CN111607528A - 大杯侧耳菌株Pg-w01及其应用 - Google Patents

大杯侧耳菌株Pg-w01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及大杯侧耳菌株Pg‑w01及其应用。本发明的大杯侧耳菌株Pg‑w01保藏编号为CGMCC NO.19641，为母本变异株，与母本相比具有巨大的外形差异，是一种新的大杯侧耳种质资源，该菌株的发掘解决了白色大杯侧耳资源短缺的问题，可作为重要的亲本从而培育更多性状优良、颜色丰富的大杯侧耳菌株；与母本相比该菌株的菌盖、菌柄蛋白质、氨基酸等营养相当，而菌盖、菌柄的半纤维素、粗纤维、纤维素的含量更低、肉质更细嫩、口感更好，菌盖肉质更肥厚，硬度更高、更耐储藏，该菌株整体商品性均优于母本。

Description

大杯侧耳菌株Pg-w01及其应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及大杯侧耳菌株Pg-w01及其应用。
【背景技术】
大杯侧耳又名大杯蕈、大杯伞、猪肚菇、大杯香菇、巨大香菇、巨大韧伞、大斗菇等，由于其具有一些与其他同属种类不一样的特征结构，所以在分类地位存上存在一定争议，目前分类地位属于侧耳科(Pleurotaceae)侧耳属(Pleurotus)大杯侧耳种(Pleurotusgiganteus),但在我国使用的分类异名还有Lentinus giganteus(巨大香菇)和巨大革耳Panus giganteus两个拉丁文名。大杯侧耳是国内近年来新开发的一种珍稀食用菌，其口感风味独特，营养丰富，蛋白质含量与香菇、金针菇相当，菌盖氨基酸含量为干物质的16.5％以上，其中必需氨基酸占氨基酸总量的45％，比一般食用菌高，亮氨酸和异亮氨酸含量也冠于一般食用菌之首。大杯侧耳不仅味道鲜美，营养丰富，同时具有适用原料广泛、耐高温、耐储运等优点，因此深受广大菇农和消费者的喜爱。大杯侧耳属于中高温型食用菌，适宜广西夏秋季栽培出菇上市，其推广栽培对于调节市场、解决生产淡季食用菌鲜品供应具有重要意义。
目前，栽培的大杯侧耳品种中一般为灰黑色或灰棕色，颜色单一，未发现有白色的大杯侧耳品种。而且，目前的大杯侧耳品种，菌柄表层木质化程度高，纤维多，可食用性差，因此在销售时，经常只销售菌盖，菌柄丢弃不销售，大大降低了产品商品性产量，同时大杯侧耳菌盖伞状或杯状或漏斗状，杯状子实体菌盖边缘薄且脆、硬度低，储运过程中容易碎。
针对上述缺陷，为了加强对大杯侧耳种质资源的利用，开发出更多更优异的种质资源，有必要对大杯侧耳种质资源进行不断优化培育出更具商品性的大杯侧耳品种。
【发明内容】
鉴于上述开发更高商品性的大杯侧耳，本发明的目的在于提供一种大杯侧耳菌株Pg-w01及改善其菇型、颜色和口感，增加在食品上的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一种大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01，其保藏编号为CGMCC NO.19641。属于食用菌，属于大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)种。所述大杯侧耳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19641，保藏日期为2020年05月12日。
所述菌株为灰棕色大杯侧耳菌株出菇棚中获得的白色变异株，该灰棕色大杯侧耳是申请人从广西大学采购而得的，将其命名为农大大杯侧耳。
进一步的，所述菌株纤维含量低，口感好，菌盖肉质肥厚，耐贮藏。
本发明还包括一种选育如所述的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01的方法，该方法包括如下步骤：
(1)在灰棕色大杯侧耳菌株栽培出菇时中选取白色变异子实体，组织分离后获得白色变异株；
(2)将步骤(1)的白色变异株进行扩繁及栽培出菇，选取颜色为白色、菇型美观的子实体用于收集孢子，进行单孢分离，获得单孢分离菌株；
(3)将步骤(2)的单孢分离菌株进行一对一自交，获得自交后代群体，分别栽培出菇，选取子实体白色、菇型美观、出菇整齐、性状一致的自交后代，再次进行组织分离和栽培出菇，选取经多次栽培子实体性状稳定的自交后代，即为目标菌株Pg-w01。
进一步的，所述菌株做为亲本进行杂交育种。
本发明还包括一种大杯侧耳孢子，该孢子是通过培养所述菌株得到的孢子。
本发明还包括一种大杯侧耳菌丝体，该菌丝体是通过培养所述菌株得到的菌丝体。
本发明还包括一种大杯侧耳子实体，该子实体是通过培养所述菌株得到的子实体。
本发明还包括一种栽培所述菌丝体的方法，将菌丝体放入出菇料中进行栽培，所述出菇料由如下重量百分数的成分组成：棉籽壳20％，桑枝30％，木屑29％，麦麸20％，石灰1％。
本发明还包括一种所述子实体在食品加工中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本申请的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01是一株新的大杯侧耳菌株，与母本相比具有巨大的外形差异，其子实体颜色白色、菇盖半球形、外形美观，该菌株的发掘解决了白色大杯侧耳资源短缺的问题，能提供的白色菌株可以作为重要的亲本从而培育更多性状优良、颜色丰富的大杯侧耳菌株；该菌株与母本灰棕色菌株农大大杯侧耳菌盖、菌柄蛋白质、氨基酸等营养相当，但大杯侧耳Pg-w01菌盖、菌柄的半纤维素、粗纤维、纤维素的含量均比农大大杯侧耳的低，说明大杯侧耳Pg-w01的肉质更细嫩，口感更好。本发明选育的白色大杯侧耳菌盖白色或灰白色，菌盖硬度比农大大杯侧耳硬度高，更结实，并且比传统菌株储藏效果更好，且子实体菌盖呈半球形或平展，包装不容易破碎，耐储运输。白色菌株菌柄短，菌盖肉质肥厚，菌盖与菌柄重量比为3.02，比母本农大大杯侧耳菌盖与菌柄重量比高，可销售部分子实体产量高。
【附图说明】
图1为本发明Pg-w01菌株和母本在PDA培养基上的拮抗鉴定正面图；
图2为本发明Pg-w01菌株和母本在PDA培养基上的拮抗鉴定背面图；
图3为本发明Pg-w01的子实体外观图；
图4为本发明Pg-w01与母本农大大杯侧耳的菌体剖面对比图；图中A为母本：农大大杯侧耳；B大杯侧耳菌株Pg-w01；
图5为本发明Pg-w01与母本农大大杯侧耳的子实体外观对比图；图中A为母本：农大大杯侧耳；B为大杯侧耳菌株Pg-w01；
图6为本发明Pg-w01与母本农大大杯侧耳的子实体外观俯视对比图；图中A为母本：农大大杯侧耳；B大杯侧耳菌株Pg-w01；
图7为本发明Pg-w01与母本农大大杯侧耳的菌褶对比图；图中A为母本：农大大杯侧耳；B大杯侧耳菌株Pg-w01；
图8为本发明实施例的7株大杯侧耳ISSR聚类分析图。
【具体实施方式】
下面结合附图、实施例和试验对本发明作进一步说明。
本申请所述的母本灰棕色大杯侧耳菌株是从广西大学采购而得，下述称该品种为农大大杯侧耳。
实施例1：
本实施例筛选出了一种大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01，其保藏编号为CGMCC NO.19641。属于食用菌，属于大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)种。所述大杯侧耳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19641，保藏日期为2020年05月12日。
上述大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01的母本为灰棕色大杯侧耳菌株农大大杯侧耳，其具体选育方法如下：
(1)白色变异株的获取与分离
在农大大杯侧耳菌株栽培出菇时，选取白色变异子实体，组织分离后获得白色变异株。
(2)白色变异株单孢分离
按常规方法栽培白色变异株(出菇培养料由如下重量百分数的成分组成：棉籽壳20％，桑枝30％，木屑29％，麦麸20％，石灰1％)，出菇后选取颜色为白色、菇型美观的子实体收集担孢子，并采用稀释涂板法进行单孢分离，获得单孢分离菌株。
(3)优良自交菌株筛选
将所获得的单孢分离菌株进行一对一自交试验，通过亲和现象观察和显微镜镜检，选择分离具有锁状联合的菌丝体为自交后代，通过此方法获得300个自交后代。对获得的自交后代群体按常规方法分别栽培出菇，选取子实体白色、菇型美观、出菇整齐、性状一致的自交后代，再次进行组织分离和栽培出菇，选取经多次栽培子实体性状稳定的自交后代，即为目标菌株Pg-w01。
实施例2：
本实施例为对实施例1筛选出来的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01进行形态学和分子生物学鉴定，主要是与母本(即实施例1的母本菌株：农大大杯侧耳)进行比对：
(1)形态学鉴定：
①拮抗鉴定试验
将实施例1步骤(3)获得的新菌株大杯侧耳Pg-w01与农大大杯侧耳进行拮抗鉴定试验：
将农大大杯侧耳、大杯侧耳Pg-w01菌株分别复壮8天后，用接种铲各接0.5cm2的菌块到同一PDA培养基平皿上，两接种菌块距离约2cm，30℃下培养10～12d，观察两菌落对峙培养情况。
结果如图1-2可见，在PDA培养基的正面和背面两菌株对峙培养菌落交界处之间均有明显拮抗线，说明两菌株不属于同一菌株，大杯侧耳Pg-w01是农大大杯侧耳的变异菌株有明显的拮抗线。
②子实体性状比较鉴定试验：
按食用菌常规生产方法进行菌棒制作，根据栽培出菇培养料(由如下重量百分数的成分组成：棉籽壳20％，桑枝30％，木屑29％，麦麸20％，石灰1％)配方称取各原料并混合均匀，并调节原料水分为65％、pH＝6.0，用15cm×30cm×0.05cm聚丙烯袋装袋，菌棒于0.14Mpa、126℃高压灭菌2.5小时。
菌棒培养基灭菌后冷却至30℃以下即可接种。接种后菌棒放置培养室内培养，培养条件要求相对湿度65％以下，通风良好，室内温度26～30℃，黑暗或有较弱的散射光。菌棒菌丝培养45～50d，菌棒袋口附近有少量菇蕾时，进行袋内覆土出菇，出菇环境条件要求空气相对湿度85～90％，温度25～32℃，喷水必须结合通风，使空气新鲜，子实体八成熟，边缘内卷、孢于未弹射时及时采收。
子实体农艺性状比较：观察对比两菌株成熟期子实体形态及颜色。第1潮菇采收时，每个菌株采集成熟度一致的子实体20～30朵鲜菇，进行子实体性状观察测定。子实体厚度：用游标卡尺测量菌盖中心厚度；子实体菌盖大小：用游标卡尺“十”字形测量菌盖直径；菌柄直径：测量菌柄中部直径；菌柄长度：测量菌褶与菌柄交界处至菌柄基部的距离。子实体菌盖菌柄颜色用色差仪进行测量，选取从菌盖顶部至盖边缘的中间部位的随机5个点，测量的L表示颜色的深浅程度，L值越大说明子实体颜色越白。用硬度计测量子实体菌盖边缘1～2cm处耐挤压程度。分别测量菌盖、菌柄重量，计算盖柄质量比。所有数据计算并使用平均值。
具体性状参见表1：
表1 Pg-w01与农大大杯侧耳的形态特征比较对照表
Figure BDA0002557013820000051
Figure BDA0002557013820000061
具体形态特征可参见图4-7，图中A为农大大杯侧耳(母本)，B为Pg-w01：图4是Pg-w01与农大大杯侧耳的剖面对比图，由图可见，农大大杯侧耳的菌柄长度长于Pg-w01，菌盖厚度小于Pg-w01；图5和图6均是Pg-w01与农大大杯侧耳的外观对比俯视图，两图中明显可见农大大杯侧耳子实体菌盖为灰色或灰棕色而Pg-w01子实体的成熟菌盖为白色或灰白色，农大大杯侧耳子实体菌盖直径大于Pg-w01子实体菌盖直径；农大大杯侧耳子实体菌盖呈漏斗形，表面光滑，有少量鳞片，而Pg-w01子实体菌盖呈半球形或平展，并有肉质瘤状突起；图7为Pg-w01与农大大杯侧耳菌褶对比图，图中明显可见农大大杯侧耳的菌褶随柄下延长，不等长，无分叉；而菌株Pg-w01菌盖的菌褶随柄下延长，不等长，分叉。
经过上述形态学鉴定，观察子实体形态特征，白色菌株Pg-w01与灰棕色菌株(母本)子实体形态特征完全不相同，特别是颜色差异较大，说明白色菌株为该灰棕色菌株的变异菌株，是一种新的食用菌菌株。
(2)分子生物学鉴定
为研究菌株Pg-w01与其他大杯侧耳菌株的差异，采用ISSR分析法对菌株Pg-w01进行分析，具体方法如下：
①提取7个大杯侧耳菌株(如表2所示)的基因组DNA并检测，具体方法为：将供试菌株的菌丝块分别接种到PDA培养基的平皿上，于30℃培养10d～12d，用解剖刀刮取菌丝。使用DNA提取试剂盒对收集的菌丝进行DNA提取，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，质量合格的DNA储藏于-20℃冰箱备用。
②采用如表3所示的ISSR引物(如序列表SEQ ID NO.1～9所示)进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应体系为：(25μL)：2×Es TaqMasterMix(Dye)12μL，ddH2O 11μL，引物(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃终延伸10min，4℃保存10min。
③步骤②反应结束后，用ISSR图谱用扫描仪扫描并进行ISSR扩增片段统计，有ISSR带谱记为1，无ISSR带谱记为0，用聚类分析软件NTSYS-PC 2.10计算遗传相关系数，进行聚类分析，得出聚类图谱如图8所示。
表2 ISSR真实性分析的供试菌株
Figure BDA0002557013820000071
表3 ISSR引物序列
引物序号 原始引物编号 引物序列
1 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC
2 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG
3 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC
4 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC
5 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG
6 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC
7 850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC
8 866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC
9 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC
图8是上述ISSR聚类分析的结果图，从图中可看出，新菌株Pg-w01与其他菌株亲缘关系较远，与原始菌株农大大杯侧耳关系较近；从外形上其与农大大杯侧耳差别很大，说明新菌株Pg-w01是农大大杯侧耳的变异菌株。
实施例3：
新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳的内含物质差别分析：
在同一条件下进行新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳的栽培出菇，出菇后采集同一批次成熟度一致的子实体依据营养成分的有关检测标准，进行营养检测分析，具体分析结果参见表4：
表4新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳营养成分比较
Figure BDA0002557013820000081
由表4可知，经检测分析，新菌株Pg-w01的菌盖、菌柄的半纤维素、粗纤维、纤维素的含量均比母本农大大杯侧耳的低，说明新菌株Pg-w01的肉质更细嫩，口感更好。
申请人还针对新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳进行了口感评价，具体如下：
选取新鲜的Pg-w01和母本农大大杯侧耳的子实体进行清炒，室温冷却，随机抽取50人就Pg-w01和母本农大大杯侧耳的香味、鲜味、嫩滑度和脆性进行测试，参与调查的每人填写尝味评分表，评分标准见表5
表5评分标准
Figure BDA0002557013820000082
Figure BDA0002557013820000091
根据上表的评分标准，进行评价，统计得到的平均分见表6：
表6得分表
评价项目 Pg-w01 农大大杯侧耳(母本)
香味 4.2 3.9
鲜味 4.6 4.3
嫩滑度 4.8 3.9
脆性 4.1 4.5
由表6可知，新菌株Pg-w01的香味、鲜味略高与农大大杯侧耳(母本)，嫩滑度远高于农大大杯侧耳(母本)，由此见新菌株Pg-w01的口感优于母本，主要体现在比农大大杯侧耳更嫩滑。
实施例4：
对新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳采收后，利用PE保鲜袋包装后在4℃下贮藏，测定其不同保藏天数硬度变化，变化情况如表7所示：
表7新菌株Pg-w01与母本农大大杯侧耳贮藏硬度变化表
Figure BDA0002557013820000092
由表7可知，在贮藏12天后，新菌株Pg-w01、母本农大大杯侧耳的菌盖硬度都有所下降，但新菌株Pg-w01的硬度下降慢；贮藏12天后，新菌株Pg-w01硬度比其初始硬度降47.56％，母本农大大杯侧耳的硬度比初始硬度降低了59.77％，新菌株Pg-w01的硬度是母本农大大杯侧耳的2.46倍，因此说明新菌株Pg-w01比母本农大大杯侧耳更耐贮藏。
实施例5：
从实施例3、4的营养成分分析和贮藏的硬度变化效果来看，新菌株Pg-w01用来制备食品将能获得更优的商业价值，因为其具有营养价值高、口感好，更耐贮藏的优势。
实施例6：
鉴于目前白色大杯侧耳资源短缺的问题，本申请的大杯侧耳菌株Pg-w01可做为亲本与其它亲本的大杯侧耳菌株进行杂交，以获得颜色更丰富的大杯侧耳种种质资源。
综上所述，本申请的大杯侧耳菌株Pg-w01属于新菌株，该菌株从原始种(母本)：农大大杯侧耳中变异而得，与母本相比，该变异株与母本有巨大的外观差别，其营养价值含量高，肉质更细嫩、口感更好，肉质肥厚、硬度更高、更耐贮运，整体商品性均优于母本。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01，保藏编号为CGMCC NO.19641。
2.根据权利要求1所述的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01，其特征在于，所述菌株的母本为灰棕色大杯侧耳菌株。
3.根据权利要求1所述的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01，其特征在于，所述菌株纤维含量低，口感好，菌肉肥厚，耐贮藏。
4.一种选育如权利要求1-3任意一项所述的大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在灰棕色大杯侧耳菌株栽培出菇时中选取白色变异子实体，组织分离后获得白色变异株；
(2)将步骤(1)的白色变异株进行扩繁及栽培出菇，选取颜色为白色、菇型美观的子实体用于收集孢子，进行单孢分离，获得单孢分离菌株；
(3)将步骤(2)的单孢分离菌株进行一对一自交，获得自交后代群体，分别栽培出菇，选取子实体白色、菇型美观、出菇整齐、性状一致的自交后代，再次进行组织分离和栽培出菇，选取经多次栽培子实体性状稳定的自交后代，即为目标菌株Pg-w01。
5.一种权利要求1所述大杯侧耳(Pleurotus giganteus.)菌株Pg-w01的应用，其特征在于，所述菌株做为亲本进行杂交育种。
6.一种大杯侧耳孢子，其特征在于，通过培养如权利要求1所述菌株得到的孢子。
7.一种大杯侧耳菌丝体，其特征在于，通过培养如权利要求1所述菌株得到的菌丝体。
8.一种大杯侧耳子实体，其特征在于，通过培养如权利要求1所述菌株得到的子实体。
9.一种培养权利要求7所述菌丝体的方法，其特征在于，所述方法为将菌丝体放入培养料中进行培养，所述培养料由如下重量百分数的成分组成：棉籽壳20％，桑枝30％，木屑29％，麦麸20％，石灰1％。
10.一种权利要求8所述子实体在食品加工中的应用。
CN202010594715.XA 2020-06-28 2020-06-28 大杯侧耳菌株Pg-w01及其应用 Active CN111607528B (zh)

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