以及抗代谢物如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、多西氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、tiazofurin、地西他滨、洛拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷、2'-氟亚甲基-2'-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N'-(3,4-二氯苯基)脲、 N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油基 -B-L-manno-heptopyranosyl]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、曲沙他滨、4-[2- 氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四烷-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆素、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2'-氰基-2'-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲和曲妥珠单抗。
单克隆抗体靶向治疗剂的实例包括具有连接于癌细胞特异性的或靶细胞特异性的单克隆抗体的细胞毒性剂或放射性同位素的那些治疗剂。实例包括百克沙。
“异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂”是指抑制异戊二烯基-蛋白转移酶的任何一种或任何组合的化合物，包括法呢基蛋白转移酶 (FPTase)、香叶酰香叶基-蛋白转移酶I型(GGPTase-I)和香叶酰香叶基 -蛋白转移酶II型(GGPTase-II，也称为Rab GGPTase)。
异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的实例可以在以下出版物和专利中找到：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、 WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利No.5,420,245、美国专利No.5,523,430、美国专利No.5,532,359、美国专利No.5,510,510、美国专利No.5,589,485、美国专利No. 5,602,098、欧洲专利公开0 618 221、欧洲专利公开0 675 112、欧洲专利公开0 604 181、欧洲专利公开0 696593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利No.5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、 WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、 WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利No.5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、 WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO96/31478、 WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、 WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436和美国专利No.5,532,359。关于异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例参见 European J.of Cancer,Vol.35,No.9,pp.1394-1401(1999)。
“血管生成抑制剂”是指抑制新血管形成的化合物，无论其机理如何。血管生成抑制剂的实例包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂，如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂、表皮源、成纤维细胞源或血小板源生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、戊聚糖多硫酸盐、环加氧酶抑制剂，包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)如阿司匹林和布洛芬，以及选择性环氧化酶-2抑制剂如塞来考昔和罗非考昔 (PNAS,Vol.89,p.7384(1992)；JNCI,Vol.69,p.475(1982)；Arch.Opthalmol.,Vol.108,p.573(1990)；Anat.Rec.,Vol.238,p.68(1994)； FEBS Letters,Vol.372,p.83(1995)；Clin,Orthop.Vol.313,p.76 (1995)；J.Mol.Endocrinol.,Vol.16,p.107(1996)；Jpn.J.Pharmacol., Vol.75,p.105(1997)；Cancer Res.,Vol.57,p.1625(1997)；Cell,Vol. 93,p.705(1998)；Intl.J.Mol.Med.,Vol.2,p.715(1998)；J.Biol.Chem.,Vol.274,p.9116(1999))、甾体抗炎药(如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、强的松、泼尼松龙、methylpred、倍他米松)、羧胺三唑、康普瑞汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟霉醇、沙利度胺、血管抑素、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(参见Fernandez 等，J.Lab.Clin.Med.105:141-145(1985))和VEGF的抗体(参见 Nature Biotechnology,Vol.17,pp.963-968(October 1999)；Kim等, Nature,362,841-844(1993)；WO 00/44777和WO 00/61186)。
血管生成抑制剂的其他实例包括但不限于内皮抑素、ukrain、 ranpirnase、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)氧杂环丙基]-1-氧杂螺[2,5]辛-6-基(氯乙酰基)氨基甲酸酯、acetyldinanaline、5- 氨基-1-[[3,5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、康普瑞汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露五糖磷酸酯、7,7-(羰基-双[亚氨基-N-甲基-4,2-吡咯羰基亚氨基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-(1,3-萘二磺酸盐)和3-[(2,4-二甲基吡咯 -5-基)亚甲基]-2-吲哚酮(SU5416)。
调节或抑制血管生成并且还可以与本文提供的化合物组合使用的其他治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的药剂(参见 Clin.Chem.La.Med.38:679-692(2000)中的综述)。这样的调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解途径的药剂的实例包括但不限于肝素(参见 Thromb.Haemost.80:10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也称为活性凝血酶可激活的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂)(参见Thrombosis Res.101:329-354(2001))。TAFIa抑制剂已在美国系列No.60/310,927(2001年8月8日提交)和60/349,925(2002 年1月18日提交)中描述。
“干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药剂”是指抑制RTK且因此抑制涉及肿瘤发生和肿瘤进展的机制的化合物。这些药剂包括c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和c-Met的抑制剂。其他药剂包括如Bume-Jensen和 Hunter，Nature,411:355-365,2001中所述的RTK抑制剂。
“细胞增殖和存活信号传导途径的抑制剂”是指抑制细胞表面受体下游的信号转导级联的化合物。这样的药剂包括丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(包括但不限于Akt的抑制剂，如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、 WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、 60/734188、60/652737、60/670469中所描述的)、Raf激酶的抑制剂 (例如PLX-4032)、MEK的抑制剂(例如Arry-162、RO-4987655 和GSK-1120212)、mTOR的抑制剂(例如AZD-8055、BEZ-235和依维莫司)和PI3K的抑制剂(例如GDC-0941、BKM-120)。
如上所用，“整联蛋白阻滞剂”是指选择性地拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白结合的化合物，选择性地拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ5整联蛋白结合的化合物，拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白结合的化合物，以及拮抗、抑制或抵消毛细管内皮细胞上表达的特定整联蛋白活性的化合物。该术语还指αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4 整联蛋白的任何组合的拮抗剂。
酪氨酸激酶抑制剂的一些具体实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]二氢吲哚-2-酮、 17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔纳霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7- 甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2- 甲氧基乙氧基)-4-氨基喹唑啉、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮杂-1-酮(benzodiazocin-1-one)、SH268、染料木黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶甲磺酸盐、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、 4-(4'-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4- 氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺和EMD121974。
当前要求保护的抗体或抗原结合片段与PPAR-γ(即 PPAR-gamma)激动剂和PPAR-δ(即PPAR-delta)激动剂的组合可用于治疗某些恶性肿瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧物酶体增殖物激活受体γ和δ。PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其在血管生成中的作用已在文献中报道(参见J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31:909-913； J.Biol.Chem.1999；274:9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000； 41:2309-2317)。最近，PPAR-γ激动剂已证明在体外抑制对VEGF 的血管生成反应；曲格列酮和罗格列酮马来酸盐两者抑制小鼠视网膜新生血管的形成。(Arch.Ophthamol.2001；119:709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的实例包括但不限于
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niraparib、
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噻唑烷二酮(如 DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝齐、氯贝特、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、 MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、 DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并异噁唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸和 2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基))苯氧基)丙氧基)-2-乙基色满-2-羧酸。
本文提供的抗体或其抗原结合片段也可用于与芳香酶抑制剂组合来治疗或预防乳腺癌。芳香酶抑制剂的实例包括但不限于：阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
本文提供的抗体或其抗原结合片段也可以与以下化疗剂组合用于治疗癌症：阿巴瑞克(Plenaxis
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)；aldesleukin
Figure BDA0002612288200000705
Aldesleukin
Figure BDA0002612288200000706
阿仑单抗
Figure BDA0002612288200000707
阿利维甲酸
Figure BDA0002612288200000708
别嘌呤醇
Figure BDA0002612288200000709
六甲蜜胺
Figure BDA00026122882000007010
氨磷汀
Figure BDA00026122882000007011
阿那曲唑
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三氧化二砷
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天冬酰胺酶
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阿扎胞苷
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盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00026122882000007016
贝伐单抗
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贝沙罗汀胶囊
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贝沙罗汀凝胶
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博莱霉素
Figure BDA00026122882000007020
硼替佐米
Figure BDA00026122882000007021
布雷菲德菌素A；白消安静脉注射剂
Figure BDA00026122882000007022
白消安口服剂
Figure BDA00026122882000007023
卡普睾酮
Figure BDA00026122882000007024
卡培他滨
Figure BDA00026122882000007025
卡铂
Figure BDA00026122882000007026
卡莫司汀
Figure BDA00026122882000007027
卡莫司汀
Figure BDA00026122882000007028
卡莫司汀与聚苯丙生20植入剂(Gliadel
Figure BDA00026122882000007029
)；塞来昔布
Figure BDA00026122882000007030
西妥昔单抗
Figure BDA0002612288200000711
苯丁酸氮芥
Figure BDA0002612288200000712
顺铂
Figure BDA0002612288200000713
克拉屈滨
Figure BDA0002612288200000714
氯法拉滨
Figure BDA0002612288200000715
环磷酰胺
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环磷酰胺(Cytoxan
Figure BDA0002612288200000718
)；环磷酰胺(Cytoxan
Figure BDA0002612288200000719
)；阿糖胞苷
Figure BDA00026122882000007110
阿糖胞苷脂质体
Figure BDA00026122882000007111
达卡巴嗪
Figure BDA00026122882000007112
更生霉素、放线菌素D
Figure BDA00026122882000007113
达肝素钠注射剂
Figure BDA00026122882000007114
阿法达贝泊汀
Figure BDA00026122882000007115
达沙替尼
Figure BDA00026122882000007116
柔红霉素脂质体
Figure BDA00026122882000007117
柔红霉素、道诺霉素
Figure BDA00026122882000007118
柔红霉素、道诺霉素
Figure BDA00026122882000007119
地加瑞克
Figure BDA00026122882000007120
地尼白介素(Denileukin diftitox)
Figure BDA00026122882000007121
右雷佐生
Figure BDA00026122882000007122
右雷佐生盐酸盐
Figure BDA00026122882000007123
膜海鞘素B；17-DMAG；多西他赛
Figure BDA00026122882000007124
多柔比星(Adriamycin
Figure BDA00026122882000007125
)；多柔比星
Figure BDA00026122882000007126
多柔比星 (Adriamycin PFS
Figure BDA00026122882000007127
)；多柔比星脂质体
Figure BDA00026122882000007128
屈他雄酮丙酸盐
Figure BDA00026122882000007129
屈他雄酮丙酸盐(Masterone
Figure BDA00026122882000007130
)；依库丽单抗注射剂
Figure BDA00026122882000007131
Elliott’s B溶液(Elliott's B
Figure BDA00026122882000007132
)；艾曲波帕
Figure BDA00026122882000007133
表柔比星
Figure BDA00026122882000007134
阿法依泊汀
Figure BDA00026122882000007135
厄洛替尼
Figure BDA00026122882000007136
雌莫司汀
Figure BDA00026122882000007137
乙炔雌二醇；依托泊苷磷酸盐
Figure BDA00026122882000007138
依托泊苷、VP-16
Figure BDA00026122882000007139
依维莫司片剂
Figure BDA00026122882000007140
依西美坦
Figure BDA00026122882000007141
ferumoxytol(Feraheme
Figure BDA00026122882000007142
)；非格司亭
Figure BDA00026122882000007143
氟尿苷(动脉内)
Figure BDA00026122882000007144
氟达拉滨
Figure BDA00026122882000007145
氟尿嘧啶、5-FU
Figure BDA00026122882000007146
氟维司群
Figure BDA00026122882000007147
吉非替尼
Figure BDA00026122882000007148
格尔德霉素；吉西他滨
Figure BDA00026122882000007149
吉妥珠单抗奥唑米星
Figure BDA00026122882000007150
醋酸戈舍瑞林(Zoladex
Figure BDA00026122882000007151
)；醋酸戈舍瑞林
Figure BDA00026122882000007152
醋酸组氨瑞林(Histrelin
Figure BDA00026122882000007153
)；羟基脲
Figure BDA00026122882000007154
替伊莫单抗
Figure BDA00026122882000007155
依达比星
Figure BDA00026122882000007156
异环磷酰胺
Figure BDA00026122882000007157
甲磺酸伊马替尼
Figure BDA00026122882000007158
干扰素α2a(Roferon
Figure BDA00026122882000007159
)；干扰素α-2b(Intron
Figure BDA00026122882000007160
)；碘苄胍I 123注射液
Figure BDA00026122882000007161
伊立替康
Figure BDA00026122882000007162
伊沙匹隆
Figure BDA00026122882000007163
拉帕替尼片
Figure BDA00026122882000007164
来那度胺
Figure BDA00026122882000007165
来曲唑
Figure BDA00026122882000007166
甲酰四氢叶酸
Figure BDA00026122882000007167
Figure BDA00026122882000007168
醋酸亮丙瑞林
Figure BDA00026122882000007169
左旋咪唑
Figure BDA00026122882000007170
洛莫司汀、CCNU
Figure BDA0002612288200000721
二氯甲基二乙胺、氮芥
Figure BDA0002612288200000722
醋酸甲地孕酮
Figure BDA0002612288200000723
美法仑、L-PAM
Figure BDA0002612288200000724
巯基嘌呤、6-MP
Figure BDA0002612288200000725
美司钠
Figure BDA0002612288200000726
美司钠(Mesnex
Figure BDA0002612288200000727
)；甲氨蝶呤
Figure BDA0002612288200000728
甲氧沙林
Figure BDA0002612288200000729
8-甲氧基补骨脂；丝裂霉素C
Figure BDA00026122882000007210
米托坦
Figure BDA00026122882000007211
米托蒽醌
Figure BDA00026122882000007212
光辉霉素；苯丙酸诺龙
Figure BDA00026122882000007213
奈拉滨
Figure BDA00026122882000007214
尼罗替尼
Figure BDA00026122882000007215
Nofetumomab
Figure BDA00026122882000007216
ofatumumab
Figure BDA00026122882000007217
奥普瑞白介素
Figure BDA00026122882000007218
奥沙利铂
Figure BDA00026122882000007219
紫杉醇
Figure BDA00026122882000007220
紫杉醇
Figure BDA00026122882000007221
紫杉醇蛋白结合颗粒
Figure BDA00026122882000007222
帕利夫明
Figure BDA00026122882000007223
帕米膦酸盐
Figure BDA00026122882000007224
帕尼单抗
Figure BDA00026122882000007225
帕唑帕尼片剂
Figure BDA00026122882000007226
培加酶(Adagen(Pegademase Bovine)
Figure BDA00026122882000007227
)；培门冬酶
Figure BDA00026122882000007228
聚乙二醇非格司亭
Figure BDA00026122882000007229
培美曲塞二钠
Figure BDA00026122882000007230
喷司他丁
Figure BDA00026122882000007231
哌泊溴烷
Figure BDA00026122882000007232
普乐沙福
Figure BDA00026122882000007233
普卡霉素、光神霉素
Figure BDA00026122882000007234
卟菲尔钠
Figure BDA00026122882000007235
普拉曲沙注射液
Figure BDA00026122882000007236
甲基苄肼
Figure BDA00026122882000007237
奎纳克林
Figure BDA00026122882000007238
雷帕霉素；拉布立酶
Figure BDA00026122882000007239
雷洛昔芬盐酸盐
Figure BDA00026122882000007240
利妥昔单抗
Figure BDA00026122882000007241
罗米地辛
Figure BDA00026122882000007242
罗米司亭
Figure BDA00026122882000007243
沙格司亭
Figure BDA00026122882000007244
沙格司亭
Figure BDA00026122882000007245
索拉非尼
Figure BDA00026122882000007246
链脲佐菌素
Figure BDA00026122882000007247
舒尼替尼马来酸盐
Figure BDA00026122882000007248
滑石粉
Figure BDA00026122882000007249
他莫昔芬
Figure BDA00026122882000007250
替莫唑胺
Figure BDA00026122882000007251
替西罗莫司
Figure BDA00026122882000007252
替尼泊苷、VM-26
Figure BDA00026122882000007253
睾内酯
Figure BDA00026122882000007254
硫鸟嘌呤、6-TG
Figure BDA00026122882000007255
巯基嘌呤；噻替派
Figure BDA00026122882000007256
拓扑替康
Figure BDA00026122882000007257
托瑞米芬
Figure BDA00026122882000007258
托西莫单抗
Figure BDA00026122882000007259
托西莫单抗/I-131托西莫单抗
Figure BDA00026122882000007260
反式-视黄酸；曲妥珠单抗
Figure BDA00026122882000007261
维甲酸、ATRA
Figure BDA00026122882000007262
曲他胺；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard
Figure BDA00026122882000007263
)；戊柔比星
Figure BDA00026122882000007264
长春花碱
Figure BDA00026122882000007265
长春新碱
Figure BDA00026122882000007266
长春瑞滨
Figure BDA00026122882000007267
伏立诺他
Figure BDA00026122882000007268
渥曼青霉素；和唑来膦酸
Figure BDA00026122882000007269
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种止吐药相结合使用，包括但不限于：卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)和其它NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由MGI Pharma作为Aloxi销售)、阿瑞匹坦(由Merck and Co.； Rahway,NJ作为Emend销售)、苯海拉明(由Pfizer；New York,NY作为
Figure BDA0002612288200000731
销售)、安泰乐(由Pfizer；New York,NY作为
Figure BDA0002612288200000732
销售)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co.；Richmond,VA作为
Figure BDA0002612288200000733
销售)、劳拉西泮(由Wyeth；Madison,NJ作为
Figure BDA0002612288200000734
销售)、阿普唑仑(由 Pfizer；New York,NY作为
Figure BDA0002612288200000735
销售)、氟哌啶醇(由Ortho-McNeil； Raritan,NJ作为
Figure BDA0002612288200000736
销售)、氟哌利多
Figure BDA0002612288200000737
屈大麻酚(由 Solvay Pharmaceuticals,Inc.；Marietta,GA作为
Figure BDA0002612288200000738
销售)、地塞米松(由Merck and Co.；Rahway,NJ作为
Figure BDA0002612288200000739
销售)、甲泼尼龙(由 Pfizer；New York,NY作为
Figure BDA00026122882000007310
销售)；丙氯拉嗪(由 Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作为
Figure BDA00026122882000007311
销售)、格拉司琼(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley,NJ作为
Figure BDA00026122882000007312
销售)、昂丹司琼(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作为
Figure BDA00026122882000007313
销售)、多拉司琼(由Sanofi-Aventis；New York,NY作为
Figure BDA00026122882000007314
销售)、托烷司琼(由Novartis；EastHanover,NJ作为
Figure BDA00026122882000007315
销售)。
癌症治疗的其它副作用包括红细胞和白细胞缺乏。因此，在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与治疗或预防此类缺乏的药剂(如非格司亭、PEG-非格司亭、红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa) 或阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa))结合。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与抗癌放射疗法结合施用。例如，在一个实施方式中，放射疗法为外部束疗法 (EBT)：用于递送一束高能X射线至肿瘤位置的方法。该束在患者外部生成(例如，通过线性加速器)且靶向在肿瘤部位。这些X射线可破坏癌细胞且小心的治疗计划允许绕过周围正常组织。没有放射性源置于患者体内。在一个实施方式中，放射疗法是质子束疗法：以质子代替X-射线轰击患病组织的一种保形疗法类型。在一个实施方式中，放射疗法是保形外部束放射疗法：使用先进技术将放射疗法针对受试者身体结构进行调整的程序。在一个实施方式中，放射疗法为短距离疗法：将放射性物质暂时置于体内，通常用以将超剂量或增强剂量的放射给予一定区域。
在一个实施方式中，与抗体或其抗原结合片段结合施用的手术程序是手术肿瘤切除术。
药物组合物和施用
为了制备本文提供的抗体和抗原结合片段的药物或无菌组合物，将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington’s PharmaceuticalSciences和U.S.Pharmacopeia: National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治疗和诊断剂的制剂可通过以例如冻干粉末、浆液、水性溶液或悬浮液的形式与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如Hardman等Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington: The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams，和Wilkins, New York,NY；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman 等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
单独或与另一治疗剂组合施用的本文提供抗体的毒性和治疗功效可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定 LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数(LD50/ED50)。从这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED50而具有很小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可根据所采用的剂型和施用途径而在该范围内变化。
在进一步的实施方式中，另外的治疗剂根据Physicians’Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))与本文提供的抗体或其抗原结合片段相结合向受试者施用。
施用模式可变化。施用途径包括经口、直肠、经粘膜、经肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。
在具体实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可通过侵入性途径如通过注射来施用。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段或其药物组合物静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气溶胶递送来施用。也设想通过非侵入性途径(例如经口；例如以丸剂、胶囊或锭剂)施用。
还提供了容器(例如塑料或玻璃小瓶，例如具有盖，或色谱柱、中空孔针或注射器筒)，其包含本文提供的任一抗体或抗原结合片段或者其药物组合物。还提供了包含本文提供的任一抗体或抗原结合片段或者其药物组合物的注射装置。注射装置是经由肠胃外途径，例如肌肉内、皮下或静脉内，将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预填充有药物组合物，如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射的流体(例如抗体或片段或其药物组合物)的针筒或圆筒、用于刺穿皮肤和/或血管以注射流体的针；以及用于将流体从针筒推出且穿过针孔的柱塞。在一个实施方式中，包含本文提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置为静脉内(IV)注射装置。此类装置包括套管或套管针/针中的抗体或片段或其药物组合物，所述套管或套管针/针可附接至连接于用于容纳通过套管或套管针/针引入患者体内的流体(例如，盐水；或包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2和任选地包括葡萄糖的乳酸化林格氏溶液)的袋或储器的管。在一个实施方式中，一旦将套管针和套管插入受试者静脉中且从插入套管移除套管针，抗体或片段或其药物组合物引入装置中。IV 装置可例如插入周围静脉(例如手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或心脏右心房内(例如中央IV)；或锁骨下、颈内静脉或股静脉，且例如推进至心脏，直至其达到上腔静脉或右心房(例如中央静脉)。在一个实施方式中，注射装置为自动注射器；喷射注射器或外部输注泵。喷射注射器使用液体的高压窄射流，其穿透表皮以将抗体或片段或其药物组合物引入患者体内。外部输注泵为将抗体或片段或其药物组合物以受控量递送至患者体内的医学装置。外部输注泵可以是电动或机械动力的。不同泵以不同方式操作，例如注射器泵保持流体在注射器储器中，且可移动的活塞控制流体递送，弹性体泵保持流体在可伸展的球囊储器中，且来自球囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组辊在柔性管道的长度上向下挤压，从而推动流体向前。在多通道泵中，流体可从多个储器以多个速率递送。
本文公开的药物组合物也可用无针皮下注射装置施用；如美国专利号6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413； 4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。也设想包含药物组合物的此类无针装置。本文公开的药物组合物也可通过输注施用。众所周知的用于施用药物组合物的植入物和模块的实例包括以下中公开的那些：美国专利号4,487,603，其公开以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具有多腔室隔室的渗透药物递送系统。也设想许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的那些，和包含药物组合物的那些植入物、递送系统和模块。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织转换率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可接近性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现目标疾病状况的改善，则同时最小化不希望的副作用。因此，递送的生物制剂的量部分地取决于特定治疗性抗体和所治疗的病症的严重程度。可获得关于选择治疗性抗体或片段的适当剂量的指导 (参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub. Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.) (1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等(2003)New Engl.J. Med.348:601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973； Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等 (2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
适当剂量的测定通过临床医师，例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行。一般，剂量以略小于最佳剂量的量开始，且其随后以较小增量增加直至相对于任何负面的副作用实现所需要的或最佳的作用。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生炎性细胞因子的水平的那些量度。通常，期望的是将使用的生物制剂来源于与靶向治疗的动物相同的物种，由此最小化对药剂的任何免疫反应。在人类受试者的情况下，例如人源化和全人抗体可能是期望的。
如本文所用，术语“有效量”是指本文提供的双特异性抗体或其抗原结合片段当单独或与另外的治疗剂组合施用至细胞、组织或受试者时有效引起疾病的一种或多种症状的可测量的改善的量。当应用于单独施用的单个活性成分时，有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效应的活性成分的组合量，无论组合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数改善至少 10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％且最优选至少50％。在主观量度用于评价疾病严重程度的情况下，有效量也可导致主观量度的改善。
试剂盒
进一步提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述一种或多种组分包括但不限于与一种或多种另外的组分(包括但不限于药学上可接受的载体和/或如本文中所讨论的治疗剂)结合的抗-PD-1抗体或抗原结合片段。抗体或片段和/或治疗剂可配制为纯组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体组合。
在一个实施方式中，试剂盒包括一个容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的本文提供的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物和在另一容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的治疗剂及其药物组合物。
在另一实施方式中，试剂盒包括在单一、共同容器中的包括本文提供的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体(任选地与一种或多种治疗剂组合，任选地在药物组合物中)的组合。
如果试剂盒包括用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则所述试剂盒可包括用于进行此类施用的装置。例如，试剂盒可包括如上文所讨论的一种或多种皮下针或其它注射装置。
试剂盒可包括包装插页，其包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，以下关于本文提供的药剂组合的信息可在该插页中提供：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告信息、注意事项、不良反应、过量、适当剂量和施用、如何供应、适当储存条件、参考文献、制造商/经销商信息和专利信息。
为了方便起见，抗体或其抗原结合片段可提供于试剂盒中，即预定量的试剂与用于进行诊断或检测分析的说明的包装组合。在抗体或片段用酶标记的情况下，试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲剂(例如，阻断缓冲液或裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上优化测定灵敏度的溶液中试剂的浓度。具体地，试剂可作为干燥粉末(通常冻干的)提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液赋形剂。
还提供了包含用于多种检测分析中的一种或多种此类试剂的诊断或检测试剂和试剂盒，包括例如免疫测定，如酶联免疫吸附分析(ELISA)(夹心型或竞争形式)。试剂盒的组分可预连接至固体支持物，或可以在使用试剂盒时施加至固体支持物的表面。在一些实施方式中，信号产生装置可与本文提供的抗体或片段预缔合，或在使用前可能需要与一种或多种组分如缓冲剂、抗体-酶缀合物、酶底物等组合。试剂盒也可包括另外的试剂，例如用于减少与固相表面的非特异性结合的封闭试剂、洗涤试剂、酶底物等。固相表面可为管、珠、微量滴定板、微球或适合于固定蛋白、肽或多肽的其它材料的形式。在具体的方面，催化化学发光或发色产物形成或化学发光或发色底物的还原的酶是信号产生装置的组分。此类酶是本领域中众所周知的。试剂盒可包含本文所述的任何捕获试剂和检测试剂。任选地，试剂盒也可包含用于进行本文提供的方法的说明书。
还提供了包含包装在容器如小瓶或瓶子中的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，且进一步包含附接至容器或与容器一起包装的标签的试剂盒，所述标签描述容器的内含物且提供适应症和/或关于使用容器内含物治疗如本文所述的一种或多种疾病状态的说明。
如上文在组合疗法章节中所讨论的，两种治疗剂的同时施用不要求药剂同时或通过相同途径施用，只要药剂发挥其治疗作用的时间段存在重叠。设想同时或依次施用，如在不同日或不同的周施用。
也可制备包含本文公开的抗体、肽、抗原结合片段或多核苷酸中的至少一种和关于使用组合物作为检测试剂或治疗剂的说明书的本文公开的治疗和检测试剂盒。用于此类试剂盒中的容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它合适的容器，一种或多种检测和/或治疗组合物可置于其中，且优选适当地等分。在还提供第二治疗剂的情况下，试剂盒也可含有第二不同容器，其中可放置该第二检测和/或治疗组合物。或者，多种化合物可制备成单一药物组合物，且可包装在单一容器装置如小瓶、烧瓶、注射器、瓶或其它合适的单一容器中。本文公开的试剂盒通常还包括用于将小瓶容纳用于商业销售的严密装置中，如例如其中保持期望小瓶的注塑或吹塑塑料容器。在放射性标记、发色、荧光生成或其它类型的可检测标记或检测装置包括在试剂盒内的情况下，标记试剂可提供于与检测或治疗组合物本身相同的容器中，或者可置于其中可放置且适当等分该第二组合物的第二不同容器装置中。或者，检测试剂和标记可制备于单一容器装置中，并且在大多数情况下，试剂盒也通常包括用于将小瓶容纳用于商业销售和/或便于包装和递送的严密装置中。
还提供用于进行本文所述的检测或监测方法的装置或设备。此类设备可包括其中可输入样品的腔室或管、任选地包括阀或泵以引导样品流通过装置的流体操作系统、任选从血液分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获剂或检测试剂的混合腔室和任选地用于检测结合捕获剂免疫复合物的可检测标记的量的检测装置。样品流可以是被动的 (例如通过毛细管、流体静力学或一旦施加样品就不需要装置的进一步操纵的其它力)或主动的(例如通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力或增加的气压所产生的力)或通过主动力和被动力的组合。
在进一步实施方式中，还提供了处理器、计算机可读存储器和存储在计算机可读存储器上且适应于在处理器上执行以进行本文所述的任一方法的例行程序。合适的计算系统、环境和/或配置的实例包括个人计算机、服务器计算机、手持式或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程的消费性电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、包括以上系统或装置中任一种的分布式计算环境或本领域中已知的任何其它系统。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch和Maniatis (1982&1989 2ndEdition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Wu (1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA) 中。标准方法也出现于Ausbel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,第 1卷,John Wiley andSons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如Coligan 等(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等(2001)Current Protocols inMolecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis, MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory, Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等(2001)Current Protcolsin Immunology,Vol.1, John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY；Harlow and Lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可得的(参见，例如Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,NewYork)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见，例如Sheperd和Dean (eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York, NY；Kontermann和Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering, Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter等(2000)J.Immunol.165:6205；He 等(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem. 274:27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684； Chothia等(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol. Biol.224:487-499；美国专利No.6,329,511)。
描述了单链抗体和双体抗体(参见，例如Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem. 276:7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290； Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189；和美国专利 No.4,946,778)。提供了双功能抗体(参见，例如Mack等(1995)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15；Volkel等(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等 (2001)J.Immunol.Methods 248:1-6；Brennan等(1985)Science 229:81-83；Raso等(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985) Science 229:1202-1207；Traunecker等(1991)EMBO J.10:3655-3659；和美国专利No.5,932,448,5,532,210和6,129,914)。
还提供了双特异性抗体(参见，例如Azzoni等(1998)J.Immunol. 161:3493；Kita等(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等(2000)J. Biol.Chem.74:9115；Pandey等(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng 等(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等(2000)J.Immunol. 165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)。
抗原的纯化不是抗体产生所必需的。动物可用携带目标抗原的细胞免疫。然后可以从免疫的动物分离脾细胞，且脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如Meyaard等(1997)Immunity 7:283-290；Wright等(2000)Immunity 13:233-242；Preston等,同上； Kaithamana等(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可与例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其它目的，且包括与例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶态金)偶联的抗体(参见，例如Le Doussal 等(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等(1998)J.Immunol. 160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811； Everts等(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞术的方法，包括荧光活化的细胞分选(FACS)，是可得的(参见，例如Owens等(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,JohnWiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001) Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003) Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。用作例如诊断试剂的适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的荧光试剂是可得的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis, MO)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如 Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams和Wilkins,Phila,PA；Louis等(2002) Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于测定例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可得的(参见，例如 GenBank,Vector
Figure BDA0002612288200000831
Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；
Figure BDA0002612288200000832
(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem. 133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
1.实施例
本节的实施例通过举例说明，而不是限制的方式提供。
1.1实施例1:人源化08A抗体的亲和力成熟和结合亲和力研究
1.1.1通过基于单CDR密码子诱变文库的08A的亲和力成熟
人源化08A(具有S61N糖基化位点校正，根据SEQ ID顺序编号)Fab001(SEQ ID NO：1和2)的CDRH3、CDRL1和CDRL3靶向用于基于密码子的诱变。H3、L1和L3文库分别在位置H95-H100B、L27B-L32和L90-L97处随机化。来自每个文库的代表性单个集落的测序证实了所靶向残基的预期CDR中的随机化。每个文库产生超过 108个单个集落，表明文库的大小足以说明目标区域内每种可能的氨基酸组合。
文库进行四轮基于亲和力的溶液相噬菌体展示选择，每轮具有降低的抗原浓度。第一轮使用相对高的抗原浓度(20nM)。在随后的三轮中每一轮抗原浓度降低10倍以选择高亲和力变体。通过ELISA 筛选测试来自第四轮的单个变体与抗原的阳性结合。
为了鉴定具有比wt低的KD的变体scFv，通过OCTET RED96 (Fortebio，USA)在细菌PPE中对未纯化的天然scFv测定表观Koff。来自第四轮选择的总共156个scFv按照koff排序。选择了具有koff 改善的二十(20)个克隆用于Fab转化。kon和koff通过BIACORE 测定，且KD使用BIACORE T200评估软件计算。仅一个Fab，Fab 004 或3G9，显示KD值比08A高2倍的改善。
1.1.2通过随机诱变文库和VH/VL组合文库的08A的亲和力成熟
为了实现改善的KD，代替聚焦于H3、L1和L3，我们靶向来自 08A的CDR3的所有六个VH和VL区进行随机化诱变以建立VH和 VL组合诱变文库。相对于野生型序列，该序列具有更大的多样性，但是使用降低浓度的抗原进行淘选应导致富集保留结合的更高亲和力的克隆。生成了三个VH/VL组合文库用于淘选：(1)使用08A VH +组合VL库的轻链改组，(2)使用Fab 004VH+组合VL文库的轻链改组，和(3)VH+VL组合文库。
为了增加VH和VL中所有6个CDR上的多样性，我们采用了随机诱变策略。具体地，使用NNK密码子随机化进行诱变以将六个CDR 改变为20个氨基酸中的任何一个。为了获得在CDR环内每个残基处具有随机突变的序列文库，总共构建了十二个文库。六个VH文库分别在位置H31-H35(H1文库)、H51-H54(H2A文库)、H55-H59 (H2B文库)、H60-H64(H2C文库)、H96-H100(H3A文库)和 H96A-H102(H3B文库)处随机化。六个VL文库分别在L21-L27A (L1A文库)、L27B-L29(L1B文库)、L30-L34(L1C文库)、L51-L55 (L2文库)、L89-L93(L3A文库)和L93-L97(L3B文库)处随机化。来自每个文库的代表性单个集落的测序证实了所靶向残基的预期 CDR中的随机化。每个文库产生超过108个单个集落，表明文库的大小足以说明目标区域内的每种可能的氨基酸组合。
所有十二个文库进行三轮淘选。制备第三轮输出质粒DNA，并用作模板以扩增突变的CDR片段。通过两步重叠PCR产生组合VH 诱变scFv以将三个CDR组合在一起。组合VL诱变scFv以类似方式产生。如上所述，通过将scFv克隆到噬菌粒载体中来产生重链和轻链组合文库。
所有十二个文库单独地进行三轮解离速率噬菌体展示选择 (off-rate phagedisplay selection)，每轮具有降低的抗原浓度。第一轮使用相对高的抗原浓度(10nM)。在随后的两轮中的每一轮，抗原浓度降低10倍。组合VH或VL诱变文库使用来自第三轮输出的VH 或VL合并库通过将三个CDR组合在一起的两步重叠PCR生成。我们还通过使用重叠PCR将克隆Fab 004的重链与组合轻链组合来生成链改组文库。在存在降低抗原浓度(100pM和10am)的情况下，这些组合文库进行另外两轮解离速率选择。
由于从Fab 004开始具有更大亲和力提高的可能，因此我们相对于08A VH轻链改组文库优先从Fab 004VH轻链改组文库进行淘选和筛选。来自Fab 004VH轻改组组合文库的第二轮输出的单个变体通过ELISA筛选测试链与抗原的阳性结合。共有108个scFv按照koff排序。选择具有koff改善的七(7)个克隆用于Fab转化。kon和koff 通过BIACORE测定，并计算KD。与08A相比，所有7个Fab的KD 显示5至10倍的改善，与以前使用单个诱变文库的方法所观察到的相比，KD的改善更大(表4)。从与组合轻链文库结合的3G9重链的第二轮选择分离Fab098、Fab099、Fab100、Fab101、Fab102、Fab103 和Fab104。
为了生成VH+VL组合诱变文库，通过重叠PCR将来自VH和VL组合文库的第一轮输出的VH和VL合并库重组以生成在VH和 VL链中均具有突变的重组变体的单个文库。使用10pM抗原对VH 和VL组合文库进行另外两轮解离速率选择。通过ELISA测试来自组合文库第二轮输出的单个变体与抗原的阳性结合。按照koff对总共 216个scFv进行排序。选择具有koff改善的四(4)个克隆用于Fab 转化。kon和koff通过BIACORE测定，并计算KD。相对于08A，4个Fab(Fab128、Fab133、Fab138和Fab139)的KD显示5到18倍的改善(表4)。
1.1.3选择的克隆的序列
解离速率改善的克隆(VH和VL)的可变区进行PCR扩增(由 Genewiz，Suzhou合成的引物)。PCR反应以95℃2分钟，95℃30 秒，52℃1分钟，72℃1分钟15个循环，72℃10分钟之后4℃进行。在1％琼脂糖凝胶中检查最终的PCR产物，并使用Qiagen QIAQUICK纯化试剂盒进行纯化。
将纯化的VL和VH PCR产物分别克隆到pCP-hCk(VL)或 pCP-hCg4(Fab载体)中。然后将阳性克隆发送到BioSune(上海) 进行测序。使用MN midi-prep试剂盒(Macherey-Nagel，USA)制备质粒DNA。
1.1.4 293细胞中的瞬时转染
转染前约24小时，将OMP-293CD03培养基(OPM Biosciences，中国)中的293-F细胞以2.2×106细胞/ml传代，并在振荡器上以120 rpm/min，37℃和5％CO2孵育。转染当天，细胞密度为约4×106细胞/ml。为了确保最佳转染，细胞存活力必须大于95％。
制备每100ml细胞培养150μg质粒DNA(Fd:LC＝2:3)。将 DNA在OPTI-MEM表达培养基(Gibco，USA)中稀释，其体积相当于待转染的培养物的二十分之一，且1mg PEI(Polysciences，USA) 在与DNA溶液等同体积的OPTI-MEM表达培养基中稀释。将PEI溶液加入稀释的DNA溶液中；轻轻混合DNA-PEI混合物并转染前在室温下孵育15分钟。将DNA-PEI混合物加入细胞培养物中，同时缓慢旋动烧瓶细胞，并将DNA-PEI混合物与细胞一起孵育4小时。将二十分之一培养基体积的蛋白胨(Fluka，USA)添加到烧瓶中。然后将细胞以125rpm/min，37℃和5％CO2培养。
1.1.5Fab的纯化
在第6天将上述条件培养基加载到0.6ml KAPPASELECT树脂 (GE Healthcare，USA)柱上，该柱用25mM Tris，150mM NaCl， pH 8.0平衡。然后，柱在样品加载后用平衡缓冲液涤至基线。洗涤后，柱用50mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH 3.0洗脱，然后立即添加 1M精氨酸，400mM琥珀酸，pH 9.0以将pH值调节至5.5。最终产物用PBS溶液透析。通过SDS-PAGE分析蛋白质纯度，并通过Bradford 方法测定其浓度。
1.1.6纯化的Fab的尺寸排阻色谱分析
在环境温度下，使用HPLC系统(E2695，Waters)通过SEC SIZESEP-SIH柱(Waters，内径7.8mm，长30cm)进行尺寸排阻色谱(SEC)用于分析纯化的抗体。五倍的PBS缓冲液以1mL/min的流速用作流动相。进样量为20μl，在280nm处检测。
1.1.7纯化的Fab的Biacore分析
重组人或食蟹猴PD-1在CM5芯片上的固定：CM5传感器芯片在FC2中通过7分钟注射(10μl/min)新制备的1:1 50mM NHS:200 mM EDC激活。在10mM乙酸钠缓冲液pH 5.0中浓度为0.2μg/ml 的PD-1以5μl/min(HBS-EP运行缓冲液：10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)注射到激活的芯片上120秒。剩余的活性偶联位点以10μl/min用7分钟注射1M 乙醇胺封闭。
结合动力学测量：在结合阶段中，各种浓度的Fab以30μl/min 的流速注射180秒。通过使HBS-EP缓冲液流过芯片表面600秒来监测结合抗体的解离。在每个循环结束时，通过注射再生缓冲液(pH 1.7 的10mM甘氨酸缓冲液)180秒来再生传感器表面。在传感图针对来自参考流的信号校正后，使用BIACORE T 200评估软件1.0版(Biacore，GE，USA)计算动力学。
表3.Fab98-104亲和力成熟突变比对
Figure BDA0002612288200000881
Figure BDA0002612288200000891
Figure BDA0002612288200000901
表4.从组合CDR诱变文库分离的Fab的亲和力
Figure BDA0002612288200000902
1.2实施例2:小鼠和人源化抗PD-1mAb对人PD1的亲和力
1.2.1通过BIAcore测定的表面动力学
使用捕获模式的基于表面等离子体共振(SPR)的测定用于确定抗PD-1抗体对多组氨酸标记的人PD-1(hPD1-His，98AFK)的结合动力学和亲和力。按照制造说明书，使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare，BR100050)激活S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare，BR100530)。在提供的pH 5.0，10mM乙酸钠缓冲液中稀释的人捕获试剂盒(抗人Fc，25μg/mL，GE Healthcare，BR100839)或小鼠捕获试剂盒(抗小鼠Fc，30μg/mL，GE Healthcare，BR100838)抗体固定到活化表面上7分钟。在固定后，表面用1M乙醇胺/HCl(pH 8.5)失活7分钟。在四个流动池的每一个中，最终的固定化水平对于小鼠捕获达到～8,000共振单位(RU)和对于人捕获达到～12,000RU。
在HBS-EP+(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA， 0.05％v/vSurfactant P20)运行缓冲液中的biacore T200上在25℃下测量结合动力学。在小鼠或人Fc捕获表面上以10μL/min的流速捕获抗体。抗体在流动池2、3和4上捕获。流动池1用作无抗体捕获的参考。在运行缓冲液(HBS-EP+)中从20nM开始制备分析物98AFK (hPD1-His)的6点2倍系列稀释。包含两个缓冲空白供双重参考。滴定系列以50μl/min注射3分钟，然后解离600秒。在每个循环后，表面通过在抗人Fc芯片上以10μL/mL注射30秒的3M MgCl2或在在抗小鼠Fc芯片上以10μl/min注射180秒的10mM甘氨酸pH 1.7 来再生。
使用Biacore T200评估软件2.0.4版(GE Healthcare)进行传感图处理和数据分析。显示抗体结合的传感图在通过减去参考流动池1 中的信号和来自空白注射的信号的双重参考后获得。处理的曲线全局拟合于1:1结合模型以确定结合速率常数kon(M-1s-1，其中“M”等于摩尔和“s”等于秒)和解离速率常数koff(s-1)。这些速率常数用于计算平衡解离常数，KD(M)＝koff/kon。
1.2.2通过BIAcore测定的溶液亲和力
使用溶液模式的基于SPR的测定法用于测定抗PD-1人源化抗体对多组氨酸标记的人PD-1(hPD1-His，98AFK)的溶液亲和力。按照制造说明书，使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare，BR100050)激活S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare，BR100530)。人PD1-His(98AFK，在pH 5.0 10mM乙酸钠缓冲液中稀释的40μg/mL)固定到活化表面上7分钟。固定后，表面用1M乙醇胺/HCl(pH 8.5)灭活7分钟。流动池中最终固定化水平达到约6,000共振单位(RU)。
通过在一系列滴定中测量抗体互补位的未结合分数来确定溶液亲和力，其中抗体浓度保持恒定(在500pM或100pM)，并且抗原， hPD1-His(98AFK)浓度在16点滴定系列中从100nM 1:2稀释至3 pM。滴定系列孵育16-24小时以在室温下达到平衡。使用固定有抗原的BIAcore芯片以竞争模式测量未结合位点，其中检测的SPR信号对应于未结合抗体。
在HBS-EP+(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA， 0.05％v/vSurfactant P20)运行缓冲液中BIACORE T200上，在25℃下测量溶液亲和力。在>16小时孵育后的滴定系列注射到固定有 hPD1-His的传感器芯片上(如上)。在以10μL/min注射120秒(对于500pM mAb系列)或400秒(对于100pM mAb系列)后，游离的未结合抗体浓度与RU成比例地测量。在每个循环后，以30μL/min 30秒注射3M MgCl2和pH 2.0 10mM甘氨酸的1:1混合物再生表面。
使用KINEXA Pro版本1.02(Sapydyne)进行数据分析，其中 RU标准化并相对于浓度作图。使用n-Curve Analysis版本1.02 (Sapidyne)拟合两次滴定(使用100pM和500pM固定抗体浓度) 的标准化数据以获得每个相互作用的KD(M)值。
在标准的基于表面的亲和力测量中，亲本小鼠08A抗体显示0.24 nM亲和力。相反，与亲本小鼠08A抗体相比，亲本小鼠08A抗体变体VH CDR2中的N59Q，N59E和N59A显示出降低的亲和力。人源化的08A IgG4抗体变体全部相对于亲本小鼠08A抗体表现出更紧密的亲和力。随后具有CDHR2中的G56A、S61N和G56A/S61N校正的人源化08A IgG4抗体变体显示出亲和力提高的趋势，而N55E没有。具有G56A校正的人源化08A亲和力成熟形式Fab098 IgG4抗体提高亲和力约3倍。具有S61N和G56A校正的人源化08A亲和力成熟形式Fab100 IgG4抗体提高亲和力约6倍。(见表5)
表5.针对人PD1-His(98AFK)的标准的基于表面的亲和力
Figure BDA0002612288200000931
在溶液模式亲和力测定中，具有S61N和G56A校正的亲和力成熟的人源化08A IgG4Fab 100抗体显示相比具有S61N校正的人源化 08A IgG4抗体的显著亲和力改善(参见表6)。
表6.对人PD-1-His(98AFK)的SPR溶液亲和力
Figure BDA0002612288200000932
1.3实施例3:抗PD-1/LAG3双特异性抗体的产生
抗PD-1/LAG-3双特异性抗体(BsAb)18ASS具有抗PD-1重链，其具有亲和力成熟的Fab100的重链可变区(具有CDRH2 S61N和 G56A校正)和IgG1恒定区(具有CH1突变L145E、K147T、Q175E 和S183L，CH2突变L234A、L235A和D265S，CH3突变T350V、 L351Y、F405A、Y407V)(SEQ ID NO：102)；抗PD-1轻链，其具有亲和力成熟的Fab100的轻链可变区和具有Cκ突变Q124R、 T178R的κ恒定区(SEQ ID NO：103)；抗LAG3重链，具有WO 2016028672的人源化22D2抗体Ab6的重链可变区和IgG1恒定区(具有CH1突变S181K，CH2突变L234A、L235A和D265S，CH3突变 T350V、T366L、K392L和T394W)(SEQ ID NO：96)；抗LAG3 轻链，具有WO2016028672的抗体Ab6的轻链可变区和κ恒定区(具有Cκ突变Q124E、S131T、T178Y和T180E)(SEQ ID NO：98)。
抗PD-1/LAG3双特异性抗体90ASU具有抗PD-1重链，其具有人源化08A重链可变区(具有CDRH2 S61N和G56A校正)和IgG1 恒定区(具有CH1突变L145E、K147T、Q175E和S183L，CH2突变 L234A、L235A和D265S，CH3突变T350V、L351Y、F405A和Y407V) (SEQ ID NO：101)；抗PD-1轻链，其具有人源化08A的轻链可变区和κ恒定区(具有Cκ突变Q124R、T178R)(SEQ IDNO：100)；抗LAG3重链，其具有WO 2016028672的人源化22D2抗体Ab6的重链可变区和IgG1恒定区(具有CH1突变S181K，CH2突变L234A、 L235A和D265S，CH3突变T350V、T366L、K392L和T394W的) (SEQ ID NO：96)；抗LAG3轻链，其具有WO 2016028672的抗体Ab6的轻链可变区和κ恒定区(具有Cκ突变Q124E、S131T、T178Y 和T180E)(SEQ ID NO：98)。
抗PD-1/LAG3双特异性抗体33ARK具有抗PD-1重链，其具有人源化08A重链可变区(具有CDRH2 S61N和G56A校正，和FR突变Q39E)和IgG1恒定区(具有CH1突变L145E、K147T和Q175E， CH2突变L234A、L235A和D265S，CH3突变T350V、T366L、K392L 和T394W)(SEQ ID NO：108)；抗PD-1轻链，其具有人源化08A 的轻链可变区(具有FR突变Q38R)和κ恒定区(具有Cκ突变Q124R、 Q160K和T178R)(SEQ ID NO：110)；抗LAG3重链，其具有WO 2016028672的人源化22D2抗体Ab6的重链可变区(具有FR突变 Q39R)和IgG1恒定区(具有CH1突变H168R和Q175K，CH2突变 L234A、L235A和D265S，CH3突变T350V、L351Y、F405A和Y407V) (SEQ ID NO：104)；抗LAG3轻链，其具有WO2016028672的抗体Ab6的轻链可变区(具有Q38E FR突变)和κ恒定区(具有Cκ突变Q124E、Q160E和T180E)(SEQ ID NO：106)。
抗PD-1重链和抗LAG3重链各自的CH3突变(EU编号)促进抗PD-1臂和抗LAG3臂的异二聚体形成。抗PD-1重链和轻链以及抗 LAG3重链和轻链中的CH1和Cκ突变(EU编号)促进正确的重链和轻链配对。在33ARK中，FR突变还促进正确的重链和轻链配对。 CH2突变(EU编号)降低效应子功能。S61N校正去除糖基化位点，而G56A校正去除脱酰胺位点(SEQ ID中的顺序编号)。
1.3.1 18ASS和90ASU的转染、表达和纯化
使用EXPIFECTAMINE转染试剂通过瞬时转染在中国仓鼠卵巢细胞(EXPIFECTAMINE；Thermo Fisher Scientific)中重组表达18ASS 和90ASU。编码两对重和轻抗体链的基因(90ASU：抗PD-1：SEQ ID NO：100和101；抗LAG3：SEQ ID NO：96和98)(18ASS：抗PD-1： SEQ ID NO：102和103；抗LAG3：SEQ ID NO：96和98)使用针对哺乳动物表达优化的密码子通过基因合成而构建。编码四条链的表达盒克隆到pTT5哺乳动物表达载体(来自National Resarch Council, Canada)中。编码不同蛋白质链(2条重链和2条轻链)的四个质粒 DNA以1:1:1:1:1质粒DNA比例转染，并在以93％的细胞存活力收获前表达7天。通过与蛋白A色谱树脂(MABSELECT SURE LX；GE Healthcare)过夜孵育，从培养上清液捕获组装的分泌抗体，并通过常规蛋白质纯化方法进一步纯化。如通过毛细管凝胶电泳、分析型尺寸排阻色谱法和质谱(完整质量)测量的，最终双特异性抗体纯度>98 ％。
1.3.2 33ARK的克隆、转染、表达和纯化
抗PD-1/LAG3双特异性抗体33ARK的基因产物克隆到哺乳动物表达载体pTT5中，并在CHO细胞中瞬时表达(Raymond C.等Methods. 55(1)：44-51(2011))。CHO-3E7细胞在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen目录号24040-032)的FreeStyle TMF17培养基(Invitrogen目录号A-1383501)中37℃下培养。编码2 条重链和2条轻链的四个质粒DNA(抗PD-1：SEQ ID No：108和 110)和(抗LAG3：SEQ ID No：104和106)以3L的规模按15:15:20:50 的DNA比率(抗LAG3 HC:抗PD-1HC:抗LAG3 LC:抗PD-1LC)转染。转染后24小时温度降低到32℃，且10天后收集细胞上清液。
使用具有蛋白A盒(POROSA20柱，Invitrogen，Grand Island， NY，部件号2-1001-00，2.1mmD x 30mmH，104μL)的600/717/996 HPLC系统(Waters Corporation，Milford，MA)进行上清液中的抗体定量。样品在使用PBS以2mL/min的流速注射到柱上之前使用 NANOSEPMF GHP 0.45μm离心装置(Pall Life Sciences，Part# ODGHPC35)通过以8000-11000g离心3分钟过滤。用0.15M NaCl， pH 2.0进行洗脱。使用EMPOWER软件(Waters Corporation，Milford， MA)处理数据，并通过线性回归拟合曲线。
2L和3L细胞培养液离心并过滤，然后以10ml/min加载到10mL 的MABSELECT SURE(GE Healthcare)蛋白A柱上。33ARK双特异性抗体用100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.0洗脱，并用TRIS缓冲液 pH 11中和至pH 6-7。样品与样品变性溶液(用于还原条件)或蛋白质表达样品缓冲液(用于非还原条件)混合，并加载在BioRad硬壳 96孔板上。然后将样品在70℃加热15分钟，离心并与水和凝胶染料溶液混合，然后在LabChip GXII上运行。蛋白A洗脱液在PBS缓冲液pH 7.4中以1mL/min的流速通过
Figure BDA0002612288200000961
Express FPLC在 Superdex 200 16/60(GEHealthcare)上以单次进样纯化。将通过 CE-SDS的纯度大于90％的级分合并在一起以形成最终样品，并在20 mM乙酸钠，pH 5.0，7％蔗糖中缓冲液交换到大于2mg/mL的浓度。
1.4实施例4:工程化Jurkat.hPD-1.IL2luc+THP-1.PD-L1分析
克隆DT999A1是表达PD-1转基因的Jurkat细胞克隆，具有IL-2 介导的荧光素酶报道基因(Jurkat.hPD-1.IL2luc)。Jurkat.hPD-1.IL2luc 细胞在RPMI培养基(CorningCellgro 10-040-CV)+热灭活的10％FBS (Hyclone SH30910.03)+2mM L-谷氨酰胺(Cellgro 25-005-CI)+2 μg/ml嘌呤霉素(Sigma P9620)+0.5mg/ml遗传霉素(Gibco 10131027)中生长。细胞在以2x105细胞/ml接种后每周两次分割，并在密度超过1x106细胞/ml时分割。表达PD-L1转基因的THP-1细胞 (THP-1.PD-L1)在RPMI培养基+热灭活的10％FBS+2mML-谷氨酰胺+0.5ug/ml嘌呤霉素中生长。细胞在以3x105细胞/ml接种后每周两次分割，且在细胞达到1x106细胞/ml时分割。
使用测定培养基[不含酚红的RPMI培养基(Gibco 11835 030)+ 10％透析的FBS(Hyclone，SH30079.03)]设置生物测定。将五十微升的起始浓度为30μg/ml的4倍系列抗体稀释液添加到白壁组织培养物处理平板中。对于抗体滴定，加入包含4x106细胞/ml THP-1.PD-L1 +1x106细胞/ml Jurkat.hPD-1.IL2luc细胞以及2X刺激条件的2ng/ml LPS(SigmaL4391)和100ng/ml的IFN-g(R&D systems 285-IF/CF) 的50μl细胞悬液。在22小时孵育(培养箱中37℃)结束时，加入 10μl的55ng/ml抗PD-1抗体(BD Pharmingen 555336；11X工作溶液)另外2小时。加入一百微升的ONE-GLO试剂(Promega E6120)，且平板在Perkin ElmerENVISION上读取，积分时间为0.1秒。使用 GRAPHPAD软件绘制相对光单位(RLU)的原始数据并计算EC50 值。也参见图1。
表7.测试样品的EC50值
Figure BDA0002612288200000971
Figure BDA0002612288200000981
具有亲和力成熟的Fab100序列(具有S61N和G56A校正)的双特异性抗体18ASS比具有非亲和力成熟的人源化08A序列(具有 S61N和G56A校正)的双特异性抗体90ASU的效力高5至6倍。同样，具有亲和力成熟的Fab100序列(具有S61N校正)的Fab 31ARL 的效力比具有非亲和力成熟的人源化08A序列(具有S61N校正)的 Fab 00APE高5至6倍。具有亲和力成熟的Fab100序列(具有S61N 和G56A校正)的双特异性抗体18ASS的效力也比具有非亲和力成熟的人源化08A序列(具有S61N校正)及促进正确的轻链和重链配对的不同CH1-Cк和FR突变的双特异性抗体33ARK高5至6倍。
1.5实施例5:混合淋巴细胞反应(MLR)分析
人外周血单核细胞(PBMC)从白斑(leukopacks)纯化，并在液氮冰箱中冷冻。将冷冻的人PBMC解冻，在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (ThermoFisher：20012027)中稀释，以450×g离心5分钟，并将细胞沉淀用细胞分离缓冲液；PBS，胎牛血清(FBS)(ThermoFisherScientific；10438026)和乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA) (Sigma-Aldrich；E7889-100ML)重悬。使用人单核细胞富集试剂盒 (STEMCELL technologies；19059)富集单核细胞。将细胞在具有100 ng/mL的GM-CSF(R&D Systems；215-GM-110)和50ng/mL的人IL-4 (R&D Systems；204-IL-010/CF)的RPMI 1640培养基 (Gibco/ThermoFisher Scientific；11875-119)，FBS和青霉素-链霉素 (Pen/Strep)(ThermoFisher Scientific；15140122)中以1x106细胞/ml (5mL/孔)转移至6孔板。单核细胞在37℃下孵育5天以允许树突细胞(DC)分化。在第6天收获单核细胞来源的树突细胞(Mo-DC)，计数，重悬于RPMI 1640培养基、人血清(Sigma-Aldrich； H4522-100ML)和Pen/Strep中，并在MLR测定中用作刺激物。
在实验开始的当天，冷冻的人PBMC解冻并在细胞分离缓冲液中稀释。使用EASYSEP人CD4 T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies；17952)富集来自每个供体的CD4 T细胞。分离的CD4 T细胞以1x106细胞/mL悬浮在RPMI 1640培养基、人血清和Pen/Strep 中。Mo-DC与CD4+T细胞(1x105细胞/mL)以1:10的比率(1x104细胞/mL)混合，并将细胞混合物以200μL/孔接种在平底96孔板中。双特异性抗体使用6倍稀释系列连续稀释，并制备5X工作储备液。 50μL的每种稀释液添加到200μL培养物中以得到1X终浓度的双特异性抗体。对照孔用同种型对照抗体处理或保持不处理。使用V-PLEX 人IL-2试剂盒(Meso ScaleDiscovery，目录号K151QQD-4)在实验开始后第2天收集培养上清液用于IL-2定量。
该实施例表明，抗人PD-1/LAG-3双特异性抗体33ARK、90ASU 和18ASS通过用同种异体单核细胞衍生的树突细胞刺激的原代CD4 T细胞诱导IFN-γ和IL-2的产生(见图2)。同型对照抗体处理(37ASK) 和未处理(无Ab)MLR样品显示为对照。
1.6实施例6:人T-细胞克隆+JY.hPD-L1分析
1.6.1人CD4+T细胞克隆的产生和培养
MHC II类同种抗原特异性CD4+T细胞克隆BC4-49通过与EBV 转化的B细胞系JY进行2轮混合白细胞反应，和通过有限稀释进行克隆来产生。克隆以每2周的间隔用同种特异性抗原重新刺激，并在 Yssel培养基(IMDM，Gibco 12440-053；人血清AB，Gemimi 100512；青霉素/链霉素，Mediatech 30-002-CI；人白蛋白，Sigma A9080；ITS-X， Gibco 51500056；Transferin，Roche 10652202001；PA Bioxtra Sigma p5585；LA-OA-白蛋白，Sigma L9655)中培养。新鲜的PBMC从由 Stanford Blood Cebter提供的两个人血沉棕黄层分离，并以1：1的细胞比率合并。在使用前，PBMC在γ辐照器中以4000拉德的剂量辐照。制备野生型JY细胞并以5000拉德的剂量辐照。T细胞克隆在24 孔板中以每孔1mL用饲养细胞培养，终浓度为CD4+T细胞 0.2X106/mL，辐照PBMC 1X106/mL，辐照JY 0.1X106/mL，和100ng/mL PHA(SigmaL9017)。在再刺激后的第3天，重组人IL-2(R&D Systems；202-IL/CF)以100ng/mL的终浓度添加，并在整个扩增过程中每3-4天补充。使细胞传代至0.5-1.0X106/mL之间的最佳浓度。再刺激后第7天，T细胞表面表达了丰富水平的LAG-3和中等水平的 PD-1。
1.6.2人CD4+T细胞功能分析
抗原再刺激后第7天，从24孔培养板收获同种抗原特异性的 CD4+T细胞，然后通过离心用含2mM EDTA(Invitrogen，15575-38) 的20mL PBS(Hyclone，SH3002802)洗涤两次。沉淀在Yssel培养基中重悬浮成单细胞悬液。双特异性抗体90ASU、18ASS在96孔U 型底培养板(Falcon，353077)的100μL的体积中在yssel培养基中从最终的133nM最高浓度开始的5倍连续稀释，总共7个稀释进行滴定。双特异性抗体具有hIgG1 Fc L234A/L235A/D265S突变。同型对照37ASK(SEQ ID NO：126和127)是具有相同突变的抗RSV。 50微升的T细胞悬液以4×105细胞/mL的密度加入到含有滴定的抗体的孔中。抗体/T细胞混合物在5％CO2的37℃下的培养箱中预孵育1 小时。表达人PD-L1转基因的JY细胞(JY.hPD-L1)用于共培养以提供同种特异性抗原。收获在含10％FCS的RPMI培养基(Corning Cellgro，10-040-CV)中于T-75烧瓶(Thermo Scientific，156499) 中培养的JY.hPD-L1细胞，并以5000拉德在γ辐照器中进行辐照，然后通过离心用含有2mM EDTA的PBS洗涤两次。沉淀用Yssel培养基重悬，并在接种前用40μm细胞过滤器过滤。将50μL/孔的 JY.hPD-L1悬浮液以2×105细胞/mL的浓度分配到预孵育的抗体-T细胞混合物中，其中T细胞与JY.hPD-L1细胞比率为2:1。所有条件一式两份运行。培养约3天后，收获每孔100μL上清液用于人IFNγ定量。使用hIFNγQUANTIKINE试剂盒(R&D Systems，SIF50)进行人IFNγELISA以评估重复的合并上清液的IFNγ水平。分析按照制造商提供的标准方案进行。使用GRAPHPAD prism软件计算EC50值。这些实验的数据在图3中示出。
该实施例证明了双特异性抗人PD-1/LAG-3抗体90ASU(具有 S61N和G56A的抗PD-1hu-08A，/抗LAG3 hu-22D2 Ab6)和18ASS (具有S61N和G56A的亲和力成熟的抗PD-1Fab100，/抗LAG3 hu-22D2 Ab6)与T细胞克隆表达的人PD-1和人LAG-3两者结合，阻断PD-1与PD-L1的相互作用，阻断LAG-3与II类MHC的相互作用；因此，基于抑制双重PD-L1介导的和MHC II类介导的抑制，允许T细胞对同种异体刺激作出反应而产生IFNγ。另外，该实施例表明，双特异性抗人PD-1/LAG-3 90ASU和18ASS在促进T细胞IFNγ产生方面具有相当的效力。同种型对照抗体37ASK不增强激活的T 细胞克隆的IFNγ产生。
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本文引用的所有参考文献通过引用并入本文达到如同具体且单独地指出每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或 GeneID条目)、专利申请或专利通过引用并入的相同程度。申请人意图的是，根据37C.F.R.§1.57(b)(1)的规定，该通过引用并入的声明与各个和每个出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利相关，其每一个按照37C.F.R.§1.57(b)(2)明确确认，即使此类引述并非紧邻专门的通过引用并入的声明。说明书中包括通过引用并入的专门声明(如果有的话)不以任何方式削弱这一通过引用并入的一般性声明。本文引用参考文献无意承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
本发明在范围上不限于本文所述的具体实施方式。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得明确。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
认为上述书面说明足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文中示出和描述的那些之外，本发明的各种修改根据前面的描述对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
表8.序列信息
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黑体显示的突变(可变区中的突变使用顺序编号，恒定区中的突变使用EU编号)，下划线突出显示CDR区(Kabat)。
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Figure IDA0002612288280000021
Figure IDA0002612288280000031
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Claims (40)

1.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:15、18、21、25、29、32或35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5、22或26的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
1)重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9、79或86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
2)轻链可变区，其包含选自以下的轻链CDR：
a.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:4、15、18、29、32或35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
b.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1,包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和
c.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
4.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
1)重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
2)轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
5.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
1)重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
2)轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
6.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
1)重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；和
2)轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
包含与SEQ ID NO:21具有至少约57％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含与SEQ ID NO:22具有至少约67％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
7.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7或88中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14、17、20、24、28、31、34或76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
8.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，包含含有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:13、16、19、23、27、30或33中所示的氨基酸序列的轻链。
9.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
10.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
11.如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，包含含有SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的轻链。
12.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:9、79、86或91的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41或10的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
13.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
14.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:75、78、81或88中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
15.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其为包含含有SEQ ID NO:74、77、80、82或89中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。
16.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
17.如权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其为包含含有SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链的抗体。
18.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
19.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:40或53的氨基酸序列的重链可变区CDR1，
b.包含SEQ ID NO:9或54的氨基酸序列的重链可变区CDR2，
c.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3，
d.包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，
e.包含SEQ ID NO:4、42、47或60的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，和
f.包含SEQ ID NO:5、48或55的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
20.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链和轻链可变区的CDR选自：
a.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
b.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
c.包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和
d.包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2，和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
21.一种结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其包含：
包含与SEQ ID NO:40具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区CDR1，包含与SEQ ID NO:9具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区CDR2，包含SEQID NO:41的氨基酸序列的重链可变区CDR3；及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，包含与SEQ ID NO:60具有至少约57％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和包含与SEQ ID NO:5具有至少约67％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
22.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
a.包含SEQ ID NO:37或119中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列的轻链可变区；
b.包含SEQ ID NO:44或121中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的轻链可变区；
c.包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的轻链可变区；和
d.包含SEQ ID NO:57或123中所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在BIACORE分析中以低于50pM的KD结合人PD-1。
24.如权利要求1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是包含两条重链和两条轻链的抗体。
25.如权利要求1-24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是具有S228P突变的包含IgG4亚型的重链区域的抗体。
26.如权利要求1-24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是包含IgG1亚型的重链区域的抗体。
27.如权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含通过哺乳动物细胞表达特征性的糖基化模式。
28.如权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含通过CHO细胞表达特征性的糖基化模式。
29.一种分离的核酸，其编码权利要求1-26的任一抗体或抗原结合片段。
30.一种表达载体，其包含如权利要求29所述的分离的核酸。
31.一种宿主细胞，其包含权利要求1-30中任一项的抗体、抗原结合片段、多核苷酸或表达载体。
32.如权利要求31所述的宿主细胞，其是细菌细胞、人细胞、哺乳动物细胞、毕赤酵母细胞、植物细胞、HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
33.一种组合物，其包含权利要求1-28中任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。
34.如权利要求33所述的组合物，进一步包含选自以下的药剂：
a.抗LAG3抗体或其抗原结合片段；
b.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；
c.抗VISTA抗体或其抗原结合片段；
d.抗BTLA抗体或其抗原结合片段；
e.抗TIM3抗体或其抗原结合片段；
f.抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；
g.抗HVEM抗体或其抗原结合片段；
h.抗CD70抗体或其抗原结合片段；
i.抗OX40抗体或其抗原结合片段；
j.抗CD28抗体或其抗原结合片段；
k.抗PDL1抗体或其抗原结合片段；
l.抗PDL2抗体或其抗原结合片段；
m.抗GITR抗体或其抗原结合片段；
n.抗ICOS抗体或其抗原结合片段；
o.抗SIRPα抗体或其抗原结合片段；
p.抗ILT2抗体或其抗原结合片段；
q.抗ILT3抗体或其抗原结合片段；
r.抗ILT4抗体或其抗原结合片段；
s.抗ILT5抗体或其抗原结合片段；
t.抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；
u.抗NK2GA抗体或其抗原结合片段；
v.抗NK2GC抗体或其抗原结合片段；
w.抗NK2GE抗体或其抗原结合片段；
x.抗TSLP抗体或其抗原结合片段；
y.抗IL10抗体或其抗原结合片段；及
z.STING激动剂；
aa.CXCR2拮抗剂；和
bb.PARP抑制剂。
35.一种产生抗体或抗原结合片段的方法，包括：
a.在利于表达编码权利要求1-28的任一抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的多核苷酸的条件下培养包含所述多核苷酸的宿主细胞；和
b.从所述宿主细胞和/或培养基回收所述抗体或抗原结合片段。
36.根据权利要求1-28中任一项的抗体或抗原结合片段，其用于：
a.癌症的治疗；或
b.感染或传染病的治疗。
37.权利要求1-28中任一项的抗体或抗原结合片段用于制备增加免疫细胞激活、治疗癌症或治疗感染或传染病的药物的用途。
38.一种治疗人类受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-28中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据权利要求30的表达载体，或根据权利要求33的组合物，任选地与另外的治疗剂或治疗程序结合。
39.一种治疗人类受试者的感染或传染病的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-28中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据权利要求30的表达载体，或根据权利要求33的组合物，任选地与另外的治疗剂或治疗程序结合。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自：
a.抗LAG3抗体或其抗原结合片段；
b.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；
c.抗VISTA抗体或其抗原结合片段；
d.抗BTLA抗体或其抗原结合片段；
e.抗TIM3抗体或其抗原结合片段；
f.抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；
g.抗HVEM抗体或其抗原结合片段；
h.抗CD70抗体或其抗原结合片段；
i.抗OX40抗体或其抗原结合片段；
j.抗CD28抗体或其抗原结合片段；
k.抗PDL1抗体或其抗原结合片段；
l.抗PDL2抗体或其抗原结合片段；
m.抗GITR抗体或其抗原结合片段；
n.抗ICOS抗体或其抗原结合片段；
o.抗SIRPα抗体或其抗原结合片段；
p.抗ILT2抗体或其抗原结合片段；
q.抗ILT3抗体或其抗原结合片段；
r.抗ILT4抗体或其抗原结合片段；
s.抗ILT5抗体或其抗原结合片段；
t.抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；
u.抗NK2GA抗体或其抗原结合片段；
v.抗NK2GC抗体或其抗原结合片段；
w.抗NK2GE抗体或其抗原结合片段；
x.抗TSLP抗体或其抗原结合片段；
y.抗IL10抗体或其抗原结合片段；
z.STING激动剂；
aa.CXCR2拮抗剂；和
bb.PARP抑制剂。
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