具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述,但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明,其中也公开了其具体实施例方式,对本领域的技术人员而言,在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
参考例1
合成路线:
将化合物A-1(500.0mg,4.42mmol)和三乙胺(1.12g,11.05mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中,加入二碳酸二叔丁酯(1.01g,4.64mmol),反应液在10℃搅拌16小时。反应液用饱和氯化铵溶液(20mL)洗涤两次,无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用石油醚(3mL)打浆得化合物A-2。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ4.05-4.15(m,1H),3.50-3.62(m,4H),2.40-2.60(m,2H),2.04(d, J=7.2Hz,1H),1.52-1.60(m,1H),1.47(s,9H)1.30-1.40(m,1H)。
实施例1
合成路线:
第一步
将金属钠(1.84g,80.15mmol)加入到无水甲醇(100mL),氮气保护下于30℃搅拌30分钟。反应液冷却到0℃,加入化合物1-1(10g,53.44mmol),反应液在70℃搅拌16小时。反应液冷却到0℃,倒入1N稀盐酸(100mL),加水(200mL)稀释,用二氯甲烷萃取(200mLx2)。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯: 石油醚=1:8),得到化合物1-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,J= 12.4Hz,1H),6.15(d,J=6.8Hz,1H),5.69(brs,2H),3.87(s,3H),3.84(s,3H)。 LC-MS:m/z=199.9[M+H]+。
第二步
在90℃,将化合物1-2(5.00g,25.10mmol)的二氯乙烷(100mL)溶液缓慢滴加到间氯过氧苯甲酸(85%,20.39g,100.41mmol)的二氯乙烷(200mL)溶液中。反应液在90℃搅拌2小时。反应液冷却到0℃,加饱和亚硫酸钠水溶液 (300mL)淬灭,混合物用二氯甲烷萃取(300mL x 2)。合并有机相,依次用饱和碳酸氢钠溶液(300mLx2),水(300mLx2),饱和食盐水(300mLx2)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=1:8),得到化合物1-3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.47(d,J=10.4Hz,1H),7.43(d,J=7.2Hz,1H),3.98(s,3H),3.89(s,3H)。
第三步
将化合物1-3(730.0mg,3.19mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL),加入碳酸铯(2.08g,6.37mmol)和化合物A-2(679.0mg,3.19mmol),反应液加热至 65℃,搅拌3小时。反应液冷却到20℃,加入水(30.0mL)稀释,用乙酸乙酯(30mLx2)萃取。合并有机相,依次用水(40mL x 2),饱和食盐水(40mL x 2) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=8:1),得到化合物1-4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(s,1H),7.03(s,1H),4.54(t,J=5.6Hz,1H),3.92(s,3H),3.89(s, 3H),3.89(td,J1=12.0Hz,J2=3.2Hz,2H),3.51(t,J=11.2Hz,2H),2.80-2.95 (m,2H),1.75-1.85(m,1H),1.55-1.65(m,1H),1.47(s,9H)。LC-MS:m/z=445.2 [M+Na]+。
第四步
将化合物1-4(740.0mg,1.75mmol)溶于甲醇(100mL)中,加入湿钯碳 (10%,150mg),反应液在20℃,氢气氛围下(氢气球)搅拌0.5小时。反应液经硅藻土过滤,滤液减压浓缩,得到化合物1-5。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ7.29(s,1H),6.12(s,1H),4.30-4.40(m,1H),3.83(s,3H),3.81(s,3H), 3.55-3.65(m,4H),2.70-2.85(m,2H),1.65-1.75(m,1H),1.50-1.55(m,1H),1.47 (s,9H)。
第五步
将化合物1-5(687.0mg,1.75mmol)和醋酸氨(675.0mg,8.75mmol)加入原甲酸三甲酯(17.09g,161.02mmol)中,反应液加热至70℃,搅拌10小时。反应液冷却到30℃,减压浓缩。残余物加水(10mL)打浆,过滤,滤饼干燥得到化合物1-6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.08(brs,1H),7.99(s,1H), 7.47(s,1H),7.15(s,1H),4.65(t,J=5.6Hz,1H),3.89(s,3H),3.45-3.60(m, 2H),3.10-3.20(m,2H),2.75-2.90(m,2H),1.75-1.85(m,1H),1.40-1.50(m,1H), 1.40(s,9H)。LC-MS:m/z=410.1[M+Na]+。
第六步
将化合物1-6(640.0mg,1.65mmol)加入氯化氢的二氧六环溶液(4N,10 mL),反应液在0℃下搅拌0.4小时。减压浓缩得到合物1-7的盐酸盐。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.72(brs,1H),9.02(brs,1H),8.34(s,1H),7.56(s,1H), 7.27(s,1H),4.76(t,J=6.0Hz,1H),3.96(s,3H),3.35-3.45(m,2H),3.20-3.35 (m,2H),2.89-2.95(m,2H),2.01-2.08(m,1H),1.90-2.00(m,1H)。
第七步
在0℃,将1-7的盐酸盐(640.0mg,1.98mmol),三乙胺(2.00g,19.77mmol) 溶入二氯甲烷(10mL)中,滴加三氟乙酸酐(830.0mg,3.95mmol)。反应液在 20℃下搅拌2小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭,用二氯甲烷(10mL x 2)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物1-8。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.10(s,1H),8.00(s, 1H),7.52(s,1H),7.15(s,1H),4.84(t,J=5.6Hz,1H),3.90-4.00(m,1H),3.87 (s,3H),3.65-3.85(m,2H),3.45-3.55(m,1H),2.90-3.00(m,2H),1.90-2.00(m, 1H),1.50-1.60(m,1H)。
第八步
将化合物1-8(270.0mg,704.37μmol)溶于氯化亚砜(13.1mL,180.28 mmol),加入N,N-二甲基甲酰胺(26.0μL,338.10μmol)。反应液加热至80℃,搅拌1小时。反应液减压浓缩,剩余物室温下加入3,4-二氯-2-氟苯胺(392.0mg, 2.18mmol)的异丙醇(10mL)溶液,加热至90℃,搅拌1小时。反应液冷却到20℃,加入饱和碳酸氢钠溶液(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 2)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=2:1),得到化合物1-9。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.68(s,1H),8.41(s,1H),7.80(s,1H),7.60(s,2H),7.24(s,1H), 4.82(t,J=6.0Hz,1H),3.95-4.05(m,1H),3.91(s,3H),3.70-3.95(m,2H), 3.50-3.60(m,1H),3.05-3.15(m,2H),1.85-1.95(m,1H),1.55-1.65(m,1H)。 LC-MS:m/z=545.0[M+H]+。
第九步
将化合物1-9(300.0mg,551.14umol)溶于甲醇(15mL)中,加入碳酸钾 (380.9mg,2.76mmol)。反应液在40℃下搅拌14个小时。减压浓缩,加水(10 mL)稀释,用乙酸乙酯(40mLx 4)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物1-10。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s, 1H),8.41(s,2H),7.76(s,1H),7.59(s,2H),7.29(s,1H),4.73(t,J=6.0Hz,1H), 3.99(s,3H),3.20-3.30(m,4H),2.95-3.05(m,2H),1.95-2.05(m,1H),1.75-1.85 (m,1H)。LC-MS:m/z=449.1[M+H]+。
第十步
在0℃下,将化合物1-10(240.0mg,534.16μmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水(6mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(134.6mg,1.60mmol)后,缓慢滴加丙烯酰氯(48.4mg,534.16μmol)。反应液在0℃继续搅拌0.5小时。加入甲醇(1mL) 淬灭,反应液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1),得到化合物实施例1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),8.43 (t,J=8.8Hz,1H),7.34-7.45(m,2H),7.10(s,1H),6.60(dd,J1=16.8Hz,J2= 9.6Hz,1H),5.71(dd,J1=16.8Hz,J2=2.0,Hz,1H),6.60(dd,J1=9.6Hz,J2=2.0Hz,1H),4.66(t,J=5.6Hz,1H),3.96(s,3H),3.85-3.95(m,2H),3.65-3.75 (m,2H),2.95-3.05(m,2H),1.85-1.95(m,1H),1.55-1.65(m,1H)。LC-MS:m/z= 503.1[M+H]+。
实施例2
合成路线:
第一步
参照实施例1第八步得到化合物2-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.79(s,1H),8.44(s,1H),8.37(s,1H),7.60-7.70(m,1H),7.45-7.55(m, 1H),7.35(s,1H),4.95(t,J=5.6Hz,1H),4.00-4.05(m,1H),3.97(s,3H), 3.70-3.90(m,3H),3.10-3.20(m,2H),1.80-1.90(m,1H),1.61(d,J=10.4Hz, 1H)。LC-MS:m/z=529.1[M+H]+。
第二步
将化合物2-2(70.0mg,132.61μmol)溶于甲醇(2mL)中,加入碳酸钾(91.6 mg,663.04μmol)。反应液在50℃搅拌14个小时。反应液减压浓缩,加水(10 mL)稀释,用乙酸乙酯(20mL x 4)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物2-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s, 1H),8.39(s,2H),7.79(s,1H),7.50-7.60(m,1H),7.38-7.48(m,1H),7.29(s, 1H),4.74(t,J=6.0Hz,1H),3.99(s,3H),3.40-3.50(m,4H),2.95-3.05(m,2H), 1.98(d,J=11.2Hz,1H),1.80-1.90(m,1H)。LC-MS:m/z=433.1[M+H]+。
第三步
参照实施例1第十步得到化合物实施例2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.66(s,1H),8.37(s,1H),7.79(s,1H),7.55-7.65(m,1H),7.41(t,J=8.4Hz, 1H),7.22(s,1H),6.75(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.16(d,J=16.8,Hz, 1H),5.68(d,J=9.6Hz,1H),4.65-4.75(m,1H),3.90-3.95(m,1H),3.90(s,3H), 3.65-3.85(m,2H),3.45-3.55(m,1H),3.02-3.12(m,2H),1.75-1.85(m,1H),1.51 (d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=487.0[M+H]+.
实施例3
合成路线:
第一步
参照实施例1第八步得到化合物3-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.45(s,1H),8.87(s,1H),8.35(s,1H),8.01-8.07(m,1H),7.70-7.80(m,1H), 7.57(t,J=8.8Hz,1H),7.31(s,1H),4.98(t,J=5.6Hz,1H),3.96-4.44(m,1H), 3.96(s,3H),3.70-3.85(m,2H),3.50-3.55(m,1H),1.80-1.90(m,1H),1.62(d,J =10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=511.1[M+H]+。
第二步
参照实施例2第二步得到化合物3-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.60(s,1H),8.50(s,1H),8.05-8.12(m,1H),7.70-7.85(m,2H),7.46(t,J=9.2 Hz,1H),7.26(s,1H),4.75(t,J=5.6Hz,1H),3.98(s,3H),3.15-3.30(m,2H), 2.95-3.10(m,2H),2.88-2.95(m,2H),1.90-2.00(m,1H),1.70-1.80(m,1H)。 LC-MS:m/z=415.1[M+H]+。
第三步
在0℃下,将化合物3-3(40.0mg,96.42μmol)溶于四氢呋喃(4mL)和水(4 mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(24.3mg,289.25μmol),缓慢滴加丙烯酰氯 (10.57mg,115.70μmol)。反应液在0℃继续搅拌0.5小时。反应液加入甲醇 (1mL)淬灭,反应液用乙酸乙酯(20mL x2)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1)得到化合物实施例3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.59(s,1H),8.49(s,1H),8.08-8.12(m,1H),7.75-7.85(m,2H),7.46(t,J=9.2 Hz,1H),7.22(s,1H),6.74(dd,J1=16.4Hz,J2=10.0Hz,1H),6.17(d,J=12.0 Hz,1H),5.69(d,J=10.0Hz,1H),4.73(t,J=5.6,Hz,1H),3.95-4.00(m, 1H),3.89(s,3H),3.65-3.80(m,2H),3.40-3.50(m,1H),3.05-3.10(m,2H), 1.75-1.90(m,1H),1.51(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=469.1[M+H]+。
实施例4
合成路线:
第一步
参照实施例1第八步得到化合物4-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.50(s,1H),8.94(s,1H),8.47(s,1H),8.39(d,J=2.0Hz 1H),8.10-8.15(m, 1H),8.05-8.10(m,1H),7.35(s,1H),5.06(t,J=5.6Hz,1H),3.97(s,3H), 3.70-3.90(m,4H),3.10-3.20(m,2H),1.80-1.90(m,1H),1.61(d,J=10.4Hz, 1H)。LC-MS:m/z=518.1[M+H]+。
第二步
参照实施例1第九步得到化合物4-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.90(s,1H),8.64(s,1H),8.37(s,1H),8.05-8.15(m,1H),7.90-8.00(m,1H), 7.72(s,1H),7.30(s,1H),4.70-4.80(m,1H),3.99(s,3H),3.02-3.10(m,2H), 2.75-2.85(m,4H),1.93(d,J=9.6Hz,1H),1.60-1.70(m,1H)。LC-MS:m/z= 422.1[M+H]+。
第三步
参照实施例3第三步得到化合物实施例4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.91(s,1H),8.65(s,1H),8.39(s,1H),8.05-8.15(m,1H),7.92-8.00(m,1H), 7.85(s,1H),7.28(s,1H),6.74(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1= 16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.60(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.77(t,J=5.6 Hz,1H),3.92(s,3H),3.85-3.90(m,1H),3.65-3.80(m,2H),3.40-3.50(m,1H), 3.00-3.10(m,2H),1.80-1.90(m,1H),1.52(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z= 476.0[M+H]+。
实施例5
合成路线:
第一步
参照实施例1第八步得到化合物5-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.92(s,1H),8.87(s,1H),8.41(s,1H),7.65-7.75(m,1H),7.50-7.65(m,1H), 7.35-7.45(m,2H),4.97(t,J=5.6Hz,1H),3.98-4.00(m,1H),3.98(s,3H), 3.70-3.90(m,3H),3.10-3.20(m,2H),1.80-1.90(m,1H),1.62(d,J=10.0Hz, 1H)。LC-MS:m/z=511.2[M+H]+。
第二步
参照实施例1第九步得到化合物5-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.87(s,1H),8.40(s,1H),7.85(s,1H),7.45-7.60(m,1H),7.20-7.40(m,2H), 4.60(t,J=5.6Hz1H),3.99(s,3H),3.30-3.50(m,4H),3.00-3.15(m,2H), 2.00-2.10(m,1H),1.80-1.90(m,1H)。LC-MS:m/z=415.1[M+H]+。
第三步
参照实施例3第三步得到化合物实施例5。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.67(s,1H),8.38(s,1H),7.76(s,1H),7.50-7.60(m,2H),7.25-7.35(m,1H), 7.22(s,1H),6.75(dd,J1=16.4,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1=16.4Hz,J2=2.0 Hz,1H),5.69(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.71(t,J=5.6Hz,1H), 3.95-4.00(m,1H),3.92(s,3H),3.65-3.80(m,2H),3.42-3.50(m,1H),3.00-3.10 (m,2H),1.75-1.85(m,1H),1.52(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=469.0 [M+H]+。
实施例6
合成路线:
第一步
参照实施例1第八步得到化合物6-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.77(s,1H),8.56(s,1H),8.27(s,1H),7.90-7.80(m,2H),7.55-7.65(m,1H), 7.25(s,1H),4.90(t,J=5.6Hz,1H),3.92-4.00(m,1H),3.95(s,3H),3.80-3.90 (m,1H),3.70-3.80(m,1H),3.50-3.60(m,1H),3.00-3.10(m,2H),1.80-1.90(m, 1H),1.60(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=577.1[M+H]+。
第二步
参照实施例2第二步得到化合物6-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 10.01(s,1H),8.57(s,1H),8.33(s,1H),8.00-8.10(m,2H),7.55-7.70(m,1H), 7.32(s,1H),4.80-4.90(m,1H),4.00(s,3H),3.00-3.20(m,4H),1.80-2.10(m, 2H),1.10-1.30(m,2H)。LC-MS:m/z=481.1[M+H]+。
第三步
参照实施例1第十步得到化合物实施例6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.68(s,1H),8.54(s,1H),8.23(s,1H),7.90-8.00(m,1H),7.81(s,1H), 7.55-7.65(m,1H),7.24(s,1H),6.65-6.80(m,1H),6.17(d,J=15.2Hz,1H), 5.68(d,J=8.8Hz,1H),4.70-4.80(m,1H),3.90(s,3H),3.80-3.90(m,1H), 3.50-3.80(m,3H),3.00-3.10(m,2H),1.80-1.90(m,1H),1.45-1.55(m,1H)。 LC-MS:m/z=535.1[M+H]+。
实施例7
合成路线:
第一步
将化合物B-1(2.60g,11.54mmol)溶于乙醇(30mL),加入硼氢化钠(1.09g,28.85mmol),反应液在30℃搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(30mL)淬灭,用二氯甲烷(40mLx 2)萃取。合并有机相,用饱和食盐水(40mL x 2)洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤,滤液并减压浓缩得到化合物B-2。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ4.00-4.32(m,3H),2.10-2.20(m,1H),1.90-2.00(m,3H),1.60-1.90(m, 4H),1.40-1.50(m,9H)。
第二步
将化合物B-2(2.60g,11.44mmol)和三乙胺(3.2mL,22.88mmol),4-二甲氨基吡啶(1.68g,13.73mmol)溶于二氯甲烷(60mL)中,加入对甲基苯磺酰氯(2.62g,13.73mmol),反应液在25℃搅拌16小时。加入饱和氯化铵水溶液(60 mL x 3)淬灭,有机相用饱和食盐水(60mL)洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物B-3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=8.0 Hz,2H),7.33(d,J=8.0Hz,2H),4.75-4.90(m,1H),4.05-4.25(m,2H),2.45(s, 3H),1.50-1.90(m,4H),1.85-2.20(m,4H),1.30-1.45(s,9H)。LC-MS:m/z= 404.1[M+Na]+。
第三步
将化合物7-1(2.00g,5.65mmol)和碳酸钾(1.56g,11.29mmol)加入N,N- 二甲基乙酰胺(20mL)中,再加入化合物B-3(4.20g,8.47mmol)。反应加热至 70℃,搅拌16小时。反应液冷却到30℃,倒入水(30mL)中,用乙酸乙酯(20 mL x 3)萃取。合并有机相,依次用水(30mL x 3)和饱和食盐水(30mL x 3)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=1:1),得到化合物7-2和8-1。
化合物7-2:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(s,1H),8.42(t,J=8.4Hz, 1H),7.26-7.40(m,3H),6.96(s,1H),4.80-4.90(m,1H),4.15-4.35(m,2H),4.00 (s,3H),2.10-2.35(m,4H),1.90-2.10(m,4H),1.48(s,9H)。根据二维核磁NOE 鉴定:哌啶环与氧原子相连碳上的单氢与桥环上的亚甲基氢未见相关,确定为顺式结构。LC-MS:m/z 563.2[M+H]+。
化合物8-1:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),8.53(t,J=8.4Hz, 1H),7.26-7.40(m,3H),7.21(s,1H),4.70-4.80(m,1H),4.20-4.40(m,2H),4.01 (s,3H),2.10-2.20(m,4H),1.85-2.00(m,2H),1.65-1.80(m,2H),1.50(s,9H)。根据二维核磁NOE鉴定:哌啶环与氧原子相连碳上的单氢与桥环上的亚甲基氢哪个相关,确定为反式结构。LC-MS:m/z563.2[M+H]+。
第四步
将化合物7-2(400.0mg,709.92μmol)溶于氯化氢的二氧六环溶液(4N,6 mL)中,反应液在0℃反应0.3小时。反应液减压浓缩,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯(10mL)洗涤。水相用碳酸钾固体调整pH=10,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(甲醇:二氯甲烷=1:10),得到化合物7-3。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.96(s,1H),8.39(s,1H),7.96(s,1H),7.55-7.65(m, 2H),7.26(s,1H),4.95-5.00(m,1H),3.90-4.05(m,5H),2.45-2.50(m,2H), 2.25-2.35(m,2H),2.10-2.20(m,2H),1.90-2.05(m,2H)。
第五步
在0℃下将化合物7-3(230.0mg,496.41μmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水(6 mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(125.1mg,1.49mmol)后,缓慢滴入丙烯酰氯 (35.9mg,397.12μmol)。反应液在0℃下,继续搅拌0.5小时。加入甲醇(1mL) 淬灭,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10: 1),得到化合物实施例7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.39(s, 1H),7.74(s,1H),7.50-7.60(m,2H),7.26(s,1H),6.75(dd,J1=16.4Hz,J2=10.0 Hz,1H),6.19(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.70(dd,J1=10.0Hz,J2=2.4 Hz,1H),4.88-4.90(m,1H),4.50-4.61(m,2H),3.97(s,3H),2.20-2.30(m, 2H),1.95-2.15(m,5H),1.80-1.95(m,1H)。LC-MS:m/z=517.1[M+H]+。
实施例8
合成路线:
第一步
参考实施例7第四步得到化合物8-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 10.13(s,1H),8.39(s,1H),8.10(s,1H),7.55-7.70(m,2H),7.23(s,1H), 4.90-5.00(m,1H),3.90-4.05(m,2H),3.94(s,3H),2.30-2.40(m,2H),2.10-2.20 (m,2H),1.80-2.00(m,4H)。
第二步
参考实施例7第五步得到化合物实施例8。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.67(s,1H),8.39(s,1H),7.80(s,1H),7.55-7.70(m,2H),7.26(s,1H),6.77 (dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.23(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.72 (dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.90-5.10(m,1H),4.55-4.60(m,2H),3.92(s, 3H),2.20-2.40(m,2H),1.80-2.10(m,4H),1.66(t,J=10.4Hz,1H),1.50(t,J= 10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=517.1[M+H]+。
实施例9
合成路线:
第一步
将化合物A-2(2.00g,9.38mmol)溶于二氯甲烷(50mL),加入戴斯-马丁氧化剂(4.77g,11.25mmol),反应液在25℃搅拌2小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)淬灭,用二氯甲烷萃取(30mL x 2)。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩。剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯: 石油醚=1:4),得到化合物C-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.95-4.10(m, 2H),3.85-3.95(m,2H),3.10-3.20(m,2H),2.10-2.20(m,1H),1.75-1.80(m,1H), 1.45(s,9H)。
第二步
将化合物C-2(1.70g,8.05mmol)溶于甲醇(20mL)中,加入盐酸羟胺(671.0mg,9.66mmol)和碳酸钠(511.7mg,4.83mmol),反应液在25℃搅拌16 小时。反应液减压浓缩,加入二氯甲烷(30mL)稀释,用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物C-3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40-7.50(m,1H),3.70-3.90(m,4H),3.45-3.60(m, 1H),3.05-3.20(m,1H),2.10-2.20(m,1H),1.60-1.65(m,1H),1.46(s,9H)。
第三步
将化合物C-3(2.00g,8.84mmol)溶于甲醇(20mL),加入雷尼镍(0.50g),反应液在20℃,氢气氛围下(氢气球)搅拌16小时。反应液经过硅藻土过滤,滤液减压浓缩,干燥得到化合物C-4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.85-4.10(m,1H),3.45-3.75(m,4H),2.60-2.80(m,2H),1.85-1.95(m, 1H),1.50-1.60(m,1H),1.47(s,9H)。
第四步
将化合物9-1(900.0mg,3.93mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL),加入碳酸钾(1.09g,7.85mmol)和化合物C-4(1.50g,7.07mmol)。反应液在 90℃搅拌16小时。反应液冷却到20℃,加水(30mL)稀释,用乙酸乙酯 (30mLx2)萃取。合并有机相,依次用水(40mL x2),饱和食盐水(40mL x 2) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩。剩余物经制备薄层层析板分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:1),得到化合物9-2和10-1。
化合物10-1:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(s,1H),6.27(s,1H),5.36 (d,J=4Hz,1H),3.97(s,3H),3.93(s,3H),3.80-3.90(m,1H),3.55-3.70(m, 2H),3.45-3.53(m,1H),3.35-3.45(m,1H),2.65-2.85(m,2H),1.90-2.00(m,1H), 1.45-1.55(m,1H),1.51(s,9H)。根据二维核磁NOE鉴定:哌啶环与芳氨相连碳上的单氢与哌啶环氨基边上亚甲基强相关,而与桥环上的亚甲基氢未见相关异面,确定为顺式结构。LC-MS:m/z=444.2[M+Na]+。
化合物9-2:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47(s,1H),6.56(s,1H), 5.15-5.25(m,1H),3.97(s,3H),3.91(s,3H),3.65-3.80(m,4H),3.40-3.50(m, 1H),2.45-2.60(m,2H),2.40-2.45(m,1H),1.50-1.55(m,1H),1.51(s,9H)。LC-MS:m/z=444.2[M+Na]+。根据化合物10-2结构鉴定结果推断化合物9-2 结构。
第五步
将化合物9-2(580.0mg,1.38mmol)溶于甲醇(100mL)中,加入湿钯碳 (10%,150.0mg),反应液在20℃,氢气的氛围下(氢气球)搅拌0.5小时。反应液经硅藻土过滤,滤液减压浓缩,干燥得到化合物9-3。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.04(s,1H),6.10(s,1H),3.83(s,3H),3.82(s,3H),3.70-3.80(m,1H), 3.40-3.60(m,4H),2.60-2.70(m,2H),1.85-1.95(m,1H),1.45(s,9H),1.40-1.45 (m,1H)。
第六步
将化合物9-3(500.0mg,1.28mmol)和醋酸铵(984.6mg,12.77mmol)加入原甲酸三甲酯(12.47g,117.48mmol),反应液在70℃搅拌10小时。反应液冷却到20℃,减压浓缩,剩余物加入水(10mL)打浆,过滤,干燥得到化合物 9-4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.87(s,1H),7.06(s,1H),7.04(s,1H), 5.18(d,J=5.2Hz,1H),3.94(s,3H),3.75-3.80(m,1H),3.35-3.55(m,4H), 2.65-2.75(m,2H),1.92-2.00(m,1H),1.40(s,9H),1.30-1.40(m,1H)。LC-MS:m/z=387.2[M+Na]+。
第七步
将化合物9-4(400.0mg,1.04mmol)加入氯化氢的二氧六环溶液(4N,10 mL),反应液在0℃搅拌0.4小时。反应液减压浓缩,得到化合物9-5的盐酸盐。LC-MS:m/z=287.0[M+H]+。
第八步
在0℃,将9-5的盐酸盐(340.0mg,1.19mmol),三乙胺(1.7mL,11.87mmol) 溶入二氯甲烷(10mL),滴加三氟乙酸酐(498.8mg,2.37mmol),反应液在20℃搅拌1小时。减压浓缩,剩余物加水(40mL)打浆,过滤,干燥得到化合物 9-6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.93(s,1H),7.87(s,1H),7.02-7.88(m, 2H),4.95-5.05(m,1H),3.98(s,3H),3.80-3.95(m,3H),3.60-3.70(m,1H), 3.51-3.60(m,1H),2.80-2.90(m,2H),2.00-2.10(m,1H),1.52(d,J=10.0Hz, 1H)。LC-MS:m/z=383.1[M+H]+。
第九步
将化合物9-6(280.0mg,732.34μmol)溶于三氯氧磷(20mL,215.22mmol) 中,加入N,N二甲基甲酰胺(53.5mg,732.34μmol),反应液在100℃搅拌5小时。减压浓缩,剩余物加入3,4-二氯-2-氟苯胺(263.65mg,1.46mmol)的异丙醇(10mL)溶液。反应液在90℃搅拌1小时。反应液冷却到20℃,加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 2)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=2:1),得到化合物9-7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.46(s,1H),8.29(s,1H),7.52-7.65(m,2H),7.12-7.20(m,2H),5.64(d,J=3.6 Hz,1H),3.98(s,3H),3.82-3.98(m,3H),3.65-3.75(m,1H),3.55-3.60(m,1H), 2.95-3.05(m,2H),2.00-2.10(m,1H),1.56(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z= 544.2[M+H]+。
第十步
将化合物9-7(290.0mg,533.74μmol)溶于甲醇(15mL)中,加入碳酸钾 (369.0mg,2.67mmol)。反应液在55℃搅拌14个小时。反应液减压浓缩,加入水(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(20mL x 4)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,得到化合物9-8。1HNMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.50(s,1H),8.28(s,1H),7.50-7.65(m,2H),7.16(s,1H),7.14(s,1H),5.91(d, J=4.8Hz,1H),4.01(s,3H),3.85-3.95(m,1H),3.15-3.20(m,2H),2.80-2.90(m, 2H),1.90-2.00(m,2H),1.70-1.80(m,1H),1.10(d,J=6.4Hz,1H)。LC-MS:m/z =448.2[M+H]+。
第十一步
在0℃下,将化合物9-8(200.0mg,446.11μmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水 (6mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(112.4mg,1.34mmol),缓慢滴入丙烯酰氯 (36.3mg,401.50μmol)。反应液在0℃继续搅拌0.5小时。加入MeOH(1mL) 淬灭,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10: 1),得到化合物实施例9。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.28(s, 1H),7.55-7.65(m,2H),7.17(s,1H),7.12(s,1H),6.75(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.68(dd,J1=10.4Hz,J2= 2.4Hz,1H),5.40(d,J=4.8Hz,1H),3.96(s,3H),3.80-3.90(m,2H),3.65-3.75 (m,2H),3.45-3.52(m,1H),2.90-3.05(m,2H),1.90-2.00(m,1H),1.47(d,J= 9.6Hz,1H)。LC-MS:m/z=502.1[M+H]+。
实施例10
合成路线:
第一步
参考实施例9第五步得到化合物10-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.78 (s,1H),6.13(s,1H),3.86(s,3H),3.84(s,3H),3.60-3.80(m,4H),3.32-3.36(m, 1H),2.50-2.60(m,1H),2.40-2.48(m,1H),2.30-2.40(m,1H),1.51(s,9H), 1.40-1.45(m,1H)。
第二步
参考实施例9第六步得到化合物10-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85(s,1H),7.05(s,1H),6.72(s,1H),5.95(d,J=3.2Hz,1H),3.97(s,3H), 3.55-3.80(m,4H),3.25-3.30(m,1H),2.51-2.60(m,2H),1.75-1.80(m,1H),1.46 (s,9H),1.35-1.40(m,1H)。LC-MS:m/z=387.2[M+Na]+。
第三步
参考实施例9第七步得到化合物10-4的盐酸盐。LC-MS:m/z=287.0 [M+H]+。
第四步
参考实施例9第八步得到化合物10-5。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.92(s,1H),7.85(d,J=3.2Hz,1H),7.06(s,1H),6.76(s,1H),6.02(d,J=3.2 Hz,1H),4.05-4.15(m,2H),3.98(s,3H),3.85-3.95(m,1H),3.75-3.80(m,1H), 3.45-3.50(m,1H),2.55-2.70(m,3H),1.50-1.60(m,1H)。LC-MS:m/z=383.1 [M+H]+。
第五步
参考实施例9第九步得到化合物10-6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.35(s,1H),8.29(s,1H),7.60-7.70(m,1H),7.55-7.60(m,1H),7.15(s,1H), 6.81(s,1H),6.18(d,J=3.6Hz,1H),4.10-4.25(m,2H),4.03(s,3H),3.80-4.00 (m,2H),3.50-3.63(m,1H),2.65-2.75(m,2H),2.55-2.60(m,1H),1.50-1.56(m, 1H)。LC-MS:m/z=544.2[M+H]+。
第六步
参考实施例9第十步得到化合物10-7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.69(s,1H),8.26(s,1H),7.50-7.65(m,2H),7.12(s,1H),6.95(d,J=8.0Hz, 1H),4.10-4.20(m,1H),4.01(s,3H),3.60-3.70(m,2H),3.20-3.30(m,2H), 2.40-2.50(m,3H),1.60-1.70(m,1H)。LC-MS:m/z=448.2[M+H]+。
第七步
参考实施例9第十一步得到化合物实施例10。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.38(s,1H),8.27(s,1H),7.55-7.65(m,2H),7.14(s,1H),6.75-6.85 (m,2H),6.18(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H),6.14(d,J1=4.0Hz,1H),5.73 (dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.10-4.20(m,1H),4.02(s,3H),3.85-3.95(m, 2H),3.75-3.80(m,1H),3.50-3.55(m,1H),2.50-2.65(m,3H),1.40-1.50(m, 1H)。LC-MS:m/z=502.1[M+H]+。
实施例11
合成路线:
第一步
将化合物E-1(500.0mg,2.79mmol)加入到二氯甲烷(6mL)中,在氮气保护下加入化合物E-2(475.7mg,5.59mmol),反应液在25℃搅拌2小时。反应液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:1),得到化合物E-3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.03-6.95(m,1H),5.89-6.03(m, 1H),3.72(s,3H),3.09(dd,J1=6.4Hz,J2=1.6Hz,2H),2.20-2.50(m,4H), 1.63-1.56(m,4H),1.38-1.46(m,2H)。LC-MS:m/z=184.0[M+H]+。
第二步
向化合物E-3(367.0mg,2.00mmol)溶于四氢呋喃(10mL)和水(10mL)得到的混合溶液中,加入氢氧化锂一水合物(168.1mg,4.01mmol),反应液在 25℃搅拌1小时。加入乙酸乙酯(10mL)萃取,水相加稀盐酸调节pH=3,冻干得到化合物E-4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.28(brs, 1H),7.10-6.86(m,1H),6.17(d,J=15.6Hz,1H),3.85(d,J=6.8Hz,2H),3.31-3.20(m,4H)1.61-1.89(m,6H)。LC-MS:m/z=170.2[M+H]+。
第三步
将化合物1-10(50.0mg,111.28μmol),HATU(63.5mg,166.92μmol)和 DIEA(36.0mg,278.21μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(8mL)中,加入化合物 E-4(56.5mg,333.85μmol),反应液在25℃搅拌16小时。反应液减压浓缩,剩余物用制备高效液相色谱法(碱性)分离纯化,得到化合物实施例11。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.69(brs,1H),8.39(s,1H),7.74(s,1H),7.60(s, 1H),7.23(s,1H),6.45-6.71(m,2H),4.69(s,1H),3.80-4.00(m,4H),3.62-3.80 (m,3H),2.90-3.10(m,4H),2.25-2.35(m,3H),1.78-1.85(m,1H),1.33-1.52(m,7H)。LC-MS:m/z=600.2[M+H]+。
实施例12
合成路线:
第一步
将化合物F-1(1.00g,5.59mmol)和DIEA(1.44g,11.17mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中,滴加二甲胺水溶液(33%,1.53g,11.17mmol),反应液在70℃搅拌1小时。反应液降至室温,加水(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(15mL x 2) 萃取。合并有机相,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(石油醚: 乙酸乙酯=0:1),得到化合物F-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00-6.80(m, 1H),6.00-5.85(m,1H),3.67(s,3H),3.07-2.93(m,2H),2.18(s,6H)。
第二步
参考实施例11第二步得到化合物F-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.42(brs,1H),6.78-6.94(m,1H),6.19(d,J=15.6Hz,1H),3.87-3.91(m,2H), 2.73-2.60(m,6H)。
第三步
参考实施例11第三步得到化合物实施例12。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ8.35(s,1H),7.73(s,1H),7.51-7.63(m,2H),7.20(s,1H),6.59-6.69 (m,1H),6.47-6.56(m,1H),4.68(t,J=5.6Hz,1H),3.84-3.94(m,4H), 3.64-3.78(m,2H),3.50-3.45(m,1H),2.98-3.10(m,4H),2.14(s,6H),1.74-1.91 (m,1H),1.50(d,J=10.0Hz,1H)。
实施例13
合成路线:
第一步
将化合物1-9(6.80g,10.62mmol)加入到吡啶盐酸盐(57.94g,501.35 mmol)中,反应液在180-185℃搅拌1小时。反应液降至室温,加水(30mL) 和乙酸乙酯(30mL)在20-25℃打浆1小时,过滤,干燥得到化合物13-2。 LC-MS:m/z530.9[M+H]+。
第二步
将化合物13-2(500.0mg,941.11μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中,加入1,3-二氧戊环-2-酮(165.8mg,1.88mmol)和氟化钾(54.7mg,941.11 μmol)。反应液在110℃搅拌18小时,补加氟化钾(164.0mg,2.82mmol)和1, 3-二氧戊环-2-酮(414.4mg,4.71mmol),反应液在110℃下搅拌3小时。减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=15:1),得到化合物13-3。LC-MS:m/z=575.2[M+H]+。
第三步
将化合物13-3(170.0mg,295.48μmol)溶到甲醇(10mL)中,加入碳酸钾 (163.4mg,1.18mmol),反应液在80℃搅拌3小时。减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=15:1),得到化合物13-4。LC-MS: m/z=479.2[M+H]+。
第四步
参考实施例1第十步得到化合物实施例13。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.69(s,1H),8.39(s,1H),7.78(s,1H),7.64-7.57(m,2H),7.24(s, 1H),6.74(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.16(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.68(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.84(t,J=5.2Hz,1H),4.73-4.71 (m,1H),4.11(t,J=5.2Hz,2H),4.00-3.90(m,1H),3.76-3.70(m,4H),3.49(d,J =13.2Hz,1H),3.05(brs,2H),1.86-1.77(m,1H),1.51(d,J=10.0Hz,1H)。 LC-MS:m/z=533.3[M+H]+。
实施例14
合成路线:
第一步
将化合物G-1(3.00g,40.50mmol)溶于二氯甲烷(30mL),加入4-甲基苯磺酰氯(7.72g,40.50mmol),三乙胺(10.24g,101.24mmol)和4-二甲氨基吡啶(247.4mg,2.02mmol),反应液在室温下搅拌8小时。减压浓缩,加入水 (150mL)打浆,过滤,滤饼用水洗涤,干燥得到化合物G-2。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.79(d,J=8.0Hz,2H),7.37(d,J=8.4Hz,2H),5.38-5.23(m,1H), 4.80-4.60(m,4H),2.47(s,3H)。
第二步
将化合物13-2(200.0mg,376.44μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中,加入氟化钾(65.6mg,1.13mmol),和化合物G-2(257.8mg,1.13mmol),反应液在110℃搅拌18小时。加氟化钾(65.6mg,1.13mmol),碳酸钾(52.0mg, 376.44μmol)和化合物G-2(257.8mg,1.13mmol),反应液在110℃搅拌5小时。加化合物G-2(100.0mg,438.09μmol)和碳酸钾(30.0mg,217.07μmol)。反应液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇= 15:1),得到化合物14-2。LC-MS:m/z=587.2[M+H]+。
第三步
参考实施例13第三步得到化合物14-3。LCMS:m/z=587.2[M+H]+。
第四步
参考实施例1第十步得到化合物将化合物实施例14。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.39(s,1H),7.86(s,1H),7.60(s,2H),6.88(s,1H), 6.75(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H), 5.68(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.51-5.40(m,1H),5.02-4.90(m, 2H),4.85-4.75(m,1H),4.57-4.47(m,2H),3.96-3.85(m,1H),3.77-3.66(m,2H), 3.56-3.46(m,1H),3.06(m,2H),1.89-1.78(m,1H),1.53(d,J=10.4Hz,1H)。 LC=MS:m/z=545.3[M+H]+。
实施例15
合成路线:
第一步
将化合物13-2(200.0mg,376.44μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中,再在室温下加入碘化钠(112.9mg,752.89μmol),氟化钾(87.5mg,1.51mmol) 和1-溴-2甲氧基乙烷(130.8mg,941.11μmol)。反应液在110℃搅拌5小时。补加氟化钾(87.5mg,1.51mmol)和1-溴-2甲氧基乙烷(157.0mg,1.13mmol),反应液在110℃继续搅拌18小时。反应液减压浓缩,用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=7:1),得到化合物15-2。LC-MS:m/z= 589.3[M+H]+。
第二步
参考实施例13第三步得到化合物15-3。
第三步
参考实施例1第十步得到化合物实施例15。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ7.89(s,1H),7.64(s,1H),7.33(d,J=8.4Hz,1H),7.03(s,1H), 6.91(s,1H),6.74(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.16(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H),5.71-5.65(m,1H),4.70-4.63(m,1H),4.15-4.25(m,2H), 3.80-3.90(m,2H),3.65-3.75(m,1H),3.59(t,J=4.8Hz,2H),3.51-3.46(m,1H), 3.23(s,3H),2.84-2.90(m,2H),1.80-1.85(m,1H),1.47-1.40(m,1H);LC-MS: m/z=547.2[M+H]+。
实施例16
合成路线:
第一步
将化合物13-2(1.00g,1.88mmol)溶于甲醇(20mL),在20-25℃下一次性加入碳酸钾(1.30g,9.41mmol)。反应液在20-25℃搅拌反应18小时。升温至 50℃反应5小时。过滤反应液,滤液减压浓缩,剩余物用饱和柠檬酸水溶液 (50mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(50mL x3)。合并有机相,用饱和食盐水(50mL) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩得到化合物16-2。
第二步
将化合物16-2(850.0mg,1.95mmol)溶于甲醇(10mL),在20℃加入三乙胺(988.0mg,9.76mmol)和二碳酸二叔丁酯(1.28g,5.86mmol),反应液在20-25℃搅拌2小时。减压浓缩反应液,加水(20mL)打浆0.5小时,过滤,干燥滤饼得到化合物16-3。LC-MS:m/z=635.3[M+H]+。
第三步
将化合物16-3(1.00g,1.57mmol)溶于甲醇(15mL),在20-25℃下一次性加入碳酸钾(1.09g,7.87mmol),反应液在20-25℃搅拌反应18小时。减压浓缩,剩余物用饱和柠檬酸水溶液调节至pH=5,在20-25℃下搅拌0.5小时。过滤,干燥滤饼得到化合物16-4。LC-MS:m/z=535.3[M+H]+。
第四步
将化合物16-4(150.0mg,280.17μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL),再在0℃下一次性加入钠氢(60%,28.0mg,700.42μmol),反应液在0℃下搅拌0.5小时,加入2-溴-N,N-二甲基乙胺(55.4mg,364.22μmol)。反应液在20℃下搅拌2小时。加入水(2mL)淬灭,用乙酸乙酯萃取(3mL x 3)。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=5:1),得到化合物16-5。LC-MS:m/z=606.4 [M+H]+。
第五步
将化合物16-5(60.0mg,98.93μmol)溶于氯化氢的二氧六环溶液(4N,4 mL)中,在20-25℃下搅拌0.5小时。减压浓缩反应液得到化合物16-6的盐酸盐。LC-MS:m/z=506.3[M+H]+。
第六步
将化合物16-6的盐酸盐(50.0mg,92.10μmol)溶于四氢呋喃(0.5mL)和水(0.5mL),0℃下加入碳酸氢钠(38.7mg,460.52μmol),缓慢滴加烯丙基酰氯 (3.3mg,36.84μmol),反应液在0℃下搅拌0.5小时,在20-25℃下搅拌18小时。补加烯丙基酰氯(2.2mg,23.95μmol),反应液在20-25℃下继续搅拌反应 2小时。减压浓缩反应液,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=3:1),得到化合物实施例16。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.34(s,1H), 7.58(s,1H),7.50-7.47(m,2H),6.69(s,1H),6.21-6.12(m,1H),6.11-6.04(m, 1H),5.75(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H),5.58-5.51(m,1H),4.73-4.65(m,1H), 4.39(t,J=6.2Hz,2H),4.19(d,J=10.8Hz,1H),3.96-3.83(m,2H),3.66-3.58 (m,1H),3.22-3.13(m,1H),3.05-3.10(m,1H),2.79(t,J=6.2Hz,2H),2.32(s, 6H),2.00-1.91(m,1H),1.59(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=560.4[M+H]+。
实施例17
合成路线:
第一步
将化合物16-4(150.0mg,280.17μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL),在0℃下一次性加入钠氢(60%,44.82mg,1.12mmol),反应液在0℃下搅拌 0.5小时,加入4-(2-溴乙基)吗啡啉(163.1mg,840.50μmol),反应液在0℃下继续搅拌2小时,加水(20mL)淬灭反应,用乙酸乙酯(20mL x 3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水(30mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1),得到化合物17-2。LC-MS:m/z=648.4[M+H]+。
第二步
参考实施例16第五步得到化合物17-3。LC-MS:m/z=548.3[M+H]+。
第三步
参考实施例1第十步得到化合物实施例17。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ8.39(s,1H),7.77(s,1H),7.67-7.55(m,1H),7.49-7.45(m,1H),7.22(s,1H), 6.79(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.34(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H), 5.80(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.40-4.25(m,2H),3.92-3.81(m,2H), 3.75-3.68(m,6H),3.60-3.56(m,2H),3.17-3.05(m,2H),2.89(t,J=5.2Hz,2H), 2.69-2.62(m,3H),2.07-1.90(m,1H),1.62(d,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z= 602.4[M+H]+。
实施例18
合成路线:
第一步
将H-1(2.00g,13.77mmol)溶于四氢呋喃(20mL)中,加入三苯基膦(3.97 g,15.15mmol),冷却至0℃,氮气保护下,向反应液中分批次加入四溴化碳(5.02g,15.15mmol),反应液升至室温,搅拌10小时。减压浓缩反应液,加水(50mL)稀释,用乙酸乙酯(30mL x 3)萃取,水相用4N的氢氧化钠溶液调节至pH=11,浓缩除去水,固体加入甲醇(100mL),在室温下搅拌15 分钟,过滤。滤液减压浓缩,加入二氯甲烷(50mL),继续搅拌15分钟,过滤,滤液减压浓缩得到化合物H-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.76-3.66(m, 4H),3.48(t,J=6.4Hz,2H),2.51-2.46(m,2H),2.46-2.41(m,4H),2.11-1.97(m, 2H)。
第二步
将化合物16-4(200.0mg,373.56μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中,在0℃下一次性加入钠氢(60%,44.8mg,1.12mmol),搅拌0.5小时,再加入化合物H-2(155.5mg,747.11μmol),反应液在0℃搅拌1.5小时。加水(5mL) 稀释,用乙酸乙酯(15mL x 3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水(20mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1),得到化合物18-2。LC-MS:m/z=662.5 [M+H]
第三步
参考实施例16第五步得到化合物18-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=562.3 [M+H]
第四步
参考实施例1第十步得到化合物实施例18。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ8.39(s,1H),7.75(s,1H),7.61-7.59(m,1H),7.49-7.46(m,1H),7.21(s,1H), 6.79(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.32(dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz,1H), 5.78(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),4.27-4.17(m,2H),4.03-3.94(m,1H), 3.92-3.83(m,2H),3.77-3.60(m,5H),3.37-3.35(m,1H),3.10(t,J=5.4Hz,2H), 2.65-2.44(m,6H),2.12-1.94(m,3H),1.63(d,J=10.0Hz,1H)。LC-MS:m/z=616.4[M+H]+。
实施例19
合成路线:
第一步
将化合物I-1(300.0mg,2.60mmol)加入到甲苯(5.0mL)中,加入氯化亚砜(309.8mg,2.60mmol),混合物在70℃搅拌3小时。反应液减压浓缩得到化合物I-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.16(dd,J1=12.0Hz,J2=6.0Hz, 1H),4.00(dd,J1=12.0Hz,J2=6.0Hz,1H),3.70(m,1H),3.56(m,1H),3.09 (m,1H),2.87(s,3H),2.36-2.21(m,1H),2.07-1.72(m,4H)。
第二步
将化合物16-4(100.0mg,186.78μmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(1.0 mL),在0℃下加入氢化钠(60%,29.8mg,747.12μmol,),搅拌0.2小时,反应液升到16℃,加入化合物I-2(49.9mg,373.56μmol),40℃下搅拌0.5小时。加水(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取,合并有机相,依次用水(10 mL),饱和食盐水(10mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备高效液相色谱法(碱性)分离纯化,得到化合物19-2。LC-MS:m/z =632.5[M+H]+。
第三步
将化合物19-2(33.0mg,52.17μmol)加入到氯化氢的乙酸乙酯溶液(2.0 mL),反应液在16℃搅拌0.5小时。反应液减压浓缩得到化合物19-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=532.4[M+H]+。
第四步
将化合物19-3的盐酸盐(30.0mg,56.34μmol)加入到无水四氢呋喃(0.5 mL)和水(0.5mL)的混合溶剂中,加入碳酸氢钠(14.2mg,169.03μmol),0℃下搅拌0.05小时,缓慢加入丙烯酰氯(3.8mg,42.26μmol),0℃下搅拌0.2小时。反应液减压浓缩,加水(5mL)稀释,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备高效液相色谱法(碱性)分离纯化,得到实施例19。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.71-8.68(m,1H),8.54-8.45(m,1H),7.35(m,1H),7.08-7.00(m,1H),6.66-6.53 (m,1H),6.47-6.36(m,1H),5.71(m,1H),4.77-4.68(m,1H),4.13(m,3H), 4.02-3.85(m,3H),3.76-3.66(m,1H),3.50(s,1H),3.00(m,2H),2.97(s,1H), 2.89(s,1H),2.55(m,1H),2.31(s,2H),2.05(s,3H),1.93(m,2H),1.86(m, 2H);LC-MS:m/z=586.4[M+H]+。
实施例20
合成路线:
第一步
将化合物J-1(6.40g,28.16mmol)溶于吡啶(20mL),加入对甲苯磺酰氯 (8.05g,42.24mmol),混合物在10℃下搅拌16小时。反应液减压浓缩,加入乙酸乙酯(300mL)稀释,依次用1N稀盐酸(100mL x 2),饱和食盐水(100mL) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=1:8)得到化合物J-2。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.77(d,J=8.4Hz,2H),7.34(d,J=8.4Hz,2H),5.69(t,J=4.8Hz, 1H),4.05-4.30(m,2H),2.45(s,3H),1.90-2.15(m,6H),1.70-1.90(m,2H),1.43 (s,9H)。LC-MS:m/z=282.0[M+H-100]+。
第二步
将化合物K-1(1.00g,10.00mmol)溶于吡啶(5mL),加入对甲苯磺酰氯 (2.86g,14.99mmol),反应液在10℃下搅拌16小时。反应液减压浓缩,剩余物溶于乙酸乙酯(40mL),依次用饱和氯化铵溶液(60mL x 3),饱和食盐水(60 mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩。剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=1:8)得到化合物K-2。1HNMR(400MHz, CDCl3)δ7.82(d,J=8.4Hz,2H),7.38(d,J=8.0Hz,2H),4.34(q,J=8.8Hz,2H),2.47(s,3H)。
第三步
将化合物7-1(4.00g,11.29mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(20mL),加入碳酸钾(2.34g,16.94mmol)和化合物J-2(5.60g,14.68mmol),反应液在75℃下搅拌16小时。反应液冷却到30℃,加入水(60mL)稀释,用乙酸乙酯(60mL x 3)萃取。合并有机相,依次用水溶液(100mL x 3),饱和食盐水(60mL x 2) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=1:1),得到化合物20-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(s,1H),8.49(t,J=8.4Hz,1H),7.26-7.40(m,3H),7.13(s,1H), 4.60-4.75(m,1H),4.15-4.40(m,2H),3.94(s,3H),1.75-2.20(m,6H),1.55-1.70 (m,2H),1.43(s,9H)。LC-MS:m/z=563.1[M+H]+。
第四步
将化合物20-2(2.70g,4.80mmol)和吡啶盐酸盐(10.80g,93.46mmol) 的混合物,在氮气保护下加热到170℃,搅拌3小时,得到化合物20-3。LC-MS: m/z=449.0[M+H]+。
第五步
将化合物20-3(13.00g,4.63mmol)和三乙胺(7.00g,69.18mmol)溶于甲醇(20mL)中,加入二碳酸二叔丁酯(9.63g,44.12mmol),反应液在10℃下搅拌1小时。反应液减压浓缩,剩余物用水(20mL)打浆,过滤得到的固体依次用饱和氯化铵溶液(10mL x 3),石油醚(10mL)洗涤,干燥后得到化合物 20-4。LC-MS:m/z=649.1[M+H]+。
第六步
将化合物20-4(3.00g,4.62mmol)溶于甲醇(50mL)中,加入碳酸钾(3.19g,23.09mmol),在40℃搅拌14小时。向反应液中加水(30mL),用醋酸调至 pH=6。过滤,固体用水(30mL)洗涤,在空气下干燥得到化合物20-5。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.54(brs,1H),8.22(s,1H),7.68(s,1H),7.61(t,J=8.4 Hz,1H),7.50-7.60(m,1H),6.94(s,1H),4.90-5.00(m,1H),4.10-4.20(m,2H), 2.10-2.20(m,2H),1.70-2.00(m,4H),1.60-1.70(m,2H),1.44(s,9H)。LC-MS: m/z=549.1[M+H]+。
第七步
将化合物20-5(70.0mg,127.41μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL),加入碳酸钾(35.2mg,254.81μmol)和化合物K-2(64.78mg,254.81μmol),混合物在70℃下搅拌16小时。反应液冷却到30℃,加水(10mL),用乙酸乙酯 (10mL x 3)萃取。合并的有机相,依次用水(30mL x 2)和饱和食盐水(30mL) 洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分离纯化,得到化合物20-6。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ9.77(s,1H),8.43(s,1H),7.97(s,1H),7.55-7.65(m,2H),7.43(s,1H), 4.95-5.05(m,2H),4.75-4.90(m,1H),4.10-4.20(m,2H),2.10-2.20(m,2H), 1.90-2.20(m,2H),1.70-1.80(m,2H),1.55-1.70(m,2H),1.44(s,9H)。LC-MS: m/z=631.1[M+H]+。
第八步
将化合物20-6(35.0mg,55.43μmol)溶于氯化氢的二氧六环溶液(4N,5 mL)中,反应液在10℃搅拌0.3小时。反应液减压浓缩,得到化合物20-7的盐酸盐。LC-MS:m/z=531.0[M+H]+。
第九步
在0℃下,将化合物20-7的盐酸盐(30.0mg,52.84μmol)溶于四氢呋喃(3 mL)和水(3mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(13.3mg,158.51μmol),缓慢滴入丙烯酰氯(3.8mg,42.27μmol),反应液在0℃继续搅拌0.5小时。加入甲醇(1 mL)淬灭,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇= 10:1),得到实施例20。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.42(s, 1H),7.93(s,1H),7.60-7.70(m,2H),7.43(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2= 10.4Hz,1H),6.19(dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.70(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),4.95-5.05(m,2H),4.85-4.95(m,1H),4.55-4.65(m,2H), 2.20-2.35(m,2H),1.80-2.10(m,4H),1.60-1.75(m,1H),1.50-1.60(m,1H)。 LC-MS:m/z=585.1[M+H]+。
实施例21
合成路线:
第一步
将化合物20-5(150.0mg,273.0μmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(3mL) 中,氮气保护下加入钠氢(60%,32.8mg,819.1μmol),0℃下搅拌30分钟,加入溴乙烷(74.4mg,682.54μmol),升至15℃继续搅拌30分钟。向反应液中加入水(5mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取,合并的有机相,依次用水 (10mL x 3),饱和食盐水(10mL x 1)洗涤,用硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=1:0),得到化合物21-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.62(br s,1H),8.39(s,1H),7.82(s, 1H),7.68-7.55(m,1H),7.21(s,1H),4.82(m,1H),4.25-4.19(m,2H),4.18-4.13 (m,2H),2.19(m,2H),1.92(m,2H),1.79(m,2H),1.65(m,2H),1.45(s,9H), 1.43-1.41(m,3H)。LC-MS:m/z=577.3[M+H]+。
第二步
将化合物21-2(50.0mg,86.6μmol)加入到乙酸乙酯(0.5mL)中,室温下加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N,1.7mL),15℃下搅拌10分钟。反应液减压浓缩得到化合物21-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=477.1[M+H]+.
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例21。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.65(s,1H),8.39(s,1H),7.80(s,1H),7.67-7.55(m,2H),7.21(s, 1H),6.78(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.00-4.85(m,1H),4.62(m,2H), 4.20(q,J=6.8Hz,2H),3.17(d,J=5.2Hz,3H),2.39-2.30(m,1H),2.25(m, 1H),2.06-1.93(m,2H),1.89(m,2H),1.67(m,1H),1.52(m,1H)。LC-MS:m/z= 531.2[M+H]+。
实施例22
合成路线:
第一步
参考实施例21第一步得到化合物22-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.63(s,1H),8.40(s,1H),7.86(s,1H),7.63-7.57(m,2H),7.26(s,1H),4.92-4.74 (m,1H),4.34-4.26(m,2H),4.19-4.14(m,2H),3.79-3.72(m,2H),3.36(s,3H), 2.18(m,2H),1.96-1.86(m,3H),1.63(m,3H),1.44(s,9H)。LC-MS:m/z=607.3 [M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物22-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=507.1 [M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例22。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.68(s,1H),8.40(s,1H),7.85(s,1H),7.69-7.55(m,2H),7.26(s, 1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.80-5.68(m,1H),5.00-4.84(m,1H),4.61(m,2H),4.34-4.23(m,2H), 3.79-3.70(m,2H),3.35(s,3H),2.36-2.15(m,2H),2.04-1.82(m,4H),1.68(m, 1H),1.52(m,1H)。LC-MS:m/z=561.3[M+H]+。
实施例23
合成路线:
第一步
在室温下,将化合物20-5(200.0mg,364.02μmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中,然后加入碳酸铯(474.4mg,1.46mmol),2-氯-N-甲基乙酰胺 (47.0mg,436.82μmol)和碘化钾(60.4mg,364.02μmol)。混合物加热至50℃,搅拌3小时。反应液降至室温,加水(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 3) 萃取,合并的有机相,依次用水(5mL x 3),饱和食盐水(5mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得到化合物23-2。LC-MS:m/z=620.3[M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物23-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=520.2 [M+H]+.
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例22。1H NMR(400MHz, MeOD-d4)δ8.38(s,1H),7.82(s,1H),7.61(t,J=8.4Hz,1H),7.47(dd,J1=8.8 Hz,J2=1.6Hz,1H),7.19(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.36 (dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.82(dd,J1=10.8Hz,J2=1.6Hz,1H), 5.22-5.09(m,1H),4.79(m,1H),4.73(s,2H),4.69-4.64(m,1H),2.85(s,3H), 2.53-2.31(m,2H),2.20-2.08(m,2H),2.07-2.01(m,2H),1.96-1.86(m,1H),1.80 (m,1H).LC-MS:m/z=574.1[M+H]+。
实施例24
合成路线:
第一步
参考实施例23第一步得到化合物24-2。LC-MS:m/z=676.3[M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物24-3盐酸盐。LC-MS:m/z=576.1 [M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例24。1H NMR(400MHz, MeOD-d4)δ8.38(s,1H),7.79(s,1H),7.62(t,J=8.4Hz,1H),7.46(dd,J1=8.8 Hz,J2=1.6Hz,1H),7.22(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.36 (dd,J1=16.4Hz,1.6Hz,1H),5.82(dd,J1=10.4Hz,J2=1.6Hz,1H),5.13-4.98 (m,1H),4.80-4.78(m,1H),4.68-4.61(m,1H),4.24(t,J=6.0Hz,2H), 3.77-3.67(m,4H),2.68-2.58(m,2H),2.53(m,4H),2.42(m,1H),2.37-2.30(m, 1H),2.20-1.99(m,6H),1.91-1.82(m,1H),1.74(m,1H)。LC-MS:m/z=630.2 [M+H]+。
实施例25
合成路线:
第一步
将化合物20-5(150.0mg,273.02μmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5mL) 中,然后加入氟化钾(47.6mg,819.05μmol),碳酸亚乙酯(72.1mg,819.05 μmol)。反应液加热至110℃,搅拌3小时。反应液降至室温,加水(20mL) 淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取,合并的有机相,依次用水(5mL x 3),饱和食盐水(5mL)洗涤,用硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,剩余物经制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得到化合物25-2。LC-MS: m/z=593.2[M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物25-3盐酸盐。LC-MS:m/z=493.0 [M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例25。1H NMR(400MHz, MeOD-d4)δ8.27(s,1H),7.69(s,1H),7.50(t,J=8.0Hz,1H),7.35(br d,J= 8.8Hz,1H),7.12(s,1H),6.65(dd,J1=16.8Hz,J2=10.8Hz,1H),6.24(dd,J1= 16.8Hz,J2=1.6Hz,1H),5.70(dd,J1=10.4Hz,J2=1.6Hz,1H),5.03-4.90(m, 1H),4.66(m,1H),4.52(m,1H),4.14(m,2H),3.94-3.83(m,2H),2.38-2.27(m, 1H),2.23(m,1H),2.07-1.93(m,2H),1.89(m,2H),1.77(m,1H),1.66(m,1H). LC-MS:m/z=547.1[M+H]+。
实施例26
合成路线:
第一步
室温下,将化合物20-5(200.0mg,364.02umol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中,然后加入碳酸铯(55.8mg,1.09mmol),化合物L-1(97.0mg, 400.42μmol)。反应液加热至100℃,搅拌3小时。反应液降至室温,加水(10 mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取,合并有机相,依次用水(5mL x 3),饱和食盐水(5mL)洗涤,用硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得到化合物26-2。LC-MS: m/z=619.2[M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物26-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=519.0 [M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例26。1H NMR(400MHz, MeOD-d4)δ8.39(s,1H),7.81(s,1H),7.62(t,J=8.4Hz,1H),7.45(dd,J1=9.2 Hz,J2=2.0Hz,1H),7.17(s,1H),6.76(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.36 (dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.81(dd,J1=10.4Hz,J2=1.6Hz,1H),5.22 (m,1H),5.07-4.94(m,1H),4.80-4.73(m,1H),4.67-4.60(m,1H),4.05(s,2H), 4.04-3.98(m,1H),3.93(m,1H),2.46-2.35(m,2H),2.32(m,1H),2.26-2.18(m, 1H),2.17-2.09(m,1H),2.06-1.93(m,3H),1.92-1.82(m,1H),1.75(m,1H);LC-MS:m/z=573.3[M+H]+。
实施例27
合成路线:
第一步
参考实施例26第一步得到化合物27-2。LC-MS:m/z=619.2[M+H]+。
第二步
参考实施例21第一步得到化合物27-3盐酸盐。LC-MS:m/z=519.0 [M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例27。1H NMR(400MHz, MeOD-d4)δ8.39(s,1H),7.82(s,1H),7.62(t,J=8.4Hz,1H),7.46(dd,J1=8.8 Hz,J2=1.6Hz,1H),7.19(s,1H),6.76(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.36 (dd,J1=16.8Hz,J2=1.6Hz,1H),5.81(dd,J1=10.4Hz,J2=1.6Hz,1H),5.23 (m,1H),5.08-4.94(m,1H),4.78(m,1H),4.68-4.61(m,1H),4.06(s,2H), 4.04-3.99(m,1H),3.93(m,1H),2.46-2.36(m,2H),2.32(m,1H),2.26-2.19(m, 1H),2.18-2.10(m,1H),2.06-1.94(m,3H),1.87(m,1H),1.76(m,1H).LC-MS:m/z=573.3[M+H]+。
实施例28
合成路线:
第一步
将化合物8-2(83.6mg,647.49μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL),加入HATU(123.1mg,323.74μmol),反应液在16℃搅拌0.5小时,加入DIEA (69.7mg,539.57μmol)和化合物N-1(100.0mg,215.83μmol),继续搅拌16小时。过滤反应液,滤液减压浓缩,剩余物用制备高效液相色谱法(中性)分离纯化得到化合物实施例28。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.37(s,1H),7.76 (s,1H),7.60(t,J=8.3Hz,1H),7.45(dd,J1=8.8Hz,J2=1.6Hz,1H),7.20(s,1H),6.90(m,1H),6.60(d,J=15.2Hz,1H),5.11-5.01(m,1H),4.75(m,1H), 4.63(m,1H),3.99(s,3H),3.19(d,J=6.0Hz,2H),2.44-2.37(m,1H),2.33(m, 1H),2.30(s,6H),2.19-2.10(m,1H),2.09-1.96(m,3H),1.85(m,1H),1.75(m, 1H)。LC-MS:m/z=574.4[M+H]+。
实施例29
合成路线:
第一步
将化合物13-2(250.0mg,470.56μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL),加入氟化钾(65.6mg,1.13mmol)、碳酸钾(130.07mg,941.11μmol)和化合物 L-1(171.0mg,705.83μmol)到反应液中,反应液在118℃搅拌18小时。减压浓缩除去溶剂,剩余物经制备薄层层析板(乙酸乙酯)分离纯化,得到化合物 29-2。LC-MS:m/z=601.3[M+H]+。
第二步
将化合物29-2(147.0mg,244.44μmol)溶于甲醇(10mL)中,加入碳酸钾 (168.9mg,1.22mmol),反应液在50℃搅拌5小时。减压浓缩反应液,剩余物溶于甲醇(5mL),加入碳酸钾(33.8mg,244.44μmol),反应液在50℃搅拌反应5小时。减压浓缩反应液,剩余物经制备薄层层析板(二氯甲烷:甲醇= 10:1)分离纯化得到化合物29-3。LC-MS:m/z=505.3[M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例29。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),8.39(t,J=8.4Hz,1H),7.33(dd, J=8.8,1.6Hz,1H),7.19(d,J=5.2Hz,1H),7.16(s,1H),6.61(dd,J=16.8, 10.4Hz,1H),6.42(dt,J=16.4,2.4Hz,1H),5.72(dd,J=10.4,2.0Hz,1H), 5.07-5.02(m,1H),4.70-4.65(m,1H),4.09-4.03(m,1H),4.02-3.95(m,3H), 3.94-3.83(m,3H),3.70-3.65(m,1H),3.00-2.97(m,2H),2.36-2.23(m,1H), 2.18-2.15(m,1H),1.92-1.87(m,2H);LC-MS:m/z=559.3[M+H]+。
实施例30
合成路线:
第一步
将化合物O-1(2.00g,22.44mmol)溶于吡啶(5mL),加入对甲苯磺酰氯 (4.28g,22.44mmol),反应液在10℃下搅拌16小时。反应液加入乙酸乙酯(50 mL),过滤,滤液浓缩得到化合物O-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(d, J=7.6Hz,2H),7.12(d,J=7.6Hz,2H),3.98(t,J=6.4Hz,2H),3.49(t,J=6.4 Hz,2H),2.76(s,3H),2.30(s,6H)。LC-MS:m/z=244.0[M+H]+。
第二步
将化合物20-5(200.0mg,364.02μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL),加入碳酸钾(100.6mg,728.04μmol)和化合物O-2(177.2mg,728.04μmol),混合物在70℃搅拌16小时。反应液冷却到30℃,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取。合并的有机相,依次用水(30mL x 2),饱和食盐水(30mL) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物经制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1),得到化合物30-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),8.53(t,J=8.4Hz,1H),7.20-7.40(m,4H),4.65-4.85(m, 1H),4.20-4.45(m,4H),2.90-3.00(m,2H),2.44(s,6H),2.10-2.20(m,2H), 1.95-2.10(m,2H),1.75-1.95(m,2H),1.60-1.75(m,2H),1.50(s,9H)。LC-MS: m/z=620.1[M+H]+。
第三步
参考实施例20第八步得到化合物30-3盐酸盐。LC-MS:m/z=520.1 [M+H]+。
第四步
参考实施例20第九步得到化合物实施例30。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.68(s,1H),8.40(s,1H),7.86(s,1H),7.55-7.70(m,2H),7.26(s, 1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(d,J=16.8Hz 1H),5.72(d, J=10.4Hz 1H),4.90-5.00(m,1H),4.55-4.60(m,2H),4.20-4.30(m,2H), 2.70-2.80(m,2H),2.31(s,6H),1.80-2.10(m,6H),1.60-1.70(m,1H),1.45-1.60 (m,1H)。LC-MS:m/z=574.1[M+H]+。
实施例31
合成路线:
第一步
将化合物31-1(300.0mg,1.28mmol)溶于氯化亚砜(3.0mL,41.45mmol),加入N,N-二甲基甲酰胺(47.30μL,614.84μmol),反应液加热至80℃,搅拌1 小时。反应液减压浓缩,剩余物室温下加入化合物P-1(171.8mg,1.28mmol) 的异丙醇(10mL)溶液,混合物加热至90℃,搅拌1小时。反应液冷却到20℃,过滤,固体用异丙醇(10mL)洗涤,在空气中干燥得化合物31-2。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.51(s,1H),9.35(s,1H),8.90(s,1H),8.72(s,1H),8.23(s, 1H),7.85-8.00(m,2H),7.50(s,1H),4.03(s,3H),2.41(s,3H)。LC-MS:m/z=351.0[M+H]+。
第二步
将化合物31-2(400.0mg,1.14mmol)溶于乙醇(10mL),加入氢氧化钠(228.4mg,5.71mmol)的水(2mL)溶液,反应液在10℃下搅拌1小时。反应液加入醋酸(0.5mL)和水(10mL),继续搅拌0.5小时。过滤反应液,固体用水(10mL)洗涤,减压干燥,得到化合物31-3。1HNMR(400MHz,DMSO-d6) δ10.89(s,1H),9.67(s,1H),9.38(s,1H),8.42(s,1H),8.08(d,J=2.8Hz,1H), 7.80-7.90(m,1H),7.74(s,1H),7.19(s,1H),7.03(d,J=8.8Hz,1H),3.97(s,3H)。LC-MS:m/z=309.0[M+H]+。
第三步
将化合物31-3(100.0mg,324.37μmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(5mL),加入碳酸钾(89.,7mg,648.74μmol)和化合物P-2(1034mg,308.15μmol),反应液在70℃下搅拌16小时。反应液冷却到20℃,加水(30mL)稀释,用乙酸乙酯(20mL x 3)萃取。合并的有机相,依次用水(30mL x 3),饱和食盐水(30 mL x 2)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=15:1),得到实施例31。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.68(s,1H),9.46(s,1H),8.44(s,1H),8.23(d,J=2.4Hz 1H),8.00-8.10(m,1H),7.76(s,1H),7.50(d,J=9.6Hz 1H),6.77(dd,J1=16.8 Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H),5.73(dd,J1=10.4 Hz,J2=2.4Hz,1H),4.90-5.10(m,1H),4.55-4.65(m,2H),3.98(s,3H), 2.15-2.35(m,2H),1.80-2.00(m,4H),1.60-1.70(m,1H),1.45-1.55(m,1H)。 LC-MS:m/z=472.1[M+H]+。
实施例32
合成路线:
第一步
参考实施例31第一步得到化合物32-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.21(s,1H),8.97(s,1H),8.71(s,1H),8.18(d,J=2.0Hz,1H),7.71-7.81(m, 2H),7.49(s,1H),4.02(s,3H),2.40(s,3H)。LC-MS:m/z=378.0[M+H]+。
第二步
参考实施例31第二步得到化合物32-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.77(s,1H),9.61(s,1H),8.54(s,1H),8.34(d,J=2.4Hz,1H),7.80-7.90(m, 1H),7.81(s,1H),7.61(d,J=8.8Hz,1H),7.24(s,1H),3.99(s,3H)。LC-MS: m/z=335.9[M+H]+。
第三步
参考实施例31第三步得到化合物实施例32。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.62(s,1H),8.58(s,1H),8.32(d,J=2.8Hz 1H),7.85-7.95(m, 2H),7.68(d,J=8.8Hz 1H),7.24(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz, 1H),6.22(dd,J1=16.8Hz,J2=2.4Hz,1H),5.72(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz, 1H),4.90-5.10(m,1H),4.60-4.65(m,2H),3.92(s,3H),2.20-2.40(m,2H), 1.80-2.10(m,4H),1.60-1.70(m,1H),1.40-1.50(m,1H)。LC-MS:m/z=499.1 [M+H]+。
实施例33
合成路线:
第一步
参考实施例31第一步得到化合物33-2。LC-MS:m/z=362.0[M+H]+。
第二步
参考实施例31第二步得到化合物33-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.76(s,1H),9.50(s,1H),8.35(s,1H),7.66(s,1H),7.42-7.60(m,2H),7.20-7.30 (m,1H),7.21(s,1H),3.98(s,3H)。LC-MS:m/z=319.9[M+H]+。
第三步
参考实施例31第三步得到化合物实施例33。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.57(s,1H),8.38(s,1H),7.78(s,1H),7.50-7.65(m,2H),7.25-7.35 (m,1H),7.21(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1= 16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.77(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),4.90-5.10(m, 1H),4.55-4.65(m,2H),3.98(s,3H),2.20-2.40(m,2H),1.85-2.10(m,4H), 1.60-1.70(m,1H),1.45-1.55(m,1H)。LC-MS:m/z=483.0[M+H]+。
实施例34
合成路线:
第一步
参考实施例31第一步得到化合物34-2。LC-MS:m/z=380.0[M+H]+。
第二步
参考实施例31第二步得到化合物34-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.76(s,1H),9.49(s,1H),8.33(s,1H),7.65(s,1H),7.50-7.60(m,1H),7.32-7.40 (m,1H),7.21(s,1H),3.98(s,3H)。LC-MS:m/z=337.9[M+H]+。
第三步
参考实施例31第三步得到化合物实施例34。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.60(s,1H),8.37(s,1H),7.78(s,1H),7.56-7.65(m,1H),7.38-7.50 (m,1H),7.21(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1= 16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.72(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),4.90-5.05(m, 1H),4.55-4.65(m,2H),3.98(s,3H),2.20-2.40(m,2H),1.85-2.10(m,4H), 1.60-1.70(m,1H),1.45-1.55(m,1H)。LC-MS:m/z=501.1[M+H]+。
实施例35
合成路线:
第一步
参考实施例31第一步得到化合物35-2。LC-MS:m/z=350.0[M+H]+。
第二步
参考实施例31第二步得到化合物35-3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.74(s,1H),9.51(s,1H),9.37(s,1H),8.49(s,1H),8.07(s,1H),7.91(s,1H), 7.60-7.70(m,3H),7.22(s,1H),3.98(s,3H)。LC-MS:m/z=307.9[M+H]+。
第三步
参考实施例31第三步得到化合物实施例35。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.68(s,1H),9.27(s,1H),8.49(s,1H),8.00-8.10(m,2H),7.55-7.70 (m,3H),7.21(s,1H),6.77(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1= 16.8Hz,J2=2.0Hz,1H),5.72(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),5.10-5.15(m, 1H),4.55-4.65(m,2H),3.98(s,3H),2.20-2.40(m,2H),1.80-2.10(m,4H), 1.60-1.70(m,1H),1.40-1.50(m,1H)。LC-MS:m/z=471.2[M+H]+。
实施例36
合成路线:
第一步
将化合物16-4(100.0mg,470.56μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中,向反应液中加入NaH(60%。22.4mg,560.34μmol),反应液在0℃搅拌0.5 小时,加入化合物1-(2-溴乙基)哌啶(55.1mg,373.56μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液,反应液在15℃搅拌5小时。加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯(5mL x 3)萃取,合并的有机相用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=7:1),得到化合物36-2。
第二步
参考实施例21第二步得到化合物36-3的盐酸盐。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例36。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ8.70(s,1H),8.49(t,J=8.4Hz,1H),7.34(d,J=8.8Hz,1H),7.27-7.25(m, 1H),7.07(s,1H),6.66-6.57(m,1H),6.43(d,J=16.8Hz,1H),5.73(d,J=10.0 Hz,1H),4.69-4.67(m,1H),4.28-4.28(m,2H),3.99-3.94(m,2H),3.90-3.87(m, 1H),3.74-3.71(m,1H),3.01-3.00(m,2H),2.89(m,2H),2.59(m,4H),2.05-2.01 (m,2H),1.65-1.61(m,4H),1.48-1.46(m,2H);LC-MS:m/z=600.3[M+H]+。
实施例37
合成路线:
第一步
将化合物13-2(250.0mg,470.56μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中,加入碳酸钾(130.0mg,941.11μmol),和化合物M-1(171.0mg,705.83μmol) 到反应液中,反应液在110℃搅拌18小时。减压浓缩除去溶剂,剩余物经制备薄层层析板(二氯甲烷:甲醇=15:1)分离纯化,得到化合物37-2。LC-MS: m/z=601.3[M+H]+。
第二步
将化合物37-2(100.0mg,166.29μmol)溶于甲醇(5mL)中,加入碳酸钾 (68.9mg,498.86μmol),反应液在40-50℃搅拌3小时。然后在60℃再搅拌 12小时。减压浓缩反应液,剩余物经制备薄层层析板(二氯甲烷:甲醇=10: 1)分离纯化得到化合物37-3。LC-MS:m/z=505.2[M+H]+。
第三步
参考实施例20第九步得到化合物实施例37。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ8.40(s,1H),7.79(s,1H),7.65-7.58(m,1H),7.47(d,J=10.8Hz,1H),7.18(s, 1H),6.84-6.73(m,1H),6.36-6.29(m,1H),5.82-5.75(m,1H),5.19(s,1H), 4.09-4.03(m,1H),3.99-3.87(m,5H),3.84-3.78(m,1H),3.60-3.75(m,1H),3.37 (s,1H),3.17-3.03(m,2H),2.39-2.26(m,1H),2.16(s,1H),2.04-1.93(s,1H),1.61 (d,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=559.3[M+H]+。
实施例38
合成路线:
第一步
将化合物38-1(900.0mg,3.93mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL),加入碳酸钾(1.09g,7.85mmol)和化合物Q-1(1.60g,7.07mmol)。反应液在 75℃搅拌16小时。反应液冷却到20℃,加水(30mL)稀释,用乙酸乙酯(30mL x 2)萃取。合并的有机相,依次用水(40mL x2),饱和食盐水(40mL x 2)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析法分离纯化 (乙酸乙酯:石油醚=1:3),得到化合物38-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(s,1H),6.45(s,1H),4.75(d,J=8.4Hz,1H),4.10-4.40(m,2H),3.87(s, 3H),3.86(s,3H),3.75-3.80(m,1H),1.90-2.10(m,4H),1.50-1.70(m,4H),1.41 (s,9H)。LC-MS:m/z=458.1[M+Na]+。
第二步
将化合物38-2(1.50g,3.44mmol)溶于甲醇(30mL)中,加入湿钯碳(10%,50.0mg),反应液在20℃,氢气氛围下搅拌0.5小时。过滤反应液,滤液减压浓缩,干燥得到化合物38-3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.09(s,1H),6.10 (s,1H),5.36(brs,2H),4.15-4.40(m,2H),3.85(s,3H),3.82(s,3H),3.65-3.80 (m,1H),1.95-2.15(m,4H),1.90-1.85(m,2H),1.47(s,9H),1.30-1.45(m,2H)。 LC-MS:m/z=406.2[M+H]+。
第三步
将化合物38-3(1.30g,3.21mmol)和醋酸铵(2.47g,32.06mmol)加入原甲酸三甲酯(31.29g,294.89mmol)中,反应液在70℃搅拌10小时。降温至20℃,反应液减压浓缩,剩余物加入水(10mL)打浆,过滤,固体干燥后得到化合物38-4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(s,1H),7.08(s,1H),7.00(s,1H), 5.17(d,J=8.4Hz,1H),4.10-4.20(m,2H),3.95-4.00(m,1H),3.92(s,3H), 1.90-2.00(m,4H),1.75-1.90(m,2H),1.50-1.60(m,2H),1.43(s,9H)。LC-MS: m/z=401.1[M+H]+。
第四步
将化合物38-4(1.20g,3.00mmol)加入氯化氢的二氧六环溶液(4N,10 mL),反应液在0℃搅拌0.4小时。反应液减压浓缩,得到化合物38-5的盐酸盐。LC-MS:m/z=301.0[M+H]+。
第五步
在0℃,将38-5的盐酸盐(1.10g,3.27mmol),三乙胺(4.6mL,32.66mmol) 溶入二氯甲烷(30mL)中,滴加三氟乙酸酐(1.37g,6.53mmol),反应液在20℃搅拌1小时。减压浓缩,剩余物加水(40mL)打浆,过滤,固体干燥得到化合物38-6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,1H),7.80-7.90(m,1H), 7.13(m,1H),7.00(m,1H),5.28(d,J=9.2Hz,1H),4.60-4.70(m,1H), 4.40-4.50(m,1H),4.00-4.10(m,1H),3.91(s,3H),1.90-2.20(m,6H),1.55-1.75 (m,2H)。LC-MS:m/z=397.0[M+H]+。
第六步
将化合物38-6(500.0mg,1.26mmol)溶于三氯氧磷(24.1mL,260.22mmol) 中,加入N,N二甲基甲酰胺(92.2mg,1.26mmol),反应液在100℃搅拌5小时。减压浓缩,剩余物加入3,4-二氯-2-氟苯胺(340.6mg,1.89mmol)的异丙醇 (5mL)溶液。反应液在90℃搅拌1小时。反应液冷却到20℃,加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭,用乙酸乙酯(10mL x 2)萃取。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚=2:1),得到化合物38-7。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.50-8.65(m,2H),7.40-7.50(m,1H),7.15-7.25(m,2H),6.59(s,1H),4.75-4.85 (m,1H),4.55-4.65(m,2H),4.05-4.10(m,1H),3.98(s,3H),2.10-2.40(m,4H), 1.90-2.00(m,2H),1.60-1.75(m,2H)。LC-MS:m/z=557.9[M+H]+。
第七步
将化合物38-7(305.0mg,547.2μmol)溶于甲醇(15mL)中,加入碳酸钾 (378.2mg,2.74mmol)。反应液在50℃搅拌14个小时。反应液减压浓缩,剩余物用硅胶制备板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10:1),得到化合物38-8。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.28(s,1H),7.67(t,J=8.0Hz, 1H),7.58(d,J=10.0Hz,1H),7.20(s,1H),7.14(s,1H),5.17(d,J=8.4Hz,1H), 4.05-4.10(m,2H),3.98-4.05(m,1H),3.93(s,3H),2.15-2.30(m,4H),1.95-2.10 (m,2H),1.70-1.80(m,2H)。LC-MS:m/z=462.0[M+H]+。
第八步
在0℃下,将化合物38-8(220.0mg,475.8μmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水 (6mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(119.9mg,1.43mmol),缓慢滴入丙烯酰氯 (38.8mg,428.3μmol)。反应液在0℃继续搅拌0.5小时。加入MeOH(1mL) 淬灭,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇=10: 1),得到化合物实施例38(Rf=0.3)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(s, 1H),8.24(s,1H),7.66(t,J=8.0Hz,1H),7.57(d,J=8.8Hz,1H),7.14(s,1H), 7.06(s,1H),6.72(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1=16.8Hz, J2=1.6Hz,1H),5.68(dd,J1=10.4Hz,J2=1.6Hz,1H),5.35(d,J=9.2Hz,1H), 4.50-4.60(m,2H),4.05-4.15(m,1H),3.92(s,3H),1.85-2.20(m,6H),1.60-1.70 (m,1H),1.50-1.60(m,1H)。LC-MS:m/z=538.0[M+Na]+。
实施例39
合成路线:
第一步
参考实施例38第八步得到化合物实施例39(Rf=0.4)。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.38(s,1H),8.27(s,1H),7.50-7.60(m,2H),7.14(s,1H),7.05(s, 1H),6.74(dd,J1=16.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.18(dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz, 1H),5.69(dd,J1=10.4Hz,J2=2.0Hz,1H),5.47(d,J=4.8Hz,1H),4.50-4.60 (m,2H),4.01(s,3H),3.80-3.90(m,1H),2.20-2.30(m,1H),1.85-2.15(m,7H)。 LC-MS:m/z=538.0[M+Na]+。
实施例40
合成路线:
第一步
将化合物40-1(200.0mg,853.94μmol)溶于氯化亚砜(3mL),加入N,N- 二甲基甲酰胺(6μL 85.39μmol)。反应液加热至80℃,搅拌1小时。反应液减压浓缩,剩余物室温下加入3-氯-4-氟苯胺(130.0mg,893.09μmol)的异丙醇 (5mL)溶液,混合物加热至90℃并搅拌3小时。反应液减压浓缩,剩余物室温下加入乙酸乙酯(15mL),悬浊液室温下搅拌1小时,悬浊液过滤后滤饼真空干燥,得到化合物40-2。LC-MS:m/z=320.1[M+H]+。
第二步
将化合物40-2(50.0mg,156.39μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中,加入碳酸铯(100.0mg,306.92μmol)和化合物P-2(50.0mg,149.07μmol),反应液在90℃搅拌45分钟。反应液冷却到15℃,倒入水(30mL)中,用乙酸乙酯(20mL x 3)萃取。合并的有机相,依次用水(30mL)和饱和食盐水(30mL) 洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(乙酸乙酯:四氢呋喃=4:1),得到化合物实施例40。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ9.68(s,1H),8.51(s,1H),8.19(dd,J1=6.8Hz,J2=2.8 Hz,,1H),7.95(s,1H),7.78-7.84(m,1H),7.46(t,J=9.2Hz,1H),7.21(s,1H), 6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H), 5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.97-5.11(m,1H),4.58-4.63(m,2H), 3.92(s,3H),2.30-2.38(m,1H),2.20-2.27(m,1H),2.00-2.09(m,2H),1.84-1.97 (m,2H),1.65(t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=483.1 [M+H]+。
实施例41
合成路线:
第一步
参考实施例40第一步得到化合物41-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.95(s,1H),8.29(s,1H),8.07(s,1H),7.93-8.02(m,2H),7.40(s,1H),4.05(s, 3H)。LC-MS:m/z=370.0[M+H]+。
第二步
参考实施例40第二步得到化合物实施例41。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.82(s,1H),8.65(s,1H),8.44(s,1H),8.04-8.09(m,1H),7.87-7.94 (m,2H),7.28(s,1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1= 16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.96-5.08(m, 1H),4.58-4.63(m,2H),3.94(s,3H),2.23-2.37(m,2H),1.80-2.12(m,4H),1.65 (t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=532.9[M+H]+。
实施例42
合成路线:
第一步
将化合物20-5(200.0mg,364.02μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中,加入碳酸铯(240.0mg,736.60μmol),碘化钠(4.0mg,26.69μmol)和3-碘氧杂环丁烷(80.0mg,434.84μmol),反应液在90℃搅拌1小时。反应液冷却到15℃,倒入水(30mL)中,用乙酸乙酯(20mL x3)萃取。合并的有机相,依次用水(30mL)和饱和食盐水(30mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(乙酸乙酯),得到化合物42-2。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),8.48(t,J=8.8Hz,1H),7.27(dd,J1=9.2Hz,J2=2.0Hz,1H),7.18(s,1H),6.76(s,1H),5.28-5.32(m,1H), 4.99-5.05(m,2H),4.68-4.80(m,3H),4.21-4.40(m,2H),2.10-2.15(m,2H), 2.00-2.06(m,2H),1.82-1.96(m,2H),1.58-1.64(m,2H),1.45(s,9H)。LC-MS: m/z=605.3[M+H]+。
第二步
将化合物42-2(400.0mg,709.92μmol)溶于二氯甲烷(2mL)中,加入三氟乙酸(1mL),反应液在15℃反应0.5小时。反应液直接减压浓缩,得到化合物42-3的三氟乙酸盐。LC-MS:m/z=505.2[M+H]+。
第三步
在0℃下将化合物42-3的三氟乙酸盐(50.0mg,98.94μmol)溶于四氢呋喃 (2mL)和水(2mL)的混合溶剂,加入碳酸氢钠(26.0mg,309.50μmol)后,缓慢滴入丙烯酰氯(10.0mg,110.49μmol)。反应液在0℃下,继续搅拌1小时。加入甲醇(10mL)淬灭,减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(乙酸乙酯:四氢呋喃=4:1),得到化合物实施例42。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.72(br s,1H),8.38(s,1H),7.84(s,1H),7.61(s,2H),6.84-6.89(m,1H),6.77 (dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.40-5.52(m,1H),4.95-5.08(m,3H), 4.55-4.69(m,4H),2.25-2.43(m,2H),1.86-2.05(m,4H),1.65(t,J=10.4Hz, 1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=559.0[M+H]+。
实施例43
合成路线:
第一步
将化合物20-5(300.0mg,546.03μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL),再在0℃下一次性加入钠氢(60%,45.0mg,1.12mmol),反应液在0℃下搅拌 0.5小时,加入1,2-二溴乙烷(149.4mg,795.27μmol)。反应液在15℃下搅拌 11.5小时。加入水(50mL)淬灭,用乙酸乙酯萃取(50mL x 3)。合并有机相,用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液减压浓缩,剩余物用制备薄层层析板分离纯化(乙酸乙酯),得到化合物43-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(s,1H), 8.46(t,J=8.53Hz,1H),7.20-7.29(m,4H),4.66-4.77(m,1H),4.40-4.45(m, 2H),4.18-4.32(m,2H),3.70-3.75(m,2H),2.03-2.15(m,2H),1.90-1.95(m,2H), 1.72-1.82(m,2H),1.58-1.65(m,2H),1.45(s,9H)。LC-MS:m/z=657.2 [M+H]+。
第二步
将化合物43-2(170.0mg,259.00μmol)溶于四氢呋喃(3mL)中,加入氮杂环丁烷(42.3mg,740.88μmol),反应液在50℃搅拌1.5小时。反应液减压浓缩,得到化合物43-3。LC-MS:m/z=632.2[M+H]+。
第三步
参考实施例42第二步,得到化合物43-4的三氟乙酸盐。LC-MS:m/z= 532.3[M+H]+。
第四步
参考实施例42第三步,得到化合物实施例43。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.39(s,1H),7.80(s,1H),7.56-7.67(m,2H),7.19(s, 1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.88-5.06(m,1H),4.54-4.66(m, 2H),4.04-4.14(m,2H),3.22-3.26(m,4H),2.76-2.84(m,2H),2.16-2.32(m,2H), 1.85-2.07(m,6H),1.65(t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS: m/z=586.1[M+H]+。
实施例44
合成路线:
第一步
参考实施例43第一步,得到化合物44-2。LC-MS:m/z=607.3[M+H]+。
第二步
将化合物44-2(170.0mg,279.84μmol)溶于氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N, 10mL)中,在20-25℃下搅拌15分钟。减压浓缩反应液得到化合物44-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=507.2[M+H]+。
第三步
参考实施例42第三步,得到化合物实施例44。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.37(s,1H),7.80(s,1H),7.46-7.68(m,2H),7.21(s, 1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.82-4.94(m,1H),4.57-4.62(m, 2H),4.16-4.24(m,2H),3.53-3.64(m,2H),2.16-2.32(m,2H),1.75-2.10(m,6H), 1.65(t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=560.9 [M+H]+。
实施例45
合成路线:
第一步
参考实施例42第一步,得到化合物45-2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.71(s,1H),8.53(t,J=8.4Hz,1H),7.27-7.37(m,3H),7.17(s,1H),4.71-4.84 (m,1H),4.28-4.44(m,3H),2.14-2.22(m,J=7.8Hz,2H),1.54-2.01(m,10H), 1.51(s,9H),1.33(s,6H)。LC-MS:m/z=635.3[M+H]+。
第二步
参考实施例44第二步,得到化合物45-3的盐酸盐。LC-MS:m/z=535.3 [M+H]+。
第三步
参考实施例42第三步,得到化合物实施例45。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.75(s,1H),8.37(s,1H),7.84(s,1H),7.49-7.66(m,2H),7.22(s, 1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz, 1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.88-5.03(m,1H),4.55-4.64(m, 2H),4.18-4.27(m,2H),2.17-2.39(m,2H),1.82-2.07(m,6H),1.65(t,J=10.4 Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H),1.17(s,6H)。LC-MS:m/z=589.3[M+H]+。
实施例46
合成路线:
第一步
参考实施例40第一步,得到化合物46-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.43(s,1H),8.90(s,2H),8.34(d,J=2.4Hz,1H),8.19(s,1H),8.15(dd,J1= 8.4Hz,J2=2.4Hz,1H),7.83(d,J=8.4Hz,1H),7.51(s,1H),4.03(s,3H)。 LC-MS:m/z=370.1[M+H]+。
第二步
参考实施例40第二步,得到化合物实施例46。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.50-8.62(m,2H),8.30-8.38(m,1H),8.17(s,1H), 7.73(d,J=8.8Hz,1H),7.23(s,1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2=10.4Hz,1H), 6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H), 5.09-5.21(m,1H),4.54-4.65(m,2H),3.93(s,3H),2.20-2.34(m,2H),1.87-2.10 (m,4H),1.65(t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。LC-MS:m/z=533.1 [M+H]+。
实施例47
合成路线:
第一步
参考实施例40第一步,得到化合物47-2。LC-MS:m/z=354.1[M+H]+。
第二步
参考实施例40第二步,得到化合物实施例47。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.81(s,1H),8.52(s,1H),8.29-8.38(m,1H),8.17-8.25(m,1H), 7.95(s,1H),7.56(t,J=9.54Hz,1H),7.23(s,1H),6.77(dd,J1=16.4Hz,J2= 10.4Hz,1H),6.22(dd,J1=16.4Hz,J2=2.4Hz,1H),5.73(dd,J1=10.4Hz,J2=2.4Hz,1H),4.97-5.12(m,1H),4.57-4.69(m,2H),3.93(s,3H),2.19-2.31(m, 2H),1.88-2.03(m,4H),1.65(t,J=10.4Hz,1H),1.49(t,J=10.4Hz,1H)。 LC-MS:m/z=517.1[M+H]+。
实施例48
合成路线:
第一步
参考实施例38第六步,得到化合物48-2(2.7g)。LC-MS:m/z=542.2 [M+H]+。
第二步
参考实施例38第七步,得到化合物48-3(0.9g)。LC-MS:m/z=446.1 [M+H]+。
第三步
参考实施例38第八步,得到实施例48(160.0mg)。1H NMR(400MHz, CD3OD)D 8.23(s,1H),7.61-7.52(m,1H),7.27-7.17(m,2H),7.09(s,1H),6.75 (dd,J1=12.8Hz,J2=10.4Hz,1H),6.33(dd,J1=16.8Hz,J2=2.0Hz,1H), 5.79(dd,J1=6.4Hz,J2=2.0Hz,1H),4.79-4.75(m,1H),4.63-4.61(m,1H), 4.29-4.23(m,1H),4.03(s,3H),2.34-2.31(m,1H),2.27-2.21(m,1H),2.19-2.14 (m,2H),2.13-2.03(m,2H),1.76-1.66(m,1H),1.64-1.53(m,1H)。LC-MS:m/z =500.2[M+H]+。
生物化学检测:体外评价
实验例1酶活性评价
本试验目的是检测化合物对HER1(ErbB1),HER2(ErbB2),HER4(ErbB4) 的体外抑制活性。本试验采用的酶为人源ErbB1,ErbB2和ErbB4,Eurofins Pharma DiscoveryService提供活性检测方法,测试化合物对HER1,HER2, HER4抑制活性结果如表1所示。
实验步骤和方法(96孔板):
加入5倍稀释的测试化合物缓冲液(5μL),多肽底物poly(Glu,Tyr)(4:1) (2.5μL),ErbB(4-20ng,2.5μL),MnCl2(50mM,1.25μL),dH2O(3.75μL), [γ-33P]ATP(10μL),在30℃孵化10分钟。加入3%磷酸终止反应,取10μL 标本转移至Filtermate A,用75mM磷酸清洗滤片3次,用甲醇清洗1次,滤片转移到密封塑料口袋,加入闪烁液混合物(4mL),在闪烁发光计数仪检测发出的光子强度,将酶样本的cpm(次数/分钟)与内控样品的cpm进行比较,光子强度的高低反映了酪氨酸激酶活性的强弱。
表1:本发明化合物体外酶活性筛选试验结果
b:测试2次的平均值。
结论:本发明化合物对HER1,HER2和HER4抑制活性明显。
实验例2细胞增殖抑制活性评价:
实验目的:检测待测化合物对细胞增殖抑制活性。
实验原理:Cell-Titer-Glo试剂中的荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底物,产生氧化荧光素,并以光的形式释放能量。由于荧光素酶反应需要ATP,因而反应产生的光的总量和反应细胞活力的ATP数总量成正比。
实验材料:
细胞系:NCI-N87细胞系(ATCC-CRL-5822),BT-474细胞系 (ATCC-HTB-20),OE21(ECACC-96062201)
细胞培养基:(RPMI 1640培养基(Invitrogen#22400-105;10%血清 Invitrogen#10090148;左旋谷酰胺1×,Gibco#25030-081;双抗Hyclone# SV30010)
Cell
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega#G7573)
384孔细胞培养板(Greiner#781090)
化合物板(LABCYTE#LP-0200)
CO2培养箱(Thermo#371)
Vi-cell细胞计数仪(Beckman Coulter)
移液器(Eppendorf)
移液管(Greiner)
移液枪(Eppendorf)
多功能酶标仪(Envision Reader)
ECHO Liquid-handling workstation(Labcyte-ECHO555)
实验步骤和方法:
2.1第1天:
按照细胞种板示意图在384或96孔板中分别按每孔1000个细胞,25μL 每孔的密度种板,边缘孔不种细胞补25μL PBS。
2.2第0天:
(1)化合物母液为10mM,用DMSO稀释化合物使其初始浓度为4mM。在化合物母液板上加入化合物,每孔9μL。
(2)用ECHO液体工作站做化合物稀释并向细胞板每孔加入125nL化合物,第2列和23列细胞孔每孔加125nL DMSO,第1列和24列PBS孔每孔加125nL DMSO。
(3)细胞板每孔补加25μL培养基,最终细胞板每孔为50μL,化合物浓度为1μM,3倍稀释,10个浓度,左右复孔,DMSO终浓度为0.25%。
2.3加好化合物后,1000rpm离心1min,将细胞板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养3天。
2.4第3天:
从培养箱中取出细胞板,在室温下平衡30分钟。向每孔加入25μL Cell-Titer-Glo试剂,振摇一分钟使它被充分混匀,1000rpm离心1分钟。10 分钟后,在PerkinElmerEnvision上读板,设置荧光读取时间0.2秒。
试验结果:试验结果如表2。
OE19细胞CTG实验
用胰酶消化饱和度已达到80%-90%的OE19细胞,离心重悬计数,调整细胞浓度,90ml/孔,加入96孔细胞培养板,使OE19细胞每孔个数为8000 个。在含5%CO2的细胞培养箱中37℃培养过夜。
用DMSO将待测化合物母液3倍梯度稀释,共10个浓度。在实验开始前,在无菌条件下将梯度稀释好的待测化合物用细胞培养液进一步稀释为 10×化合物溶液(最高浓度含1%DMSO)。将配制好的10×化合物溶液加入到细胞培养板中,每孔加入10μL。这样,模型标准对照Staurosporine(星形孢菌素)及所有受试化合物的终浓度均以10μM为起始浓度,梯度3倍稀释,共10个测试浓度点。
细胞培养72小时后,取出96孔细胞培养板,加入Cell Titer Glo试剂, 50ml/孔,混匀离心,室温避光孵育10分钟。将细胞板放入Envision进行读数。
根据原始数据计算抑制率,抑制率计算公式为:
抑制百分比%=(ZPE-样本检测值)/(ZPE-HPE)×100%
以DAY3(以加化合物记为实验第一天,DAY3为读数当天)的含10mM staurosporine的孔作为HPE(100%抑制对照)孔,以DAY3的含0.1%的DMSO 孔为ZPE(0%抑制对照)孔。受试化合物每个浓度点设两个复孔。
处理后的数据将用GraphPad Prism 6分析软件来做非线性回归分析,得到剂量效应曲线,并计算出待测化合物对OE19细胞的半抑制浓度(IC50)。
试验结果如表2
表2:本发明化合物体外细胞增殖抑制活性筛选试验结果
ND:未测试;b:测试2次的平均值;d:化合物起始稀释浓度为10μM
结论:本发明化合物对NCI-N87,BT-474,OE21和OE19细胞增殖抑制活性明显。
实验例3人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:
实验目的:研究待测化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤在 BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估
实验动物:雌性BALB/c裸小鼠,6-8周龄,体重18-22克;供应商:上海西普尔-必凯实验动物有限公司
实验方法与步骤:
3.1细胞培养
人胃癌NCI-N87细胞体外单层培养,培养条件为RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺, 37℃5%CO2培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80%-90%时,收取细胞,计数,接种。
3.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)
将0.2mL(10×106个)NCI-N87细胞皮下接种于每只裸小鼠的右后背 (PBS+Matrigel,1:1)。肿瘤平均体积达到145mm3时开始分组给药。
3.3受试物的配制:
受试化合物配制成0.3mg/mL的澄清溶液,溶媒为10%NMP(N-甲基吡咯烷酮)+10%乙二醇硬脂酸酯+80%水
3.4肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为:V=0.5a×b2,a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(%)或相对肿瘤增殖率T/C(%)评价。TGI(%),反映肿瘤生长抑制率。TGI(%)的计算:TGI(%)=【1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×对照组。
相对肿瘤增殖率T/C(%):计算公式如下:T/C%=TRTV/CRTV组开始治疗时平(TRTV:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV),计算公式为 RTV=Vt/V0,其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积,Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积,TRTV与CRTV取同一天数据。
在实验结束后将检测肿瘤重量,并计算T/C重量百分比,T重量和C重量分别表示给药组和溶媒对照组的瘤重。
3.5统计分析
统计分析,包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误 (SEM)。治疗组在试验结束时给药后第21天表现出最好的治疗效果,因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析,三组或多组间比较用one-way ANOVA进行分析,如果F值有显著性差异,应用Games-Howell法进行检验。如果F值无显著性差异,应用Dunnet(2-sided) 法进行分析。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
3.6试验结果
实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型中所有给药组(除Poziotinib组)均未显示有显著性体重下降,Poziotinib组给药后第 7天2只小鼠体重下降超过20%,3只体重下降超过15%,1只体重下降超过10%,给药后第8天2只小鼠安乐死,剩余小鼠降低给药剂量后逐渐恢复,无发病或死亡现象。药效结果如表3所示。
3.7试验结论和讨论
与溶媒组相比,对照组Poziotinib和本发明实施例1,实施例7和实施例8都展现了优异的抑制肿瘤生长的效果,TGI分别为115.6%,103.98%, 92.63%和119.71%。且本本发明中实施例1,实施例7和实施例8对模型动物体重指标的安全性显著优于对照化合物Poziotinib。
表3.本发明化合物对人胃癌NCI-N87异种移植瘤模型的抑瘤药效评价 (基于给药后第21天肿瘤体积计算得出)
注:
“--”不需计算
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI(TGI(%)=[1-(T21-T0)/(V21-V0)]×100)计算。
c.p值根据肿瘤体积。
实验例4人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:
实验目的:研究本专利待测化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤在BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估
实验动物:雌性BALB/c裸小鼠,6-8周龄,体重18-22克;供应商:上海灵畅生物科技有限公司提供
实验方法与步骤:
4.1细胞培养
人胃癌NCI-N87细胞,体外单层培养,培养条件为RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL0链霉素和2mM谷氨酰胺,37℃,5%CO2培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80%-90%时,收取细胞,计数,接种。
4.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)
将0.2ml(10×106)NCI-N87细胞(PBS+Matrigel,1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背,肿瘤平均体积达到158mm3时开始分组给药
4.3受试物的配制:
受试化合物配制成0.04mg/mL和0.08mg/mL的澄清溶液,溶媒为 10%NMP(N-甲基吡咯烷酮)+10%乙二醇硬脂酸酯+80%水
4.4肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为:V=0.5a×b2,a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(%)或肿瘤增殖率T/C(%)评价。TGI(%),反映肿瘤生长抑制率。TGI(%)的计算:TGI(%)=[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100%。
肿瘤增殖率T/C(%):计算公式如下:T/C(%)=某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100%。
4.5统计分析
统计分析,包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误 (SEM)(具体数据见表5-1)。治疗组在试验结束时给药后第28天表现出最好的治疗效果,因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析,三组或多组间比较用one-way ANOVA进行分析,经检验,F值有显著性差异,应用Games-Howell法进行检验。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
4.6试验结果
4.6.1死亡率、发病率及体重变化情况
实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型治疗组小鼠体重有下降趋势,无其他发病或死亡现象。
4.6.2抗肿瘤药效评价指标
表4本发明化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤药效评价
(基于给药后第28天肿瘤体积计算得出)
注:
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI(TGI(%)=[1-(T28-T0)/(V28-V0)]×100) 计算。
c.p值根据肿瘤体积计算。
4.7试验结论和讨论
在本实验评价了本专利化合物在人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型中的体内药效。与溶剂对照组相比,治疗组实施例38@0.8mg/kg与参照化合物Poziotinib@0.8mg/kg药效相当,都展现了显著的抑瘤作用;低剂量组实施例38与参照化合物Poziotinib药效相当或者更优。
实验例5人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:
实验目的:研究本专利待测化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤在BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估
实验动物:雌性BALB/c裸小鼠,6-8周龄,体重18-22克;供应商:上海西普尔-必凯实验动物有限公司
实验方法与步骤:
5.1细胞培养
人胃癌NCI-N87细胞,体外单层培养,培养条件为RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,37℃,5%CO2培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为 80%-90%时,收取细胞,计数,接种。
5.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)
将0.2ml(10×106)NCI-N87细胞(PBS+Matrigel,1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背,肿瘤平均体积达到156mm3时开始分组给药
5.3受试物的配制:
受试化合物配制成0.05mg/mL的澄清溶液,溶媒为10%NMP(N-甲基吡咯烷酮)+10%乙二醇硬脂酸酯+80%水
5.4肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为:V=0.5a×b2,a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(%)或肿瘤增殖率T/C(%)评价。TGI(%),反映肿瘤生长抑制率。TGI(%)的计算:TGI(%)=[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100%。
肿瘤增殖率T/C(%):计算公式如下:T/C(%)=某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100%。
5.5统计分析
统计分析,包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误 (SEM)(具体数据见表5-1)。治疗组在试验结束时给药后第28天表现出最好的治疗效果,因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析,三组或多组间比较用one-way ANOVA进行分析,经检验,F值有显著性差异,应用Games-Howell法进行检验。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
5.6试验结果
5.6.1死亡率、发病率及体重变化情况
实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型治疗组小鼠体重有下降趋势,无其他发病或死亡现象。
5.6.2抗肿瘤药效评价指标
表5本专利化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤药效评价
(基于给药后第21天肿瘤体积计算得出)
注:
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI(TGI(%)=[1-(T21-T0)/(V21-V0)]×100) 计算。
c.p值根据肿瘤体积计算。
4.7试验结论和讨论
在本实验评价了本发明化合物和对照化合物2在人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型中的体内药效。与溶剂对照组相比,治疗组实施例 38@0.5mg/kg展现了显著的抑瘤作用,抑瘤率为T/C=10.69%,TGI=119.41%, p=0.007;同剂量下对照化合物2药效不明显T/C=89.35%,TGI=18.83%;本发明化合物药效显著优于对照化合物2。
实验例6人食管癌OE21细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:
实验目的:研究待测化合物对人食管癌OE21细胞皮下异种移植肿瘤 BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估。
实验动物:雌性BALB/c裸小鼠,6-8周龄,体重17-23克;供应商:上海西普尔-必凯实验动物有限公司
实验方法与步骤:
6.1细胞培养
人食管癌OE21细胞体外单层培养,培养条件为RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL0链霉素和2mM谷氨酰胺, 37℃5%CO2培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80%-90%时,收取细胞,计数,接种。
6.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)
将0.1ml(20.1)OE21细胞(PBS)皮下接种于每只小鼠的右后背,肿瘤平均体积达到112mm3时开始分组给药。
6.3受试物的配制:
受试化合物配制成0.15mg/mL~0.3mg/mL的澄清或混悬液溶液,溶媒为 10%NMP+10%乙二醇硬脂酸酯+80%水
6.4肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为:V=0.5a×b2,a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(%)或相对肿瘤增殖率T/C(%)评价。TGI(%),反映肿瘤生长抑制率。TGI(%)的计算:TGI(%)=[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100%。
相对肿瘤增殖率T/C(%):计算公式如下:T/C(%)=某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100%。
6.5统计分析
统计分析,包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误 (SEM)。三组或多组间比较用one-way ANOVA。如果F值有显著性差异,应在ANOVA分析之后再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p <0.05认为有显著性差异。
6.6试验结果
6.6.1死亡率、发病率及体重变化情况
在此模型中Poziotinib@2/1.5mg/kg、实施例8/实施例38@2/0.5mg/kg 和实施例38@2/1.5mg/kg给药组的动物均显示有不同程度的体重下降和出现皮屑的现象;Poziotinib@2/1.5mg/kg在分组给药后第6天和第7天开始依次有1只和3只小鼠体重下降超过15%,作停药处理,且有整组小鼠尿液深黄色的毒性提示;给药第3天开始测试组实施例8@2mg/kg组替换成实施例 38@0.5mg/kg,Poziotinib@2mg/kg降低剂量到1.5mg/kg,实施例38@2mg/kg 降低剂量到1.5mg/kg。剂量调整后,各组体重明显恢复(图1)。
6.6.2抗肿瘤药效评价指标
表6本发明化合物对OE21异种移植瘤模型的抑瘤药效评价 (基于给药后第21天肿瘤体积计算得出)
注:
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI,计算,参考实验例4。
c.p值根据给药后第21天的肿瘤体积计算,采用One-Way ANOVA 的统计方法,分别和Vehicle组比较得出。
6.7试验结论和讨论
在本实验评价了本发明化合物和参照化合物Poziotinib对OE21异种移植瘤模型中的体内药效。开始给药21天后,溶剂对照组荷瘤鼠的瘤体积达到948mm3,受试物Poziotinib@2/1.5mg/kg、实施例8/实施例38@2/0.5mg/kg 和实施例38@2/1.5mg/kg组与溶剂对照组比较有显著的抑瘤作用,抑瘤率分别为Poziotinib@2/1.5mg/kg组:T/C=6.05%,TGI=106.65%,p=0.008;实施例8/实施例38@2/0.5mg/kg组:T/C=5.89%,TGI=106.87%,p=0.008;实施例38@2/1.5mg/kg组:T/C=5.82%,TGI=106.65%,p=0.008。实施例38低剂量0.5mpk药效与参照化合物Poziotnib和实施例38高剂量1.5mpk药效相当。
实施例38抑瘤效果显著,药效与参考化合物Poziotinib相当,但是参考化合物高剂量组小鼠体重下降显著,3只小鼠体重下降超过15%,予以停药,并且全组有小鼠尿液深黄色毒性提示。实施例38对小鼠体重影响小,无停药,无尿液深黄色毒性提示,耐受性显著优于参考化合物。实施例38起效剂量更低,耐受性更好,安全窗口更优于参考化合物Poziotinib。
实验例7小鼠药代动力学研究试验
实验目的:本实验旨在考察本专利实施例与参照化合物单次静脉注射和灌胃给药后雌性BALB/c小鼠体内血浆药代动力学。
实验动物:雌性BALB/c裸小鼠,7-9周龄,体重17-23克;供应商:上海西普尔-必凯实验动物有限公司
样品采集:实验动物每个时间点从隐静脉穿刺采集血液样本0.03mL,记录实际采血时间。所有血样均加入规格为1.5mL的商品化EDTA-K2抗凝管中(供应商为江苏康健医疗用品有限公司)。血样采集后,在半小时内,于4℃、3000g离心10分钟吸取上清血浆,迅速至于干冰中,于-80℃冰箱保存,用于LC-MS/MS分析。
数据分析:采用WinNonlinTMVersion6.3(Pharsight,MountainView,CA)药动学软件的非房室模型处理血浆浓度,使用线性对数梯形法方法计算药动学参数Cmax,Tmax,T1/2,AUC0-last
表7本发明化合物与参考化合物PK结果对比
Cmax:达峰浓度;Tmax:达峰时间;T1/2:清除一半化合物所需时长; AUC0-last:0-末次取样时间内的浓度积分面积。
在小鼠药代动力学研究结果显示,本发明化合物半衰期比参考化合物更长,口服血浆暴露量显著优于参照化合物Poziotinib和对照化合物2。
实验例8CYP酶抑制活性评价
本发明化合物和参考化合物Poziotinib在人肝微粒体中CYP酶活性测试结果如下表所示(表8)
表8本发明化合物与参考化合物CYP酶抑制结果对比
本发明化合物在人肝微粒体CYP抑制活性结果显示,实施例38和 Poziotinib对CYP1A2和CYP3A4无抑制活性。实施例38对CYP2C19抑制活性与参考化合物Poziotinib相当,对CYP2C9和CYP2D6的活性有改善,分别优于参考化合物2倍和6倍。综合比较,实施例38对CYP活性有改善并优于参考化合物,因此药物-药物相互作用风险更低。