CN111657227A - 一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，包括以下步骤：S1多抗原β1多肽免疫大白兔；S2制备免疫血清；S3不同抗原β1多肽注射量与对应的β1‑AR抗体的统计数据；S4心脏切片染色图；S5心脏切片染色图与统计数据对应构建心肌病模型；本发明的有益效果是：利用常规微量多次免疫法，选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，在降低应激性的同时能产生β1‑AR抗体；采用涡旋混合器反复混合，增强免疫抗体的表达；利用酶联免疫吸附法，构建出β1‑AR抗体的统计模型，提供数据模型；利用麻醉插管窒息法、止血摘取法，防止心脏切片假性炎症，低温保存保持心脏的生理及物理活性。
Description
技术领域
本发明涉及心肌病模型的制备领域，具体是一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法。
背景技术
自身免疫机制不仅参与系统性自身免疫疾病伴发的心律失常，而且是特发性心律失常的主要病因；已经有明确定论的是抗Ro/SSA抗体和胎儿和新生儿先天性心脏传导阻滞的发生有明确的相关性，而其他特殊的自身抗体只是影响心肌组织的生物电活动导致心律失常；免疫抑制剂和/或通过免疫吸附技术将自身抗体去除为心律失常的治疗提供了新的视角； Hongliang Li等对兔进行β1与β2肾上腺素受体细胞外第二环功能表位肽段对兔进行免疫后，所有兔均表现为β1-AR或β2-AR的高滴度表达，证明免疫成功并出现心房有效不应期缩短，心率加快，最终导致不适当窦性心动过速和房性心动过速发生。
动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究；人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制；而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。
因此针对心肌病的病理模型可采用动物病理模型进行临床模拟，进而利用动物的心肌病病理模型构建出人体临床模的心肌病病理模型，同时采用动物病理模型，可有效的控制心肌病的病理条件，从而观察到心肌病病理的全部流程，为后续的自身免疫心肌病病理模型提供期初；目前尚无自身免疫性心肌病动物模型，更缺乏相应的直接的特异性免疫抑制多肽，传统的免疫抑制剂对所有的自身免疫反应均有抑制作用，因此目前急需一种直接特异性免疫免疫的β1肾上腺素能受体的心肌病模型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，以至少达到直接特异性免疫、构建自身免疫性心肌动物模型的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，包括以下步骤：
S1选择大小均一，生长年龄差距在5-8d的大白兔，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫大白兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的大白兔；
S2选取各组中免疫后的大白兔，采取静脉血，分离纯化得到免疫后血清；
S3检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；
S4摘取各组中所述的免疫后的大白兔心脏，切片并染色，得到心脏染色图片；
S5将得到的心脏染色图片与所述的统计数据对应，即得到所述的心肌病模型。
优选的，为了进一步实现免疫完全，并得到充分的β1-AR抗体，所述的常规微量多次免疫法为，将选取的大白兔经麻醉处理后，按照每次0.1mg的多抗原β1多肽的注射量，第一次采用完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，第二次及以上均采用不完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，利用注射器在大白兔背部的第一到第五脊柱凸起处的皮下区注射，按照每处脊柱每两周免疫一次方式，免疫八周；所述的混合多抗原β1多肽为，采用涡旋混合器反复混合，至液体乳浊均匀为止；利用常规微量多次免疫法，考虑到其脊柱凸起处静脉网络较多并且静脉血管之间交集多，选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，采用常规微量多次免疫时，在降低麻醉后大白兔的应激性的同时能产生足量的大白兔β1-AR抗体；采用涡旋混合器反复混合，将弗氏佐剂与多抗原β1多肽混合充分，进而增强免疫抗体的表达。
优选的，为了进一步直观的构建β1肾上腺素能受体的心肌病模型，所述的多抗原β1多肽为，分离纯化包含有β1受体细胞外第二环功能表位肽段氨基酸序的多抗原肽，限定多抗原β1多肽包括β1受体细胞外第二环功能表位肽段氨基酸序，进而能直观构建出β1肾上腺素能受体的心肌病模型。
优选的，为了准确的测定疫后血清中的β1-AR抗体的含量，所述的检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量为，采用酶联免疫吸附法检测血清中β1-AR抗体含量；所述的酶联免疫吸附法为，将100μg/100μl的β1-AR多肽溶解于19.9ml无水硫酸钠中，配制成浓度为5μg/ml 的抗原包被液，将20ml包被液，每孔以50μl量包被酶标板，血清按1:10000浓度进行倍比稀释后，以50ug/孔在酶标板上加入倍比稀释的血清，带有碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG用以检测结合抗体1小时后在450nm测光密度值(OD)，每次测定均设有空白对照和阴性、阳性对照；利用酶联免疫吸附法，测定吸光度，对比空白对照、阳性对照和阴性对照，进而进行交叉对比，得到多组大白兔的β1-AR抗体含量的统计数据，进而构建出β1-AR抗体的统计模型，为后续对应的心肌病的图像特征匹配。
优选的，为了进一步将心肌病的模拟图像和β1-AR抗体的统计模型对应，所述的染色为采用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，利用苏木精—伊红复合染色，将心脏切片的图像具体化，与统计模型构建起联系，进而形成身免疫性心肌动物模型。
优选的，为了防止采用麻醉等方式对大白兔心机模型的影响，所述的摘取为将选定的大白兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死大白兔后，利用止血摘取法，摘取大白兔的心脏，无菌低温保存；利用麻醉插管窒息法，使大白兔麻醉插管缺氧窒息，防止应激造成心肌极速肿胀，造成切片假性炎症，同时采取止血摘取法，防止心脏失血过多而出现假性炎症，将摘取心脏进行低温保存，延续心脏活性，保持心脏的生理及物理活性。
本发明的有益效果是：
1.利用常规微量多次免疫法，考虑到其脊柱凸起处静脉网络较多并且静脉血管之间交集多，选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，采用常规微量多次免疫时，在降低麻醉后大白兔的应激性的同时能产生足量的大白兔β1-AR抗体；采用涡旋混合器反复混合，将弗氏佐剂与多抗原β1多肽混合充分，进而增强免疫抗体的表达。
2.利用酶联免疫吸附法，测定吸光度，对比空白对照、阳性对照和阴性对照，进而进行交叉对比，得到多组大白兔的β1-AR抗体含量的统计数据，进而构建出β1-AR抗体的统计模型，为后续对应的心肌病的图像特征匹配。
3.利用麻醉插管窒息法，使大白兔麻醉插管窒息，防止应激造成心肌极速肿胀，造成切片假性炎症，同时采取止血摘取法，防止心脏失血过多而出现假性炎症，将摘取心脏进行低温保存，延续心脏活性，保持心脏的生理及物理活性。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，包括以下步骤：
S1选择大小均一，生长年龄差距在5-8d的大白兔，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫大白兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的大白兔；为了进一步实现免疫完全，并得到充分的β1-AR抗体，所述的常规微量多次免疫法为，将选取的大白兔经麻醉处理后，按照每次0.1mg的多抗原β1多肽的注射量，第一次采用完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，第二次及以上均采用不完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，利用注射器在大白兔背部的第一到第五脊柱凸起处的皮下区注射，按照每处脊柱每两周免疫一次方式，免疫八周；所述的混合多抗原β1多肽为，采用涡旋混合器反复混合，至液体乳浊均匀为止；利用常规微量多次免疫法，考虑到其第三脊柱处静脉网络较多并且静脉血管之间交集多，选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，采用常规微量多次免疫时，在降低麻醉后大白兔的应激性的同时能产生足量的大白兔β1-AR抗体；采用涡旋混合器反复混合，将弗氏佐剂与多抗原β1多肽混合充分，进而增强免疫抗体的表达；为了进一步直观的构建β1肾上腺素能受体的心肌病模型，所述的多抗原β1多肽为，分离纯化包含有β1受体细胞外第二环功能表位肽段氨基酸序的多抗原肽，限定多抗原β1多肽包括β1受体细胞外第二环功能表位肽段氨基酸序，进而能直观构建出β1肾上腺素能受体的心肌病模型；
S2选取各组中免疫后的大白兔，采取静脉血，分离纯化得到免疫后血清；
S3检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；为了准确的测定疫后血清中的β1-AR抗体的含量，所述的检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量为，采用酶联免疫吸附法检测血清中β1-AR抗体含量；所述的酶联免疫吸附法为，将100μg/100μl 的β1-AR多肽溶解于19.9ml无水硫酸钠中，配制成浓度为5μg/ml的抗原包被液，将20ml 包被液，每孔以50μl量包被酶标板，血清按1:10000浓度进行倍比稀释后，以50ug/孔在酶标板上加入倍比稀释的血清，带有碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG用以检测结合抗体1小时后在 450nm测光密度值(OD)，每次测定均设有空白对照和阴性、阳性对照；利用酶联免疫吸附法，测定吸光度，对比空白对照、阳性对照和阴性对照，进而进行交叉对比，构建出β1-AR抗体的统计模型，为后续对应的心肌病的图像特征匹配提供数据；其中，0周时空白组与β1-AR 抗体组水平差异无统计学意义(P＞0.05)，随时间变化，β1-AR抗体组水平显著提高，β1-AR 抗体组水平相对空白对照组有统计学意义(P＜0.05)；
S4摘取各组中所述的免疫后的大白兔心脏，切片并染色，得到心脏染色图片；为了进一步将心肌病的模拟图像和β1-AR抗体的统计模型对应，所述的染色为采用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，利用苏木精—伊红复合染色，将心脏切片的图像具体化，与统计模型构建起联系，进而形成身免疫性心肌动物模型；为了防止采用麻醉等方式对大白兔心机模型的影响，所述的摘取为将选定的大白兔麻醉，通过脱臼窒息法，致死大白兔后，利用止血摘取法，摘取大白兔的心脏，无菌低温保存，利用脱臼窒息法，使大白兔脱臼缺氧窒息，防止应激造成心肌极速肿胀，造成切片假性炎症，同时采取止血摘取法，防止心脏失血过多而出现假性炎症；
S5将得到的心脏染色图片与所述的统计数据对应，即得到所述的心肌病模型。
对比例1
不采用常规微量多次免疫法中的选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，进行免疫注射，采取常规的第三脊柱凸起处的皮下区进行定点注射的方式，其余步骤及方法同实施例1。
对比例2
不采用麻醉插管窒息法处死大白兔，直接采用脱臼窒息处死大白兔，其余步骤及方法同实施例1。
在1000只大白兔中按照各实施例与对比例平均原则，同时以健康饲养的大白兔作为空白例，各实施例、对比例与空白例均为250只大白兔，统计各实施例与对比例相对于空白例的心肌炎症之间的离散偏差S2，得到表1：
表1各实施例与对比例相对于空白例的心肌炎症之间的离散偏差情况
| 类别 | 离散偏差S<sup>2</sup> |
| 实施例1 | 0.9689 |
| 对比例1 | 0.9311 |
| 对比例2 | 0.9453 |
由表1可知，采用常规微量多次免疫法中选取脊背第一到第五脊柱凸起处的皮下区，以及采用麻醉插管窒息法处死大白兔，得到的β1肾上腺素能受体的心肌病模型与空白例的心肌炎之间的离散偏差S2为0.9689。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1选择大小均一，生长年龄差距在5-8d的大白兔，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫大白兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的大白兔；
S2选取各组中免疫后的大白兔，采取静脉血，分离纯化得到免疫后血清；
S3检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；
S4摘取各组中所述的免疫后的大白兔心脏，切片并染色，得到心脏染色图片；
S5将得到的心脏染色图片与所述的统计数据对应，即得到所述的心肌病模型。
2.根据权利要求1所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的常规微量多次免疫法为，将选取的大白兔经麻醉处理后，按照每次0.1mg的多抗原β1多肽的注射量，第一次采用完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，第二次及以上均采用不完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，利用注射器在大白兔背部的第一到第五脊柱凸起处的皮下区注射，按照每处脊柱每两周免疫一次方式，免疫八周。
3.根据权利要求2所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的混合多抗原β1多肽为，采用涡旋混合器反复混合，至液体乳浊均匀为止。
4.根据权利要求1所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的多抗原β1多肽为，分离纯化包含有β1受体细胞外第二环功能表位肽段氨基酸序的多抗原肽。
5.根据权利要求1所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量为，采用酶联免疫吸附法检测血清中β1-AR抗体含量。
6.根据权利要求5所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的酶联免疫吸附法为，将100μg/100μl的β1-AR多肽溶解于19.9ml无水硫酸钠中，配制成浓度为5μg/ml的抗原包被液，将20ml包被液，每孔以50μl量包被酶标板，血清按1:10000浓度进行倍比稀释后，以50ug/孔在酶标板上加入倍比稀释的血清，带有碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG用以检测结合抗体1小时后在450nm测光密度值(OD)，每次测定均设有空白对照和阴性、阳性对照。
7.根据权利要求1所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的染色为采用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色。
8.根据权利要求1所述的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，其特征在于：所述的摘取为将选定的大白兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死大白兔后，利用止血摘取法，摘取大白兔的心脏，无菌低温保存。
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|---|---|---|---|
| CN202010524955.2A CN111657227A (zh) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | 一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法 |
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2020
- 2020-06-10 CN CN202010524955.2A patent/CN111657227A/zh active Pending
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