CN111662852A - 一种具有杀线功能的侧孢短芽孢的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有杀线功能的侧孢短芽孢杆菌剂的制备，采用侧孢短芽孢杆菌进行固体培养获得活孢子数可达100亿/g的菌剂，分类命名：侧孢短芽孢杆菌，保藏日期：2020年5月11日，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.19802，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。有效的达到了保护环境，一定程度上改善食品品质、恢复土地肥力，降解化学残留，提高农作物的产量及质量，促进了农作物的发展和交易。

Description

一种具有杀线功能的侧孢短芽孢的制备和应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体为一种具有杀线功能的侧孢 短芽孢菌剂的制备。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类植物内寄生线虫，无严格 的宿主特异性，根结线虫寄主很广，可危害39科130多种作物。线 虫体型很小，肉眼很难看到，多分布在0-20厘米土壤内，特别是3-9 厘米土壤中线虫数量最多。雌雄异体，雌成虫圆梨形，雄成虫线状，常以卵或二龄幼虫随植株残体遗留在土壤中或粪肥中越冬或翌年环 境适宜时以二龄幼虫从嫩根侵入，繁殖危害，线虫可通过带虫土或苗 及灌溉水传播，土温25℃～30℃，土壤湿度为40％-70％条件下线虫繁 殖很快，10℃以下停止活动，55℃时10分钟死亡，在无寄主条件下 可存活1年。
目前，在世界上防治根结线虫主要通过化学防治，即喷洒化学农 药等化学制剂，来杀死根结线虫。由于近十几年的化学农药过度使用 和频繁使用导致土壤肥力流失，且加速了土壤沙漠化，如果继续使用 化学农药制剂，将会给未来造成不可估量的损失，且由于近几年绿色 生态生活以及食品安全的问题不断被人们重视，因此世界上对此问题 亟需解决，但目前仍未有广泛的一种绿色生态环保的生物防治方法。
基于此，本发明设计了一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂便是 为了绿色生态环保的去防治根结线虫，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的 制备，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)，分类命名：侧孢短芽孢 杆菌；保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏 中心，保藏号为：CGMCCNo.19802；保藏日期：2020年5月11日； 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂，所述的菌剂包括固体活化 和液体发酵。
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其制备步骤如 下：
1)固体活化培养：将低温保存的侧孢短芽孢菌株接种于固体培 养基中，在28℃的条件下，无菌化活化培养48h，制得活化侧孢短芽 孢菌株若干；
2)种子液制备：用无菌的接种环在表面刮取一环步骤1)活化 的侧孢短芽孢菌菌株，取得若干，接种于种子培养基中，在36℃恒 温恒湿的条件下，扩大增殖培养24h，制得种子液；
3)液体发酵培养：取步骤2)制得的种子液，按体积比5％的比 例接种于发酵培养基中，在32℃恒温恒湿的条件下，扩大培养72h， 当在发酵培养基中观察到≥100亿/ml的侧孢短芽菌的活孢子数，停 止发酵，即得菌体发酵液；
4)固体培养：将步骤3)制得的菌体发酵液，在室温下干燥， 待冷却到室温20℃-25℃后，放进无菌凝固室进行凝固，凝固后将其 粉碎至70目即可，最终得到本发明制品。
进一步地，所述步骤1)中所述的固体培养基的组成成分及其重 量百分比为：蛋白胨3％，酵母浸粉4％，氯化钠5％，葡萄糖3％， 余量为水补充完全。
进一步地，所述步骤2)中所述的种子培养基的组成成分及重量 百分比为：蛋白胨5％，酵母浸粉3％，氯化钠1.5％，磷酸二氢钾 0.21％，硫酸镁0.12％,余量为水补充完全，pH值为7.1。
进一步地，所述步骤3)中所述的发酵培养基组成成分及其重量 百分比为：玉米浆粉4.0％，琼脂粉1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉 3.0％，无水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.01％，硫酸铵0.01％，余 量为水补充完全，pH为7.1。
进一步地，所述步骤4)中所述的粉碎至70目颗粒，将其粉碎 后需要进行多次过滤，防止粉碎过程中混入杂质。
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂在防治西瓜和番茄根结线 虫上的应用，所述的西瓜和番茄均为当地普通农户的西瓜。
进一步地，所述菌剂作用机理为：通过侧孢短芽孢分泌出的蛋白 酶进行降解根结线虫的体壁来达到生物防治的目的。
附图说明
图1为本发明一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的流程图。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂，首先，弥补了目前 世界上对根结线虫的生物防治方法；其次，本发明菌剂是一种绿色高 效的生防菌剂，不会对食品、环境、土壤造成污染，并会在一定程度 上改善食品品质、恢复土地肥力，降解化学残留，以达到本发明菌剂 的发明目的，有效的达到了保护环境，提高农作物的产量及质量，促 进了农作物的发展和交易。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例， 都属于本发明保护的范围。
一种侧孢短芽孢菌(Brevibacillus laterosporu)，采用侧孢短芽孢菌进 行固体培养获得活孢子数可达100亿/g的菌剂，该侧孢短芽孢菌已 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了 保藏，保藏号为：CGMCC No.19802。
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂，所述的菌剂包括固体活化 和液体发酵
实施例1：
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其制备步骤如 下：
1)固体活化培养：将低温保存的侧孢短芽孢菌株接种于固体培 养基中，在28℃的条件下，无菌化活化培养48h，制得活化侧孢短芽 孢菌株若干；固体培养基的组成成分及其重量百分比为：蛋白胨3％， 酵母浸粉4％，氯化钠5％，葡萄糖3％，余量为水补充完全；
2)种子液制备：用无菌的接种环在表面刮取一环步骤1)活化 的侧孢短芽孢菌菌株，取得若干，接种于种子培养基中，在36℃恒 温恒湿的条件下，扩大增殖培养24h，制得种子液，种子培养基的组 成成分及重量百分比为：蛋白胨5％，酵母浸粉3％，氯化钠1.5％，磷酸二氢钾0.21％，硫酸镁0.12％,余量为水补充完全，pH值为7.1；
3)液体发酵培养：取步骤2)制得的种子液，按体积比5％的比 例接种于发酵培养基中，在32℃恒温恒湿的条件下，扩大培养72h， 当在发酵培养基中观察到≥100亿/ml的侧孢短芽菌的活孢子数，停 止发酵，即得菌体发酵液，发酵培养基组成成分及其重量百分比为： 玉米浆粉4.0％，琼脂粉1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉3.0％，无 水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.01％，硫酸铵0.01％，余量为水补 充完全，pH为7.1；
4)固体培养：将步骤3)制得的菌体发酵液，在室温下干燥， 待冷却到室温20℃-25℃后，放进无菌凝固室进行凝固，凝固后将其 粉碎至70目即可，将其粉碎后需要进行多次过滤，防止粉碎过程中 混入杂质，最终得到本发明制品。
实施例2：一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的应用
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂在防治西瓜结线虫上的应 用
1、试验方式：进行田间试验，试验地是普通农户的西瓜地，选 用西瓜品种为丰乐无籽一号和京欣西瓜两种，。
2、试验选材：1)取实施例1制得的本发明菌剂10-20g；2)市 售2种不同化学杀虫剂，型号分别为淡紫淡紫拟青霉杀虫剂和液体石 灰氮杀虫剂；3)CK，清水；
3、试验处理：将实施例1制得的发明菌剂与水混合后进行灌溉； 市售2种不同的化学杀虫剂按照使用说明进行使用灌溉；
4、试验结果：试验结果如下表：
表一 对西瓜根结线虫的防治效率
Figure BDA0002586262550000051
实施例3：一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的应用
一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂在防治番茄根结线虫上的 应用
1、试验方式：进行田间试验，试验地是普通农户的番茄地，番 茄型号为天马54号和金凯一号；
2、试验选材：1)实施例一制得的本发明菌剂；2)市售2种不 同化学杀虫剂，与实施例2中型号相同；3)CK，清水；
3、试验处理：将实施例1制得的发明菌剂与水混合后进行灌溉； 市售2种不同的化学杀虫剂按照使用说明进行使用灌溉；
4、试验结果：试验结果如下表：
表二 对番茄根结线虫的防治效果
Figure BDA0002586262550000061
表三 侧孢短芽孢菌杀虫效果
Figure BDA0002586262550000062
表四 侧孢短芽孢菌杀虫环境评估
Figure BDA0002586262550000063
通过实施例2、实施例3我们能够明显的看出本发明产品能够高 效的防治根结线虫，且对于西瓜根结线虫效果更佳，且样本的调查结 果其致死率可达91.21％，防治率可达84.62％，通过表三和表四得出， 相对于市面购买杀虫剂，本案扩繁的侧孢短芽孢菌具有单位面积更加 丰富的菌落数，菌落活性强度搞，杀虫能力好的效果，相对于市面杀 虫剂，本案研发的侧孢短芽孢菌除虫剂具有明显保护环境的效果，对 环境影响较小，土壤恢复能力强，提高农作物的产量及质量，促进了 农作物的发展和交易。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体 示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材 料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且， 描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施 例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实 施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实 施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说 明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和 实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。 本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (9)

1.一种侧孢短芽孢菌(Brevibacillus laterosporu)，该侧孢短芽孢菌已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.19802。
2.根据权利要求1所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂，其特征在于，所述的菌剂包括固体活化和液体发酵。
3.根据权利要求2所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：
1)固体活化培养：将低温保存的侧孢短芽孢菌株接种于固体培养基中，在28℃的条件下，无菌化活化培养48h，制得活化侧孢短芽孢菌株若干；
2)种子液制备：用无菌的接种环在表面刮取一环步骤1)活化的侧孢短芽孢菌菌株，取得若干，接种于种子培养基中，在36℃恒温恒湿的条件下，扩大增殖培养24h，制得种子液；
3)液体发酵培养：取步骤2)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在32℃恒温恒湿的条件下，扩大培养72h，当在发酵培养基中观察到≥100亿/ml的侧孢短芽菌的活孢子数，停止发酵，即得菌体发酵液；
4)固体培养：将步骤3)制得的菌体发酵液，在室温下干燥，待冷却到室温20℃-25℃后，放进无菌凝固室进行凝固，凝固后将其粉碎至70目即可，最终得到本发明制品。
4.根据权利要求3所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述的固体培养基的组成成分及其重量百分比为：蛋白胨3％，酵母浸粉4％，氯化钠5％，葡萄糖3％，余量为水补充完全。
5.根据权利要求3所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述的种子培养基的组成成分及重量百分比为：蛋白胨5％，酵母浸粉3％，氯化钠1.5％，磷酸二氢钾0.21％，硫酸镁0.12％,余量为水补充完全，pH值为7.1。
6.根据权利要求3所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述的发酵培养基组成成分及其重量百分比为：玉米浆粉4.0％，琼脂粉1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉3.0％，无水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.01％，硫酸铵0.01％，余量为水补充完全，pH为7.1。
7.根据权利要求3所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的粉碎至70目颗粒，将其粉碎后需要进行多次过滤，防止粉碎过程中混入杂质。
8.根据权利要求2所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂在防治西瓜和番茄根结线虫上的应用，其特征在于，所述的西瓜和番茄均为当地普通农户的西瓜。
9.根据权利要求2所述的一种具有杀线功能的侧孢短芽孢菌剂在防治西瓜和番茄根结线虫上的应用，其特征在于，所述菌剂作用机理为：通过侧孢短芽孢分泌出的蛋白酶进行降解根结线虫的体壁来达到生物防治的目的。
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