CN111635954A - 一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，该方法包含：(1)提取淫羊藿的DNA；(2)采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；(3)若DNA完整，则采用ABP1、KNOX、MADS‑2、WRKY、MYB1和ERF引物及CDDP‑PCR反应体系对步骤(1)提取的DNA样品进行扩增；(4)扩增产物进行电泳，对引物类型中WRKY、MYB1和ERF类扩增条带进行统计，并分别计算出各类型条带数平均值，大于平均值的个体则认为具有潜在优良抗性，找出WRKY类、MYB1类和ERF类引物共同筛选出的潜在优良抗性种质。本发明的方法能够筛选出淫羊藿潜在抗性种质，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育具有较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗性种质筛选的方法，具体涉及一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法。
背景技术
CDDP(conserved DNA-derived polymorphism)分子标记技术是依据植物中功能基因和基因家族的保守氨基酸序列设计引物，实现快速鉴定不同物种的分子标记手段。CDDP是基于功能基因片段设计的引物，因此扩增得到的标记片段可能是目的基因的一部分或与基因紧密连锁，是一种显性标记，具有良好的多态性，在分子标记辅助育种、遗传多样性分析等方面有重要的应用价值。
淫羊藿属(Epimedium L.)植物是小檗科(Berberidaceae)多年生草本药用植物，具有补肾强身，强筋健骨、祛风湿等功效，是我国传统中药材之一。研究表明，不同产地淫羊藿的活性成分、形态、质量差异较大，且不同居群的淫羊藿生物学特征也存在明显差异，这表明淫羊藿资源生物多样性丰富。近年来，由于人们的过度采挖及生境破坏，使其野生资源减少，加之淫羊藿种子繁殖能力较低，导致其不能满足市场需求。因此，选育抗逆性较强的优良品种进行人工繁育对于保护其种质资源尤为必要。
分子标记辅助选育优良品种是育种中的常用手段，但目前关于淫羊藿遗传多样性的研究还停留在随机分子标记上，不能满足抗性种质的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，该方法解决了淫羊藿不能满足抗性种质需求的问题，能够筛选出淫羊藿潜在抗性种质，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育具有较好的应用价值。
为了达到上述目的，本发明提供了一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，该方法包含：
(1)提取淫羊藿的DNA；
(2)采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；
(3)若DNA完整，则采用ABP1、KNOX、MADS-2、WRKY、MYB1和ERF等引物及CDDP-PCR反应体系对步骤(1)提取的DNA样品进行扩增；
(4)扩增产物进行电泳，对引物类型中WRKY、MYB1和ERF类扩增条带进行统计，并分别计算出各类型条带数平均值，大于平均值的个体则认为具有潜在优良抗性，找出WRKY类、MYB1类和ERF类引物共同筛选出的潜在优良抗性种质。
优选地，在步骤(4)中，所述电泳采用1％琼脂糖凝胶电泳。
优选地，所述ABP1引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述KNOX类引物包含：KNOX-1、KNOX-2和KNOX-3，所述KNOX-1引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列，所述KNOX-2引物包含如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，所述KNOX-3引物包含如SED ID NO.4所示的核苷酸序列。
优选地，所述MADS-2引物包含如SED ID NO.5所示的核苷酸序列。
优选地，所述WRKY类引物包含：WRKY-R2、WRKY-R2B和WRKY-3B，所述WRKY-R2引物包含如SED ID NO.6所示的核苷酸序列，所述WRKY-R2B引物包含如SED ID NO.7所示的核苷酸序列，所述WRKY-3B引物包含如SED ID NO.8所示的核苷酸序列；所述MYB1引物包含如SEDID NO.9所示的核苷酸序列；所述ERF类引物包含：ERF2和ERF3，所述ERF2引物包含如SED IDNO.2所示的核苷酸序列，所述ERF3引物包含如SED ID NO.3所示的核苷酸序列。
优选地，所述CDDP-PCR反应体系包含：2×Taq Master Mix 10.5μL，模板DNA30ng，2.5μmol·L-1的引物5.4μL，ddH2O 4.1μL。
优选地，所述扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性0.5min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。
本发明的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，解决了淫羊藿不能满足抗性种质需求的问题，具有以下优点：
(1)本发明的方法，利用引物及CDDP-PCR反应体系对淫羊藿的DNA进行CDDP-PCR扩增，该方法准确可靠、操作简单、节约时间和成本，扩增条带清晰稳定，多态性好，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育等方面具有较好的应用价值；
(2)本发明的方法，利用CDDP分子标记选育淫羊藿潜在抗性种质的方法，其操作环节少，易实施，能提高育种效率，加快育种进程，为后续品种的选育奠定了基础，同时也节省了人力和时间成本。
附图说明
图1为CDDP引物ERF2的PCR扩增结果。
图2为根据WRKY、ERF及MYB三类引物扩增结果绘制的韦恩图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1 CDDP-PCR扩增
将研钵用清水洗净晾干，加入5mL的无水乙醇后点燃，待研钵晾凉后，取采集到的淫羊藿嫩芽500mg于研钵中，倒入适量液氮，以液氮没过样品2～3cm高度为宜，研磨3～5min，然后采用试剂盒法提取石斛基因组DNA，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
扩增体系为：20μL的反应体系中含有2×Taq Master Mix(天恩泽，即用型PCR试剂盒3.0，含染料)10.5μL，模板DNA 30ng，2.5μmol·L-1的引物5.4μL，ddH2O 4.1μL。
反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性0.5min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。
表1为引物及其退火温度
如图1所示，为CDDP引物ERF2的PCR扩增结果，其中M表示DL2000DNA marker，1-17为不同产地淫羊藿：1-4：贵州沿江县木坪村(编号MPC1-MPC4)；5-7：贵州省雷山县青山村(编号QSC1、QSC2)；8-9：湖南桑植县天平山(编号TPS1、TPS2)；10-11：湖南龙山县马失村(编号MSC1、MSC2)；12-13：贵州省龙里县莲花村(编号LHC1、LHC2)；14-15：贵州省雷山县桃子寨(编号TZG1、TZG2)；16-17：湖北省恩施市板桥镇(编号BQ1、BQ2)。
实验例2抗性种质的筛选
依据上述CDDP扩增结果，对引物类型中WRKY类、MYB类和ERF类扩增条带进行统计，并分别计算出各类型条带数平均值，大于平均值的个体则认为具有潜在优良抗性，最后利用工具绘制韦恩图(参见图2)，找出上述3类引物共同筛选出的潜在优良抗性种质(表2)。集合中的元素对应实施例1中的17个种质资源。
表2筛选集合
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，该方法包含：
(1)提取淫羊藿的DNA；
(2)采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；
(3)若DNA完整，则采用ABP1、KNOX、MADS-2、WRKY、MYB1和ERF引物及CDDP-PCR反应体系对步骤(1)提取的DNA样品进行扩增；
(4)扩增产物进行电泳，对引物类型中WRKY、MYB1和ERF类扩增条带进行统计，并分别计算出各类型条带数平均值，大于平均值的个体则认为具有潜在优良抗性，找出WRKY类、MYB1类和ERF类引物共同筛选出的潜在优良抗性种质。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述电泳采用1％琼脂糖凝胶电泳。
3.根据权利要求1所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述ABP1引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述KNOX类引物包含：KNOX-1、KNOX-2和KNOX-3，所述KNOX-1引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列，所述KNOX-2引物包含如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，所述KNOX-3引物包含如SED IDNO.4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述MADS-2引物包含如SED ID NO.5所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述WRKY类引物包含：WRKY-R2、WRKY-R2B和WRKY-3B，所述WRKY-R2引物包含如SED ID NO.6所示的核苷酸序列，所述WRKY-R2B引物包含如SED ID NO.7所示的核苷酸序列，所述WRKY-3B引物包含如SED ID NO.8所示的核苷酸序列；所述MYB1引物包含如SED ID NO.9所示的核苷酸序列；所述ERF类引物包含：ERF2和ERF3，所述ERF2引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列，所述ERF3引物包含如SED ID NO.3所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述CDDP-PCR反应体系包含：2×Taq Master Mix 10.5μL，模板DNA 30ng，2.5μmol·L-1的引物5.4μL，ddH2O 4.1μL。
8.根据权利要求6所述的淫羊藿潜在抗性种质筛选的方法，其特征在于，所述扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性0.5min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200908 |