CN111603538B

CN111603538B - 金线莲提取物的应用

Info

Publication number: CN111603538B
Application number: CN202010614402.6A
Authority: CN
Inventors: 易立涛; 刘青
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111603538A

Abstract

本发明提供了金线莲提取物的应用。本发明提供了金线莲提取物在缓解化疗所致周围神经病变的药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的应用。该金线莲提取物可用于缓解化疗引起的周围神经病变（CIPN），因此其可作为制备药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的有效成分，用于CIPN的防治。本发明还提供了一种金线莲提取物的制备方法，其步骤包括：对金线莲进行水提取、浓缩，所得的浓缩液经过醇沉和离心分离可得到沉淀物，该沉淀物在水中溶解，溶解物经除蛋白和离心，可得到金线莲提取物。该金线莲提取物的制备方法操作简单且过程易于控制。

Description

金线莲提取物的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，且特别涉及金线莲提取物的应用。

背景技术

化疗引起的周围神经病变（CIPN）是癌症治疗中最普遍的副作用之一。在接受化疗的患者中，CIPN的总发生率范围为30％至80％，具体发生率大小取决于所采用的化疗方案和治疗持续时间。CIPN的症状包括疼痛、麻木、刺痛和温度敏感性。CIPN的出现会限制化疗的剂量，延迟额外的治疗周期，甚至导致治疗的早期终止。此外，CIPN在化疗完成后经常持续存在甚至恶化，从而大大降低了癌症幸存者的生活质量。

但是目前，CIPN在癌症患者中持续存在的机制仍然未知，且尚无有效的药物来预防和治疗CIPN。CIPN的高患病率和发病率，加上缺乏有效的治疗手段，使得该病严重影响了癌症患者的生活。若能成功寻找和筛选缓解CIPN症状的药物，将对改善癌症患者和幸存者的生活质量起到至关重要的作用。

金线莲又名金线兰、金石松等，为兰科开唇兰属植物，是我国名贵中药材。《中国植物志》记载金线莲具有清热凉血、祛风利湿等功效。近年来的研究发现，金线莲多糖具有良好的体外抗氧化、免疫调节、降血糖及抗肿瘤作用。然而，未见金线莲多糖在治疗CIPN方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供金线莲提取物在制备缓解化疗所致周围神经病变的药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种金线莲提取物的制备方法，此提取方法操作简单，且提取过程易于控制。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了金线莲提取物在制备缓解化疗所致周围神经病变的药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的应用。

本发明还提供了一种金线莲提取物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将金线莲切碎，以水为提取剂对所述金线莲进行提取，得到提取液；

S2、所述提取液经浓缩，得到浓缩液；

S3、在所述浓缩液中加入无水乙醇进行沉淀，静置过夜，然后经离心分离后得到沉淀物；

S4、将所述沉淀物溶解在55～65℃的水中，得到溶解物，对所述溶解物进行除蛋白后，加入无水乙醇，静置过夜，最后经离心分离后得到所述金线莲提取物。

本发明实施例的金线莲提取物的制备方法及其应用的有益效果是：

本发明金线莲提取物的制备方法操作简单且过程易于控制，该制备方法提取出的金线莲提取物可用于缓解化疗引起的周围神经病变。本发明通过建立化疗小鼠模型，发现金线莲提取物可以缓解化疗小鼠胫神经线粒体功能，缓解小鼠机械性异常性疼痛，改善感觉功能的丧失，表明金线莲提取物在缓解CIPN方面的潜在应用。因此该金线莲提取物可作为制备药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的有效成分，用于CIPN的防治。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明试验例1提供的小鼠Von Frey实验的结果统计柱状图；

图2为本发明试验例1提供的小鼠粘附物移除实验的结果统计柱状图；

图3为本发明试验例1提供的小鼠DRG线粒体膜电位的结果统计柱状图；

图4为本发明试验例1提供的小鼠DRG线粒体呼吸功能的结果统计柱状图；

图5为本发明实施例的金线莲提取物的制备流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的金线莲提取物的应用及其提取方法进行具体说明。

本发明的实施例提供了金线莲提取物在缓解化疗所致周围神经病变的药品、保健品、功能性食品或食品添加剂中的应用。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述药品、所述保健品和所述功能性食品分别以所述金线莲提取物为活性成分，配以药学、保健品和食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述辅料为载体、赋形剂或稀释剂。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述药品为口服制剂，所述口服制剂为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或缓释剂中的一种。

本发明另一实施例提供了一种金线莲提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将金线莲切碎，以水为提取剂对所述金线莲进行提取，得到提取液。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述水与所述金线莲的质量比为20:1～1，提取次数为1～3次，其中，每次的提取过程为：所述金线莲在所述水中浸泡0.5～1.5小时，加热回流0.5～1.5小时。本发明中使用的金线莲可购自福州佳乐达生物工程有限公司。

S2、所述提取液经浓缩，得到浓缩液。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述提取液与所述浓缩液的体积比为15:1～1。

S3、在所述浓缩液中加入无水乙醇进行沉淀，静置过夜，然后经离心分离后得到沉淀物。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述无水乙醇与所述浓缩液的体积比为4:1～1，静置温度为3～5℃，离心时，离心机的分离因素为2500g～3500g，离心时间为5～15分钟。

S4、将所述沉淀物溶解在55～65℃的水中，得到溶解物，对所述溶解物进行除蛋白后，加入无水乙醇，静置过夜，最后经离心分离后得到金线莲提取物。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述溶解物采用sevag法除蛋白；所述溶解物与所述无水乙醇的体积比为4:1～1，静置温度为3～5℃；离心时，离心机的分离因素为2500～3500g，离心时间为5～15分钟。离心时，可采用H2500R系列高速冷冻离心机。

Sevag法是去除游离蛋白的有效方法，Sevage试剂为氯仿和正丁醇按5:1的体积比混合而成。sevag法除蛋白是利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂按体积比为5：1进行混合、振荡，使得游离蛋白变性成为不溶性物质。变性后的蛋白质介于提取液与 Sevage 试剂交界处，经离心分离可达到去除的目的。此法条件温和，而且不会引起多糖的变性。

实施例1

本实施例提供了一种金线莲提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将金线莲切碎，并以水为提取剂对金线莲进行提取，其中，水与金线莲的质量比为20：1。提取过程为：将金线莲在水中浸泡1小时，加热回流1小时，过滤得到滤液A和滤渣A。在滤渣A中加入质量为20倍的水浸泡1h，加热回流1h，过滤得到滤液B和滤渣B。合并滤液A和滤液B得到提取液。

S2、将提取液蒸发浓缩至提取液体积的1/15，得到浓缩液。

S3、在浓缩液中加入无水乙醇进行沉淀，在4℃下静置过夜，然后经离心分离后得到沉淀物，其中无水乙醇与浓缩液的体积比为4:1。离心时，离心机的分离因素为3000g，离心时间为10分钟。

S4、将沉淀物溶解在55～65℃的水中，得到溶解物。所述溶解物采用sevag法除蛋白后，加入无水乙醇，在4℃下静置过夜，最后经离心分离后得到金线莲提取物。其中，溶解物与无水乙醇的体积比为4:1；离心时，离心机的分离因素为3000g，离心时间为10分钟。离心时，可采用H2500R系列高速冷冻离心机。

实施例2

本实施例提供了一种用于缓解化疗所致的周围神经病变的口服片：

以实施例1制得的金线莲提取物为有效成分，通过常规制备工艺，在该金线莲提取物中加入食品生产的常规辅料，制备成口服片。每片口服片中含金线莲提取物0.5g。

该口服片的服用方法为：每日早中晚各服食一片。

试验例1

根据实施例1制备的金线莲提取物的药效学实验。

1.1试验方法

1.实验动物：

雄性C57/BL小鼠，购买自上海斯莱克实验动物中心，体重22-36 g。小鼠放在320×180×160 cm的笼子里，每笼5只，适应环境一周。整个实验过程中给予小鼠自由进水进食，环境温度为22±2℃，相对湿度为55±5 %，每天光照12小时。

2. 模型建立及给药：

将小鼠随机分为5组，10只/组。

正常对照组：用生理盐水连续灌胃30天。

模型对照组：顺铂进行腹腔注射给药3个循环，每个循环为给药5天休息5天。其中，顺铂给药的剂量为2.3mg/kg。本发明中使用的顺铂可购自德州医药股份有限公司等厂家。

治疗组：根据使用的金线莲提取物剂量不同将治疗组分为金线莲低剂量组、金线莲中剂量组和金线莲高剂量组，其中，金线莲低剂量组、金线莲中剂量组和金线莲高剂量组使用的金线莲提取物剂量分别为100mg/kg，200mg/kg及400mg/kg。每组顺铂进行腹腔注射给药3个循环，每个循环为给药5天休息5天，其中，顺铂给药的剂量为2.3mg/kg。金线莲提取物灌胃给药于顺铂给药后一小时进行，连续给药30天。

3.Von Frey纤维丝测痛：采用Von Frey纤维丝评估机械性异常性疼痛。Von Frey纤毛机械刺激针含20根Von Frey纤维丝，它可提供0.008g～300g的刺激力，可对多种动物进行定量的痛觉测试。Von Frey hairs纤毛机械刺激针的粗细及伸出长度决定提供刺激力的大小。实验时，根据实际情况选定粗细得当的Von Frey纤维丝，调节适当的Von Frey纤维丝的伸出长度，垂直地刺激皮肤，可通过调节伸长、更换Von Frey纤维丝来调整刺激力大小，直到Von Frey纤维丝弯曲。当啮齿类动物的爪受到一个机械刺激，它们会缩回反射。该触觉测试可应用于大、小鼠的足底。

将小鼠放在金属网底的透明塑料笼中，该透明塑料笼的尺寸为5×10×13 cm³。该尺寸的透明塑料笼为受试小鼠提供了一个舒适的环境，也便于操作人员观察小鼠的足底区域。待小鼠处于安静状态开始，用Von Frey纤维丝垂直刺激小鼠后足底中心。其中，本实验提供的Von Frey纤维丝的刺激力分为0.02g、0.07g、0.16g、0.4g、0.6g、1.0g和1.4 g七个梯度。当用Von Frey纤维丝刺激小鼠的足底中心，小鼠出现明显的爪子缩回或摇动，则为阳性反应，反之则为阴性反应。

实验时，从0.16g的刺激力开始分别刺激每只小鼠的足底中心。如果小鼠出现阳性反应，则对小鼠的刺激力降低一个梯度。如果为阴性反应，则对小鼠的刺激力增加一个梯度。从第一个阳性反应开始连续记录6个测量值，每只小鼠每次刺激间隔10 min，最后计算每只小鼠50%机械缩足痛阈值作为机械痛阈值。

4.粘附物移除能力测试：将圆形的粘性贴片粘在每只小鼠的后足底表面上。记录每只小鼠对贴片的行为反应所花费的时间。其中，小鼠对贴片的行为反应包括甩动或尝试移除该圆形的粘性贴片。

5.线粒体膜电位检测：分别取正常对照组，模型对照组和治疗组的实验小鼠的背根神经节（DRG）组织分离细胞，并在37℃下用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色45分钟。然后经过PBS洗涤后，采用流式细胞仪在585/40 nm处检测每只小鼠背根神经节组织分离细胞的荧光信号。TMRM用于亚猝灭模式，其中荧光强度降低表明线粒体膜电位降低。

6.线粒体呼吸功能检测：分别从正常对照组，模型对照组和治疗组的实验小鼠中收集其腰部（L3-L6）的背根神经节（DRG）并去除结缔组织，然后立即分离神经节，得到神经元。接着将细胞接种在聚鸟氨酸/层粘连蛋白的XF24平板中。过夜孵育后，将细胞用Seahorse分析介质（pH 7.4）洗涤并孵育1小时。最后采用XF能量测定仪检测线粒体呼吸功能。

7.数据分析：本实验结果使用Graphpad Prism 7软件来进行统计作图。GraphpadPrism 7软件将实验数据绘制成结果统计柱状图，实验数据通过平均值±标准误差值来表示。对于两组间的比较采用单因素方差分析结合事后检验，以p值小于0.05表示统计学差异显著性。

1.2试验结果

参照图1所示，图1中AR100代表金线莲低剂量组，AR200代表金线莲中剂量组，AR400代表金线莲高剂量组，##p<0.01与正常对照组比较，*p<0.05及**p<0.01与模型对照组比较。Von Frey实验结果显示，与正常对照组相比，模型对照组的化疗小鼠机械性异常性疼痛，而治疗组的小鼠随着金线莲提取物给药时间的增加，其50%机械缩足痛阈值明显高于模型对照组的小鼠，说明金线莲给药可以缓解顺铂给药小鼠的机械性异常性疼痛。

参照图2所示，AR100代表金线莲低剂量组，AR200代表金线莲中剂量组，AR400代表金线莲高剂量组，##p<0.01与正常对照组比较，*p<0.05及**p<0.01与模型对照组比较。粘附物移除能力测试用于评估顺铂给药和金线莲给药对小鼠感觉丧失的影响。在该测试中，将小鼠对放置在其后足上的贴片的反应时间长短作为感觉丧失或麻木的指示。

由模型对照组可知，通过顺铂给药进行化疗之后，小鼠的反应潜伏期显着增加，显示顺铂治疗引起了小鼠感觉功能丧失。由治疗组分别与模型对照组的比较可知，金线莲给药之后明显缩短了小鼠的反应潜伏期，表明金线莲有效地阻止了顺铂治疗引起的感觉功能丧失。

参照图3所示，AR100代表金线莲低剂量组，AR200代表金线莲中剂量组，AR400代表金线莲高剂量组，##p<0.01与正常对照组比较，*p<0.05及**p<0.01与模型对照组比较。线粒体膜电位检测结果表明，模型对照组的小鼠在顺铂给药进行化疗之后，小鼠的DRG线粒体膜电位显著下降。而治疗组的小鼠在金线莲给药之后，其DRG线粒体膜电位明显增加了。

参照图4所示，AR100代表金线莲低剂量组，AR200代表金线莲中剂量组，AR400代表金线莲高剂量组，##p<0.01与正常对照组比较，*p<0.05及**p<0.01与模型对照组比较。线粒体呼吸功能检测结果表明，模型对照组的小鼠在顺铂给药进行化疗之后，小鼠的DRG线粒体的基础呼吸和ATP生成量显著降低，而治疗组的小鼠在金线莲给药之后，其DRG线粒体的基础呼吸和ATP生成量相应地增加了。另一方面，模型对照组的小鼠在顺铂给药进行化疗之后小鼠的DRG线粒体的最大呼吸和其呼吸储备能力明显降低，而治疗组的小鼠在金线莲给药后，其DRG线粒体最大呼吸和其呼吸储备能力相应地增加了，说明金线莲样品可以增加经顺铂给药进行化疗的小鼠的DRG线粒体最大呼吸和其呼吸储备能力。

综上所述，本发明实施例制备的金线莲提取物一方面可以缓解顺铂给药小鼠的机械性异常性疼痛，且有效地阻止了顺铂治疗引起的感觉功能丧失。另一方面该金线莲提取物增加了小鼠DRG线粒体膜电位、基础呼吸和ATP生成量，从而增大了经顺铂给药进行化疗的小鼠的DRG线粒体最大呼吸和其呼吸储备能力，因此本发明实施例制备的金线莲提取物可用于缓解化疗所致的周围神经病变。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.金线莲提取物在制备缓解化疗所致周围神经病变的药品中的应用，所述金线莲提取物的制备包括以下步骤：

S2、所述提取液经浓缩，得到浓缩液；

S3、在所述浓缩液中加入无水乙醇进行沉淀，静置过夜后经离心分离后得到沉淀物；

S4、将所述沉淀物溶解在55～65℃的水中，得到溶解物，对所述溶解物进行除蛋白后，加入无水乙醇，静置过夜后经离心分离得到所述金线莲提取物。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述药品以所述金线莲提取物为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述辅料为载体、赋形剂或稀释剂。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述药品为口服制剂，所述口服制剂为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或缓释剂中的一种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述水与所述金线莲的质量比为20:1～1，提取次数为1～3次，其中，每次的提取过程为：所述金线莲在所述水中浸泡0.5～1.5小时，加热回流0.5～1.5小时。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述提取液与所述浓缩液的体积比为15:1～1。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S3中，所述无水乙醇与所述浓缩液的体积比为4:1～1，静置温度为3～5℃；离心时，离心机的分离因素为2500g～3500g，离心时间为5～15分钟。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S4中，所述溶解物采用sevag法除蛋白；所述溶解物与所述无水乙醇的体积比为4:1～1，静置温度为3～5℃；离心时，离心机的分离因素为2500～3500g，离心时间为5～15分钟。