CN111601582A - 绿茶提取物制备方法以及由此制备的绿茶提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及没食子酸、非‑没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加的绿茶提取物制备方法以及从其制备的绿茶提取物、包含其的抗炎症用化妆料、药学以及食品组合物。
Description
技术领域
本申请主张基于2017年11月14日的韩国专利申请第10-2017-0151218号的优先权的利益，将该韩国专利申请的文献中公开的所有内容作为本说明书的一部分包含。
本发明涉及绿茶提取物制备方法以及由其制备的绿茶提取物，更加详细地，涉及没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加的绿茶提取物制备方法以及由此制备的绿茶提取物。
背景技术
茶是对属于山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia)的茶树(Camellia sinensisO，Kuntze)的芽或叶子进行加工的，在茶的生叶中含有75至80％的水分和20至25％的固形物，在固形物中含有儿茶素、咖啡因、氨基酸、纤维素、果胶等的有机物和脂质、树脂类、精油、维生素、叶绿素等多种成分。该类成分形成茶独特的味道和风味，尤其，已有科学证明通过儿茶素类抑制胆固醇升高、阻止血糖升高作用、防止动脉硬化作用、抗氧化作用、抗菌作用、抗溃疡作用以及抑制突变作用等的生理活性功效，因此正在对作为保健饮料以及功能性食品的价值给予再评价。
绿茶中大量含有作为抗氧化物质的儿茶素，周知的是，儿茶素对低密度脂肪蛋白质的抑制氧化作用和抑制胆固醇生物合成作用高。儿茶素是绿茶中含有的儿茶素类的总称，所述儿茶素类有儿茶素(Catechin；C)、没食子儿茶素(Gallocatechin；GC)、表儿茶素(Epicatechin；EC)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin；EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechi ngallate；ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate；EGCG)等，其中，周知的是，表没食子儿茶素没食子酸酯占最多的量，生理活性也最高。
周知的是，在儿茶素类中，通过控制不含没食子酸酯的非-没食子酸酯儿茶素比率，从而改善绿茶提取物的风味，虽然有公开没食子酸酯儿茶素比率高的绿茶提取物的有效的制备技术，然而非-没食子酸酯儿茶素比率高的绿茶提取物的制备方法却没有公开。
另外，在绿茶提取物的制备中，目前为止尚未有报告指出作为有助于吸收儿茶素的物质的杨梅素(myricetin)、槲皮素(Quercetin)以及山奈酚(Kaempferol)等的黄酮醇非糖体的含量高的绿茶提取物制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加而抗炎效果优秀的绿茶提取物制备方法。
另外，本发明的目的在于提供通过所述制备方法制备的抗炎效果优秀的绿茶提取物、将所述提取物作为有效成分包含的抗炎症用食品组合物、化妆料组合物以及药学组合物。
为了达成所述目的，
本发明提供一种绿茶提取物制备方法，增加没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量，
所述绿茶提取物制备方法包括：
(a)制备绿茶提取物的步骤；以及
(b)使所述制备的绿茶提取物与酶反应的步骤的，其特征在于，
所述酶为包含葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶的复合酶。
另外，本发明提供一种绿茶提取物，通过所述本发明的制备方法制备。
另外，本发明提供一种抗炎症用化妆料组合物，作为有效成分包含所述本发明的绿茶提取物。
另外，本发明提供一种抗炎症用药学组合物，作为有效成分包含所述本发明的绿茶提取物。
另外，本发明提供一种抗炎症用食品组合物，作为有效成分包含所述本发明的绿茶提取物。
本发明的绿茶提取物制备方法能够增加绿茶提取物的没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量，由此能够显示优秀的抗炎效果。
另外，通过本发明的制备方法制备的绿茶提取物其抗炎效果优秀，因此能够使用为抗炎症用食品组合物、化妆料组合物以及药学组合物。
附图说明
图1是测定用实施例1以及比较例1中制备的绿茶提取物进行处理的细胞的白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达程度的图表。
图2是测定用实施例1以及比较例1中制备的绿茶提取物进行处理的细胞的白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达程度的图表。
图3是测定用实施例1以及比较例1中制备的绿茶提取物进行处理的细胞的环氧合酶-2(COX-2)的mRNA表达程度的图表。
图4是测定移动到实施例1中制备的绿茶提取物的细胞内的儿茶素类的含量的图表。
具体实施方式
以下，更加详细说明本发明。
本发明涉及一种没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加的绿茶提取物制备方法，包括：
(a)制备绿茶提取物的步骤；以及
(b)使所述制备的绿茶提取物与酶反应的步骤，
所述酶为包含葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶的复合酶。
没食子酸(Gallic acid)是单宁酸水解生成的物质，还可以作为天然抗氧化剂来使用，周知的是具有肥胖、抗氧化、高血压、抗菌、抗炎、调节血糖、血脂异常症以及肝功能保护等的功效。
非-没食子酸酯儿茶素(non-gallate catechin)为在作为黄酮的一种的儿茶素中不包含没食子酸酯的化合物，周知的是具有抗炎效果。
另外，黄酮醇的非糖体包括杨梅素(myricetin)、槲皮素(Quercetin)以及山奈酚(Kaempferol)，所述杨梅素、槲皮素以及山奈酚其抗氧化、抗炎等的生理活性卓越，以促进儿茶素的吸收的物质正在研究多种功效，并正向多种领域实现应用。
目前为止尚未有报告指出所述没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量全部增加的绿茶提取物制备方法，尤其，尚未研究出在通常的绿茶提取物中几乎不存在的黄酮醇的非糖体的含量增加的绿茶提取物制备方法。
因此，本发明想要提供没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量全部增加而抗炎效果优秀的绿茶提取物制备方法。
以下，按照各个步骤说明本发明的绿茶制备方法。
所述(a)步骤为制备绿茶提取物的步骤。
在本发明中，绿茶可以是通过普通的制茶方法制备的，绿茶可以包括选自由绿茶叶、绿茶梗以及绿茶根构成的组的一种以上，优选为可以包括绿茶叶。
另外，绿茶提取物的制备是使用提取溶剂来执行，提取溶剂包括选自由水、C1至C5的醇以及乙酸乙酯构成的组的一种以上，优选为包括选自由水以及乙醇构成的组的一种以上。
另外，对提取温度以及提取时间不作特别限定，优选为，提取温度为常温至80℃，提取时间为1小时至5小时。
所述(a)步骤的绿茶提取物可以利用所述提取溶剂通过多种方法提取。
具体为，作为第一实现例，添加所述绿茶重量的10至30倍左右的水，在100℃下进行一次提取4小时，通过相同的方法进行二次提取4小时之后，混合一次以及二次提取液进行过滤之后，利用浓缩机浓缩过滤液。将所述浓缩的提取液利用喷雾干燥或真空冷冻冻结干燥机进行干燥。
作为第二实现例，70％的乙醇提取物制备方法为，添加绿茶重量的10至30倍左右的70％乙醇，在50℃至80℃下提取30分钟至3小时之后，进行过滤，利用浓缩机浓缩过滤液。将所述浓缩的提取液利用喷雾干燥或真空冷冻冻结干燥机进行干燥。
作为第三实现例，95％的乙醇提取物制备方法为，添加绿茶重量的10至30倍左右的95％乙醇，在室温下放置1天至3天(每隔6小时反复实施摇晃(shaking)操作)进行提取之后，通过相同的方法反复实施2次来获得提取液。混合所述一次以及二次提取液进行过滤之后，利用浓缩机浓缩过滤液。将所述浓缩的提取液利用喷雾干燥或真空冷冻冻结干燥机进行干燥。
在本发明中，最优选用所述第二实现例制备绿茶提取物。
所述(b)步骤为使在所述(a)步骤中制备的绿茶提取物与酶反应的步骤。
所述酶作为复合酶，包括来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡聚糖酶(glucanase,enzyme code number 3.2.1.6)以及阿拉伯糖酶(arabinanase,enzyme codenumber 3.2.1.99)。
所述复合酶水解糖，可以通过使所述复合酶与绿茶提取物反应，从而水解绿茶提取物中含有的黄酮醇配糖体，由此能够增加黄酮醇的非糖体的含量。另外，可以通过将绿茶提取物中含有的儿茶素类中包含没食子酸酯的儿茶素类化合物进行去没食子酸酯化，从而增加非-没食子酸酯儿茶素以及没食子酸的含量。
所述复合酶相对于所述(a)步骤中制备的绿茶提取物总重量包含3重量％至30重量％，优选为包含5重量％至15重量％。
若包含3重量％至30重量％的所述复合酶，则可以获得工艺上符合的水解时间。
另外，所述复合酶以1:10至10:1的重量比包含葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶，优选为以1:5至5:1的重量比包含。
若以1:10至10:1的重量比包含所述葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶，则可以在酶反应时间内同时水解一定量以上的黄酮醇配糖体的糖和儿茶素的没食子酸酯。
另外，所述绿茶提取物与复合酶可以在20℃至60℃下执行反应12小时至48小时，可以优选为在30℃至50℃下执行反应20小时至30小时。
随着所述绿茶提取物与复合酶在20℃至60℃下执行反应12小时至48小时，可以水解与黄酮醇结合的糖，同时可以水解儿茶素的没食子酸酯，从而可以增加黄酮醇的非糖体以及非-没食子酸酯儿茶素的含量。然而，若脱离所述温度范围，则复合酶无法正常发挥作用或者可能会失活。另外，虽然可以在所述反应时间以内充分完成水解而增加黄酮醇的非糖体以及非-没食子酸酯儿茶素的含量，然而可能在反应时间之后，儿茶素类被氧化，从而非-没食子酸酯儿茶素的含量减小。
另外，本发明在使所述绿茶提取物与复合酶反应之后，可以追加包括使所述复合酶失活的步骤。所述失活可以是在50℃至90℃下执行10分钟至3小时，可以优选为在65℃至80℃下执行30分钟至1小时。
随着所述失活在50℃至90℃下执行10分钟至3小时，能够减少黄酮醇以及儿茶素的损失，终止酶促作用。然而，在不足所述温度以及时间时，酶不会失活，超过所述温度以及时间时，儿茶素的损失非常大。
另外，本发明可以追加包括：去除所述(b)步骤中制备的绿茶提取物的糖的步骤。
具体为，可以追加包括：对所述(b)步骤中制备的绿茶提取物进行浓缩制备浓缩液之后，从所述浓缩液去除糖的步骤。
使所述绿茶提取物与复合酶反应之后，进行过滤，利用浓缩机浓缩过滤液，制备浓缩液。此时，所述浓缩液优选包含约10重量％的固形物。
针对所述糖的去除，对该方法不作特别限定，在本发明中优选采用利用色谱法分离糖来进行去除的方法。
作为一实现例，可以将所述制备的浓缩液吸附在设置有吸附树脂的色谱柱上，用色谱柱体积的2至5倍的水清洗之后，用2至5倍的酒精洗脱，从而获得绿茶分馏液。
可以将所述分馏液进行浓缩以及冻结干燥，从而制备绿茶提取物，所述冻结干燥的方法不作特别限定，可以通过本技术领域中公知的方法完成。
所述本发明的绿茶提取物制备方法可以提供没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加的绿茶提取物制备方法，其中，尤其可以提供黄酮醇的非糖体的含量增加很多的制备方法。
所述非-没食子酸酯儿茶素是指儿茶素类中不包含没食子酸酯的儿茶素，所述非-没食子酸酯儿茶素包括没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素以及表儿茶素。
另外，所述黄酮醇的非糖体包括杨梅素、槲皮素以及山奈酚。
所述绿茶提取物相对于绿茶提取物总重量包含2重量％至10重量％的没食子酸以及20重量％至60重量％的非-没食子酸酯儿茶素，并包含4mg/g至15mg/g的黄酮醇的非糖体。
另外，非-没食子酸酯儿茶素相对于儿茶素类总重量包含70重量％至100重量％。
所述没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体具有抗炎效果。因此，本发明中，通过增加所述绿茶提取物的没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体全部的含量，能够显示抗炎效果。另外，所述黄酮醇的非糖体起到促进儿茶素类的吸收的作用，因此黄酮醇的非糖体的含量增加时，可以极大提高抗炎效果。
更加详细地，通过抑制选自由白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)构成的组的一种以上的表达的活性，能够显示抗炎效果。
另外，本发明涉及一种通过所述本发明的制备方法制备的绿茶提取物。
所述本发明的绿茶提取物相比于现有的绿茶提取物，没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量高，尤其是黄酮醇的非糖体的含量相比于现有的绿茶提取物高。
具体为，相对于绿茶提取物总重量，包含2重量％至10重量％的没食子酸以及20重量％至60重量％的非-没食子酸酯儿茶素，包含4mg/g至15mg/g的黄酮醇的非糖体。
另外，本发明的绿茶提取物通过抑制选自由白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)构成的组的一种以上的表达的活性，能够显示抗炎效果。
因此，如上所述，本发明的绿茶提取物能够显示抗炎效果。
另外，本发明涉及一种将所述本发明的绿茶提取物作为有效成分包含的抗炎症用化妆料组合物。
所述抗炎症用化妆料组合物可以作为功能性化妆品的有效成分使用，对于所述功能性化妆品中包含的所述绿茶提取物的含量不作特别限定，作为一例，可以为0.01重量％至99.9重量％。
本发明的功能性化妆品作为有效成分包含所述绿茶提取物，还可以包含通常使用的化妆料，例如为了水溶性护肤制剂化可以添加甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、山梨糖醇、聚乙二醇、羧乙烯聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、槐豆胶、尿囊素、卡拉胶等，作为粘度和硬度调节剂可以使用蜂蜡、石蜡、十八烷醇、巴西棕榈蜡、小烛树蜡以及硬脂酸钙、硬脂酸铝、硬脂酸锌、北美金缕梅(witchhazel)等，作为紫外线吸收剂可以使用丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、甲氧基肉桂酸辛酯等，作为颜料可以使用二氧化钛、微颗粒二氧化钛、高岭土、尼龙粉末、滑石粉、绢云母、云母、聚甲基丙烯酸甲酯等的体质颜料和黄色氧化铁、黑色氧化铁、红色氧化铁、群青、氧化铬、氢氧化铬等的着色颜料，作为保湿剂可以利用1,3-丁二醇、浓甘油、乙二醇等和壳多糖、壳聚糖、透明质酸、玻尿酸、乳酸、乙醇酸等的天然保湿物质，作为防腐剂可以使用对羟苯甲酸酯类、咪唑烷基脲等，不仅如此，还可以根据产品特性，混合调配1种或2种以上的上述成分。
所述功能性化妆品可以制备成本技术领域中通常制备的任何剂型，例如，可以剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、霜剂、乳剂、粉末、皂剂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉末状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底以及喷雾等，然而不限于此。更加详细地，可以制备成柔肤水、营养水、营养霜、按摩霜、精华液、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、卸妆水、面膜、喷雾或粉末的剂型。
所述剂型为糊剂、霜剂或凝胶的情况下，作为载体成分，可以利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
所述剂型为粉末或喷雾的情况下，作为载体成分，可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，尤其是喷雾的情况下，可以追加包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚之类的推进剂。
所述剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分使用溶剂、增溶剂或破乳剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、脂肪族甘油酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
所述剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可以利用水、乙醇或丙二醇之类的液状稀释剂；乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯以及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯之类的悬浮剂；微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等。
所述剂型为含有表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分可以使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
另外，本发明涉及一种将本发明的绿茶提取物作为有效成分包含的抗炎症用药学组合物。
根据本发明，所述绿茶提取物相对于所述组合物总重量，含有0.1重量％至50重量％。在所述含量的情况下，不仅适合有效显示本发明所意图的效果，而且还能满足组合物的稳定性以及安全性全部，效果相比费用方面也是优选的。
根据本发明的药学组合物可以通过添加常用的无机或有机载体，以固体、半固体或液状形态进行口服。作为用于所述口服的制剂，可以举出片剂、丸剂、软质及硬质胶囊、散剂、细粒剂、颗粒剂、溶液、乳浊剂、糖浆剂以及球剂等。
所述药学组合物可以根据商法容易进行制剂化，可以适当使用表面活性剂、赋形剂、着色料、香辛料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂或其他常用的助剂。
另外，所述有效成分的给药量可以根据接受治疗的对象的年龄、性别、体重以及所要治疗的疾病或者病状、给药路径或处方人的判断而不同。针对基于所述因子决定的给药量，在本领域技术人员的水平内，例如，可以每日按100至1000mg、优选为300至500mg的量分成1至3次进行给药，然而所述给药量并不通过任意方法来限定本发明的范围。
所述药学组合物可以作为单独的治疗剂给药或者与其他治疗剂一同给药，可以与现有的治疗剂依次或同时给药。重要的是考虑所述全部因素，给药能够通过无副作用的最少的量来获得最大效果的量，可以通过本领域技术人员容易决定。
另外，本发明涉及一种将本发明的绿茶提取物作为有效成分包含的抗炎症用食品组合物。
根据本发明，所述绿茶提取物相对于所述组合物总重量，包含0.1重量％至50重量％。在所述含量的情况下，则不仅适合有效显示本发明所意图的效果，而且还能满足组合物的稳定性以及安全性全部，效果相比费用方面也是优选的。
除了上述成分之外，根据本发明的食品组合物还可以在不阻碍绿茶提取物的功效的水平的量下，进一步包括具有对肥胖的预防、改善或治疗具有效果的其他成分。例如，可以包括糖、酸、糖醇中的任一种以上。
根据本发明的食品组合物可以为健康食品、功能性食品以及食品添加剂组合物。所述组合物可以通过包括添加多种赋形剂或添加剂的步骤的通常的方法，应用为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、饮品剂、焦糖、减脂棒、茶包等多种剂型。除了有效成分之外，根据剂型或使用目的，本领域技术人员可以在组合物中容易选定适当的量调配本领域中通常使用的成分，当与其他成分调配时，可以产生协同效应。
用于实施发明的形态
以下，为了具体说明本发明，举出实施例进行详细说明。然而，根据本发明的实施例可以变形为多种其他形态，不应解释为本发明的范围由以下实施例进行限定。本发明的实施例是为了向本领域中具有平均知识的人更加完整地说明本发明而提供的。
<绿茶提取物的制备>
实施例1.
混合100g的干燥绿茶以及1.5kg的70％乙醇，在60℃下提取2小时。然后，利用可以过滤10μm以下大小的滤纸进行过滤之后，将过滤液进行浓缩，并进行喷雾干燥，从而制备绿茶提取物。
在所述绿茶提取物中添加绿茶提取物总重量的10重量％的以1:1的重量比混合葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶的复合酶，在40℃下反应24小时，在80℃下使复合酶失活30分钟至1小时。然后，利用滤布浓缩滤液，去除乙醇，并浓缩为仅能够包含固形物的10重量％，从而制备浓缩液。
将所述浓缩液吸附在设置有吸附树脂的色谱柱上，用色谱柱体积的2至5倍的水清洗之后，利用2至5倍的酒精洗脱，将获得的分馏液进行浓缩以及冻结干燥，最终制备绿茶提取物。
比较例1.
混合100g的干燥绿茶以及1.5kg的70％乙醇，在60℃下提取2小时。然后，利用可以过滤10μm以下大小的滤纸进行过滤之后，将过滤液进行浓缩，并进行喷雾干燥，从而制备绿茶提取物。
在所述绿茶提取物中添加水而制成10％(w/v)溶液之后，将所述溶液吸附在设置有吸附树脂的色谱柱上，用色谱柱体积的2至5倍的水清洗之后，利用2至5倍的酒精洗脱，将获得的分馏液进行浓缩以及冻结干燥，最终制备绿茶提取物。
实验例1.绿茶提取物的没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体含
量的测定
使用HPLC(高效液相色谱法；high performance liquid chromatogra phy)测定在所述实施例1以及比较例1中制备的绿茶提取物的没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体(杨梅素、槲皮素以及山奈酚)的含量，以下表2中示出结果。
HPLC的测定条件为如下。
从Sigma(西格玛)公司购入作为黄酮醇的非糖体的杨梅素、槲皮素以及山奈酚标准品，试剂是溶解在10:30:60(v/v)＝DMSO(二甲基亚砜)：蒸馏水：甲醇溶剂进行溶解并超声波提取之后，利用0.45μm的PVDF过滤器(filter)进行过滤，并注入到设备中。
设备是使用了HPLC(Waters Alliance 2695system,Waters(沃特世),USA)，在275nm(儿茶素)、365nm(黄酮醇)区域分析检测波长。色谱柱是使用Agilent Poroshell SBC18(150×4.6mm,2.7μm)，通过使用0.1％甲酸(Formic acid；FA)和乙腈(Acetonitrile；ACN)溶剂的浓度梯度溶剂组成法进行分析，以下表1中示出溶剂的浓度组成比。所有的分析溶剂使用了HPCL级试剂，数据处理是使用沃特世公司的Empower 2程序。
【表1】
| 时间(min) | 流量(mL/min) | ％A | ％B | 曲线值 |
| 0.00 | 0.8 | 92 | 8 | 6 |
| 2 | 0.8 | 92 | 8 | 6 |
| 3 | 0.8 | 88 | 12 | 6 |
| 4 | 0.8 | 84 | 16 | 6 |
| 12 | 0.8 | 84 | 16 | 6 |
| 15 | 0.8 | 80 | 20 | 6 |
| 18 | 0.8 | 80 | 20 | 6 |
| 21 | 0.8 | 76 | 24 | 6 |
| 22 | 0.8 | 70 | 30 | 6 |
| 26 | 0.8 | 70 | 30 | 6 |
| 28 | 0.8 | 50 | 50 | 6 |
| 30 | 0.8 | 50 | 50 | 6 |
| 32 | 0.8 | 20 | 80 | 6 |
| 33 | 0.8 | 20 | 80 | 6 |
| 34 | 0.8 | 92 | 8 | 6 |
| 35 | 0.8 | 92 | 8 | 6 |
％A：0.1％甲酸(Formic acid；FA)
％B：乙腈(Acetonitrile；ACN)
【表2】
在上述表1的结果中可以确认到，使用复合酶制备的实施例1的绿茶提取物相比于不使用复合酶制备的比较例1的绿茶提取物，没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量皆高。
具体为，可以确认到，没食子酸增加约98倍，非-没食子酸酯儿茶素增加约2.5倍，黄酮醇的非糖体增加约7.5倍左右。
尤其，可以确认到，比较例1的绿茶提取物是相比于非-没食子酸酯儿茶素含的更多的是没食子酸酯儿茶素，然而实施例1的绿茶提取物是儿茶素类的大部分为非-没食子酸酯儿茶素。
因此，可以确认到，使用复合酶制备的本发明的绿茶提取物增加没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量。
实验例2.抗炎效果的测定
为了测定所述实施例1以及比较例1中制备的绿茶提取物的抗炎效果，在从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)购买的源自RAW264.7老鼠的巨噬细胞株中观察了与炎症反应有关的基因(白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2))的mRNA表达。
在6孔板(well-plate)以1×106/well的密度培养RAW 264.7细胞株之后，对实施例1以及比较例1的绿茶提取物以10g/ml的浓度进行预处理2小时，然后将LPS(脂多糖；lipopolysaccharide)以10ng/ml的浓度进行处理6小时，诱发炎症反应。
收取细胞，利用Trizol试剂分离RNA，利用第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid 1ststrand cDNA synthesis kit)合成cDNA之后，通过Q-PCR观察白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的mRNA表达程度。
图1至图3是在RAW 2264.7巨噬细胞株中，作为无刺激对照组(control)未处理、作为阳性对照组处理LPS、以及作为实验组分别处理实施例1以及比较例1的LPS和绿茶提取物之后，通过Q-PCR测定白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的mR NA表达的结果的图表。
从图1至图3的结果中可以确认到，仅处理LPS的阳性对照组相比于未处理LPS的无刺激对照组(control)，白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的生成增加，并且可以确认到通过LPS增加的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的生成会因通过实施例1制备的绿茶提取物而受抑制。
相反，比较例1中制备的绿茶提取物对白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的生成的抑制效果微弱。
从上述结果可以确认到，通过本发明的制备方法制备的实施例1的绿茶提取物对诱发炎症的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)的生成的抑制效果非常优秀，这可以认为是具有抗炎效果的没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体的含量增加引起的。
实验例3.黄酮醇非糖体的儿茶素吸收的测定
为了测定所述实施例1中制备的绿茶提取物的黄酮醇非糖体的儿茶素吸收程度，从所述绿茶提取物分馏出黄酮醇的非糖体。
对黄酮醇的非糖体的分馏是首先将所述实施例1的绿茶提取物分别溶解在DMSO以及甲醇混合溶剂(1:9，v/v)，制备出20％浓度的溶液。然后，吸附在色谱柱(35×250mm，10μm，C18)上，对利用水以及乙腈的浓度梯度获得的黄酮醇的非糖体的分馏液进行浓缩以及冻结干燥。
在源自人体的大肠癌细胞株(HT-29)中加入含有35％的表儿茶素的绿茶提取物。将实验组分为3组，对照组是除了绿茶提取物之外未作任何处理(blank)，阳性对照组是添加100ppm的槲皮素，实验组是添加100ppm的上述获得的实施例1的黄酮醇的非糖体分馏液，反应1小时。然后，利用PBS清洗细胞，加入500μL的90％甲醇以及10％DMSO的混合溶液，通过超声处理(sonication)分解细胞，并利用0.45μm的PDVF过滤器提纯杂质，利用HPLC测定细胞内儿茶素的含量。
HPLC的分析条件与所述实施例1相同地执行。
其结果，可以确认到，通过使用复合酶的本发明的制备方法制备的实施例1的绿茶提取物完成了细胞内儿茶素的吸收(图4)。
因此，可以确认到，通过本发明的制备方法制备的绿茶提取物其黄酮醇的非糖体的含量增加，从而促进细胞内儿茶素的吸收。
Claims (18)
1.一种绿茶提取物制备方法，增加没食子酸、非-没食子酸酯儿茶素以及黄酮醇的非糖体含量，所述绿茶提取物制备方法包括：
(a)制备绿茶提取物的步骤；以及
(b)使制备的所述绿茶提取物与酶反应的步骤，其特征在于，
所述酶为包含葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶的复合酶。
2.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述(a)步骤的绿茶提取物的制备是使用提取溶剂在常温至80℃下执行1小时至5小时，所述提取溶剂包含选自由水、C1至C5的醇以及乙酸乙酯构成的组的一种以上。
3.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述复合酶相对于所述(a)步骤的绿茶提取物总重量包含3重量％至30重量％。
4.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述复合酶以1:10至10:1的重量比混合葡聚糖酶以及阿拉伯糖酶。
5.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，所述(b)步骤是使绿茶提取物以及复合酶在20℃至60℃下反应12小时至48小时。
6.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述(b)步骤在使绿茶提取物以及复合酶反应之后，还包括使酶失活的步骤。
7.根据权利要求6所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述复合酶的失活在50℃至90℃下进行10分钟至3小时。
8.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述(b)步骤之后，还包括去除糖的步骤。
9.根据权利要求8所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述糖的去除利用色谱法分离糖来进行去除。
10.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述非-没食子酸酯儿茶素包括没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素以及表儿茶素。
11.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述黄酮醇的非糖体包括杨梅素、槲皮素以及山奈酚。
12.根据权利要求1所述的绿茶提取物制备方法，其特征在于，
所述没食子酸相对于绿茶提取物总重量包含2重量％至10重量％，
所述非-没食子酸酯儿茶素相对于绿茶提取物总重量包含20重量％至60重量％，
所述黄酮醇的非糖体包含4mg/g至15mg/g。
13.一种绿茶提取物，通过权利要求1至12中任一项所述的制备方法制备。
14.根据权利要求13所述的绿茶提取物，其特征在于，
所述绿茶提取物相对于绿茶提取物总重量包含2重量％至10重量％的没食子酸，
所述绿茶提取物相对于绿茶提取物总重量包含20重量％至60重量％的非-没食子酸酯儿茶素，
所述绿茶提取物包含4mg/g至15mg/g的黄酮醇的非糖体。
15.根据权利要求13所述的绿茶提取物，其特征在于，
所述绿茶提取物抑制选自由白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及环氧合酶-2(COX-2)构成的组的一种以上的表达。
16.一种抗炎症用化妆料组合物，作为有效成分包含权利要求13所述的绿茶提取物。
17.一种抗炎症用药学组合物，作为有效成分包含权利要求13所述的绿茶提取物。
18.一种抗炎症用食品组合物，作为有效成分包含权利要求13所述的绿茶提取物。
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