CN111635916A - 一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法 - Google Patents

一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于酵母β‑葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，将酵母细胞加入到蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；将沉淀物加入到磷酸缓冲液中配置成待提取液，加压蒸汽处理，冷却至室温，离心，反复清洗得到沉淀物；将沉淀物加入到蒸馏水中配置成悬浮液，加入甘露聚糖酶，调节pH值，恒温酶解；冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液进行升温灭酶活，离心、水洗，得到不溶物；将不溶物加入到蒸馏水中均匀搅拌形成悬浮液，超声提取，透析后冷冻干燥得到酵母β‑葡聚糖粉末。本发明的提取物中杂质减少，酵母β‑葡聚糖提取率明显增加，并且提取时间较短，反应条件绿色可控，具有较高的经济价值。

Description

一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法
技术领域
本发明涉及一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法。
背景技术
β-葡聚糖存在于许多细菌、真菌和高等植物中，它的一个重要来源是酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁。酵母细胞壁由外到内分为3层，分别为甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖，葡聚糖中大部分为β-D-葡聚糖占酵母细胞壁干重的30-60％，可以激活巨噬细胞发挥抗肿瘤，抗菌，伤口愈合，抗氧化和降脂的作用。此外，酵母β-D-葡聚糖广泛用于食品工业中作为增稠剂，乳化稳定剂和脂肪替代品，具有良好的保水性，保温性，成膜性和无刺激性。是当前研究的最多的一类活性多糖。
传统上，一般采用酸碱法提取酵母β-葡聚糖。酸碱法提取化学试剂使用量大，工艺复杂，劳动强度大。萃取中使用酸和碱会导致多糖降解，不仅会降低萃取率，而且还会影响葡聚糖的生理活性。
酿酒酵母细胞壁通常被认为是由三层结构组成：最外层的葡聚糖和与糖蛋白结合的多糖；葡聚糖中间层；葡聚糖和共价结合的几丁质的内层。这些层通常不能仅用一种方法提取。已经使用例如酶法，机械破壁法，冻溶法和有机溶剂法等一系列方法提取真菌来源的多糖。特别是第三层被认为难以提取，这是一个重大挑战，因为它覆盖了细胞壁的大部分。值得注意的是，额外的预处理对于提取酵母β-葡聚糖至关重要。酶促水解等预处理方法可提高收率和纯度，同时减少化学溶剂的使用。它们打开细胞壁，使所需的多糖从生物质中释放出来。酶处理的缺点是必须分别为每种生物质量身定制，非常有限的工作条件和较高的扩大成本。另外，传统的自溶法处理时间长，容易引入杂质，影响酵母β-葡聚糖的活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：传统酵母β-葡聚糖的预处理方法，其处理时间长，容易引入杂质，影响酵母β-葡聚糖的活性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)：将酵母细胞加入到蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；确保得到高纯度的酵母细胞，为后续高纯度酵母β-葡聚糖的提取提供基础条件。
步骤2)：将沉淀物加入到磷酸缓冲液中配置成待提取液，加压蒸汽处理30-60min，冷却至室温，离心，反复清洗得到沉淀物；产朊假丝酵母细胞壁经过处理后溶胀，细胞壁结构松散、破裂更有可能改善多糖的溶剂可及性和可萃取性，细胞壁的破裂使得内部和难以接近的细胞壁层更易于提取，大幅度提高酵母β-葡聚糖得率。
步骤3)：将步骤2)得到的沉淀物加入到蒸馏水中配置成悬浮液，加入甘露聚糖酶，调节pH值，恒温酶解；冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液进行升温灭酶活，离心、水洗，得到不溶物；甘露聚糖酶完全与底物结合，提升酶解效率，酵母细胞壁完全瓦解释放出多糖。
步骤4)：将不溶物加入到蒸馏水中均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1-2h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。超声提取后酵母β-葡聚糖被充分提取，多糖提取率大幅度提升；透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末，有效去除杂质，粗多糖纯化，该过程小分子杂质以及金属离子被除去，酵母β-葡聚糖纯度提高。
优选地，所述步骤1)中的悬浮液中酵母细胞的浓度为15-45g/L。
优选地，所述步骤1)中的离心条件为：离心力4500g，离心时间10min。
优选地，所述步骤2)中磷酸缓冲液采用PBS，其浓度为20mM，pH值为7.5。
优选地，所述步骤2)中的待提取液中沉淀物的浓度为100-190g/L。
优选地，所述步骤2)中加压蒸汽处理的温度为90-121℃。
优选地，所述步骤3)中沉淀物与蒸馏水的质量比为1：20；甘露聚糖酶的加入量为悬浮物质量的1-10％。
优选地，所述步骤3)中加入甘露聚糖酶后，将悬浮液的pH值调至6.0；恒温酶解的温度为50-70℃，时间为60min；升温灭酶活具体为煮沸5min；离心的转速为10000r/min，时间为10min。
优选地，所述步骤4)中不溶物的质量为蒸馏水质量的5％。
优选地，所述步骤4)中超声提取的工艺参数为：超声功率600～800w，持续1s，间隔1s，探头直径25mm；透析的时间为24～48h，所用透析袋截留分子量为14000；冷冻干燥具体为：先-80℃预冷冻22h，然后-60℃冷冻干燥12-24h。
本发明将高压蒸煮协同酶法预处理应用于产朊假丝酵母的真菌细胞壁，高压蒸汽处理后使产朊假丝酵母细胞壁溶胀，细胞壁的破裂更有可能改善多糖的溶剂可及性和可萃取性，细胞壁的破裂使得内部和难以接近的细胞壁层更易于提取。该法可提高多糖的收率并减少加工时间，设备简单易于工业化生产。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明以产朊假丝酵母细胞作为生产原料，以高压蒸汽协同酶法预处理，大大提升了酵母β-葡聚糖的产率。
2、本发明以高压蒸汽与酶法配合，以高压蒸煮的方式使酵母细胞壁溶胀，能够有效的提升甘露聚糖酶与底物的结合率，提升了酶解深度及酵母β-葡聚糖的释放，解决了传统提取工艺的释放率低下及时间长的问题。
3、本发明采用超声提取的方式促进酵母β-葡聚糖的溶出，同时提升不溶物内的杂质快速溶解，减少了杂质的残留。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。
实施例1
一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，包括如下步骤：
步骤1：将酵母细胞加入蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；
步骤2：将沉淀物加入磷酸缓冲液(PBS，20mM，pH7.5)配置成待提取液，蒸汽处理20min，冷却至室温，经离心力4500g离心10min，反复清洗得到沉淀物；
步骤3：将沉淀物加入蒸馏水配置成悬浮液，加入甘露聚糖酶，采用1M盐酸与1M氢氧化钠调节pH为3.0，恒温酶解30min。冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液进行100℃水浴高温灭酶活，在10000r/min转速下离心10min，水洗得到不溶物；
步骤5：将不溶物加入蒸馏水均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。
所述步骤1中的酵母细胞在蒸馏水中的浓度为15g/L，离心条件为离心力4500g离心10min。
所述步骤2中的磷酸缓冲液与沉淀物的浓度是指沉淀物与缓冲液的质量百分比为10％，所述高压蒸汽条件为121℃。
所述步骤3中的沉淀物在蒸馏水中的物料比质量比为1：10，所述甘露聚糖酶添加量为悬浮物质量的0.5％，所述恒温酶解反应的温度为50℃，所述100℃水浴高温灭酶活为煮沸处理5min。
所述步骤4中不溶物与蒸馏水制备成1％(w/w)的菌悬液，超声提取条件，超声时间60min，超声功率600w，持续1s，间隔1s，探头直径为20mm。
所述步骤4中的透析的时间为48h，所用透析袋截留分子量为14000。
所述步骤4中的冷冻干燥包括-80℃预冷冻22h，-60℃冷冻干燥18h。
实施例2
一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，包括如下步骤：
步骤1：将酵母细胞加入蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；
步骤2：将沉淀物加入磷酸缓冲液(PBS，20mM，pH7.5)配置成待提取液，高压蒸汽处理45min，冷却至室温，经离心力4500g离心10min，反复清洗得到沉淀物；
步骤3：将沉淀物加入蒸馏水配置成悬浮液，加入甘露聚糖酶，采用1M盐酸与1M氢氧化钠将pH调为4.5，恒温酶解60min。冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液在100℃沸水浴进行高温灭酶活，在10000r/min转速下离心10min，水洗得到不溶物；
步骤5：将不溶物加入蒸馏水均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。
所述步骤1中的酵母细胞在蒸馏水中的浓度为15g/L，离心条件为离心力4500g离心10min。
所述步骤2中的磷酸缓冲液与沉淀物的浓度为12％，所述高压蒸汽条件为121℃。
所述步骤3中的沉淀物在蒸馏水中的物料比为1：30，所述甘露聚糖酶添加量为悬浮物质量的1％，所述恒温酶解反应的温度为55℃，所述高温灭酶活为煮沸处理5min。
所述步骤4不溶物与蒸馏水制备成1％(w/w)的菌悬液，超声提取条件，超声时间60min，超声功率600w，持续1s，间隔1s，探头直径为20mm。
所述步骤4中的透析的时间为48h，所用透析袋截留分子量为14000。
所述步骤4中的冷冻干燥包括-80℃预冷冻22h，-60℃冷冻干燥24h。
实施例3
一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将酵母细胞加入蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；
步骤2：将沉淀物加入磷酸缓冲液(PBS，20mM，pH7.5)配置成一定浓度待提取液，高压蒸汽处理30min，冷却至室温，经离心力4500g离心10min，反复清洗得到沉淀物；
步骤3：将沉淀物加入蒸馏水配置成悬浮液，加入1.5％甘露聚糖酶，pH调为6.0，恒温酶解90min。冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液进行高温灭酶活，在10000r/min转速下离心10min，水洗得到不溶物；
步骤5：将不溶物加入蒸馏水均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。
所述步骤1中的酵母细胞在蒸馏水中的浓度为15g/L，离心条件为离心力4500g离心10min。
所述步骤2中的磷酸缓冲液与沉淀物的浓度为15％，所述高压蒸汽条件为121℃。
所述步骤3中的沉淀物在蒸馏水中的物料比为1：50，所述甘露聚糖酶添加量为悬浮物质量的1.5％，所述恒温酶解反应的温度为60℃，所述高温灭酶活为煮沸处理5min。
所述步骤4中的不溶物与蒸馏水制备成1％(w/w)的菌悬液，超声提取条件，超声时间60min，超声功率600w，持续1s，间隔1s，探头直径为20mm。
所述步骤4中的透析的时间为48h，所用透析袋截留分子量为14000。
所述步骤4中的冷冻干燥包括-80℃预冷冻22h，-60℃冷冻干燥24h。
对比例1
一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将酵母细胞加入蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；
步骤2：将沉淀物配置成一定浓度的菌悬液，加入氯化钠，调节pH，在恒温水浴振荡器中诱导自溶24h；
步骤3：将提取液放置85℃水浴10min。灭酶活，冷却至室温后用去离子洗涤离心多次，以4500g离心10min，在室温下分离出残留的自溶细胞，得沉淀；
步骤5：将不溶物加入蒸馏水均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。
所述步骤1中的酵母细胞在蒸馏水中的浓度为15g/L，离心条件为离心力4500g离心10min。
所述步骤2中的菌悬液质量浓度为15％，氯化钠的加入量为菌悬液质量的为3％。采用1M盐酸与1M氢氧化钠将pH调节至5.0，55℃温度下自溶。
所述步骤2中的恒温水浴振荡器得转速为120rpm
所述步骤3不溶物与蒸馏水制备成1％(w/w)的菌悬液，超声提取条件，超声时间60min，超声功率600w，持续1s，间隔1s，探头直径为20mm。
所述步骤4中的透析的时间为48h，所用透析袋截留分子量为14000。
实施例1-3与对比例得到的酵母β-葡聚糖粉末中多糖的质量含量如表1所示。
实验方法：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，准确称取提取的样品20mg与500mL容量瓶中，加水至刻度，吸取1.0mL，补水至2.0mL,然后加入6％苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL,静置10min，摇匀，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0mL水按同样显色操作为空白，根据标准曲线计算出多糖含量。
Figure BDA0002557307100000071
c-根据标准曲线计算得到的样品溶液浓度(μg/mL)；
v-样品溶液体积(mL)；
m1-多糖提取物的质量(g)。
表1
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
品相 淡黄色粉末 淡黄色粉末 淡黄色粉末 淡黄色粉末
多糖含量(％) 85.7 88 89.6 83.7
时间(min) 110 165 180 1500

Claims (10)

1.一种用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)：将酵母细胞加入到蒸馏水中，搅拌均匀形成悬浮液，反复清洗，离心后得到沉淀物；
步骤2)：将沉淀物加入到磷酸缓冲液中配置成待提取液，加压蒸汽处理30-60min，冷却至室温，离心，反复清洗得到沉淀物；
步骤3)：将步骤2)得到的沉淀物加入到蒸馏水中配置成悬浮液，加入甘露聚糖酶，调节pH值，恒温酶解；冷却至室温后，抽滤除去酶颗粒，将过滤液进行升温灭酶活，离心、水洗，得到不溶物；
步骤4)：将不溶物加入到蒸馏水中均匀搅拌形成悬浮液，超声提取1-2h，透析后冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖粉末。
2.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤1)中的悬浮液中酵母细胞的浓度为15-45g/L。
3.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤1)中的离心条件为：离心力4500g，离心时间10min。
4.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤2)中磷酸缓冲液采用PBS，其浓度为20mM，pH值为7.5。
5.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤2)中的待提取液中沉淀物的浓度为100-190g/L。
6.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤2)中加压蒸汽处理的温度为90-121℃。
7.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤3)中沉淀物与蒸馏水的质量比为1：20；甘露聚糖酶的加入量为悬浮物质量的1-10％。
8.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤3)中加入甘露聚糖酶后，将悬浮液的pH值调至6.0；恒温酶解的温度为50-70℃，时间为60min；升温灭酶活具体为煮沸5min；离心的转速为10000r/min，时间为10min。
9.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤4)中不溶物的质量为蒸馏水质量的5％。
10.如权利要求1所述的用于酵母β-葡聚糖提取的预处理方法，其特征在于，所述步骤4)中超声提取的工艺参数为：超声功率600～800w，持续1s，间隔1s，探头直径25mm；透析的时间为24～48h，所用透析袋截留分子量为14000；冷冻干燥具体为：先-80℃预冷冻22h，然后-60℃冷冻干燥12-24h。
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