CN111596061A - 一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法，属于化学发光体外诊断技术领域。本发明的试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液；R3试剂为HAV抗原溶液。本发明的试剂盒采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度；采用顺磁性的微粒作为固相载体，其比表面积大，提高了检测的灵敏度；通过采用过量的HAV抗原中和HAV IgG和IgM，可以同时检测HAV IgG和IgM，检测结果完全可以代表HAV总抗体结果。本发明制备的试剂盒可直接用于全自动化学法光免疫分析仪上，无需大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。

Description

一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于化学发光体外诊断技术领域，具体涉及一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲型病毒性肝炎简称甲肝，是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)感染引起的以肝脏炎症病变为主的传染病。1974年feinstone SM等报告通过免疫电镜技术在甲型肝炎病人粪便中发现甲型肝炎病毒。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。甲肝病毒感染多为自限性，严重的可形成爆发性肝炎并导致死亡，甲肝的临床症状与感染者的年龄有关，6岁以下的儿童，70％的感染都是无症状的，在年龄稍大的儿童和成人中，感染者多显示临床症状，其中大部分病人都会出现黄疸。甲肝病毒的平均潜伏期是28天(从15到50天的范围)，典型的临床症状包括发热、不舒服、厌食、呕吐、腹部不适等，这些症状通常不会超过2个月，其中最明显的临床症状表现为黄疸，黄疸出现率为70％。在甲肝急性期病人的血清中可以查出抗-HAV IgM及IgG，临床病人于病后2周抗-HAV IgM阳性率为100％，持续2～3周，然后迅速下降。在症状出现的前期，HAV抗体就能够被检测出来。感染甲型肝炎一旦发病，HAV总抗体即为阳性，在自然感染之后，通常一生都会检测到HAV IgG抗体，且可以再次感染时起到二次免疫效果。现今可以通过接种甲肝疫苗进行预防，在接种甲肝疫苗两周后就可以检测到HAVIgG抗体。HAV总抗体检测用于诊断过去或目前存在的甲型肝炎病毒感染，也可以观察接种HAV疫苗之后的免疫效果。因此开发新型的、准确、快速、灵敏度高的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒对诊断甲型肝炎病毒感染意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒使用磁珠包被抗原与化学发光物质体系，中和法检测血清、血浆中甲型肝炎病毒总抗体的含量，具有较高的检测灵敏度，操作简单、检测准确、快速。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；
所述R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；
所述R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，其中化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；
所述R3试剂为HAV抗原溶液。
在上述技术方案中，优选的是：所述R1试剂包括0.01％～0.1％磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体，粒径为1～3μm磁微粒，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、和0.01％～0.2％proclin-300，pH6.0。
在上述技术方案中，优选的是：所述R2试剂包括0.3μg/mL～2μg/mL化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、及0.1％～2％BSA，pH6.0。
在上述技术方案中，优选的是：化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体中化学发光物质与抗体标记的摩尔比例为1：1～20：1。
在上述技术方案中，优选的是：所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL HAV抗原，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、0.1％～2％BSA、及0.1％～1％的浓度为10％的酪蛋白，pH6.0。
在上述技术方案中，优选的是：所述校准品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L；所述质控品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L。
本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、R1试剂的制备
步骤1.1磁颗粒溶液的洗涤
取磁颗粒溶液，加入包被缓冲液稀释，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入包被缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；
步骤1.2磁颗粒的活化过程
取洗涤好的磁颗粒，分次加入含EDC的活化缓冲液中，边加边混匀，加完后，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；在活化好的磁颗粒沉淀中加入包被缓冲液；
步骤1.3甲型肝炎病毒抗体的包被
取活化好的磁颗粒，加入甲型肝炎病毒抗体，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行包被；
步骤1.4封闭
向上述包被物中，加入封闭缓冲液，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行封闭；将封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀；再加入包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒，再加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放；
步骤1.5 R1试剂的制备
取上述步骤1.4制备的固相中间品和试剂缓冲液，配制成磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R1试剂；
步骤2、R2试剂的制备
步骤2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体的制备：
取甲型肝炎病毒抗体，超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心，然后加入化学发光物质原液，混匀后进行标记；标记反应结束后，加入封闭缓冲液，进行封闭；封闭后超滤离心，除去未偶联的化学发光物质，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制；
步骤2.2、R2试剂的制备
取上述步骤2.1中制备的中间品和试剂缓冲液，配制成化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R2试剂；
步骤3、R3试剂的制备
取HAV抗原母液，使用缓冲液配置配制成R3试剂；
步骤4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备
配制高、低浓度的校准品，及高、低浓度的质控品。
在上述技术方案中，R1试剂的制备中：采用pH 6.5的20mM磷酸缓冲液为活化缓冲液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；pH 7.0的磷酸缓冲液为包被缓冲液，包被温度25℃，包被时间12h；pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液，封闭温度25℃，封闭时间2h。
在上述技术方案中，R2试剂的制备中：标记的温度为37℃，时间为4h；封闭的时间为1h。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。
本发明的试剂盒采用顺磁性的微粒作为固相载体，其比表面积大，提高了检测的灵敏度。
本发明的试剂盒通过采用过量的HAV抗原中和HAV IgG和IgM，可以同时检测HAVIgG和IgM，检测结果完全可以代表HAV总抗体结果。
本发明的制备方法制备的试剂盒可直接用于全自动化学法光免疫分析仪上，无需大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；
所述R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；
所述R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，其中化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；
所述R3试剂为HAV抗原溶液。
优选的是：所述R1试剂包括0.01％～0.1％磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体，粒径为1～3μm磁微粒，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、和0.01％～0.2％proclin-300，pH6.0。进一步优选的，R1试剂中磁微粒的粒径为2.8μm，磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)的浓度0.072％，试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，pH6.0。
优选的是：所述R2试剂包括0.3μg/mL～2μg/mL化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、及0.1％～2％BSA，pH6.0。进一步优选的是R2试剂中化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)浓度1.0μg/mL，化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物；化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)中，优选化学发光物质与抗体的摩尔比例为1：1～20：1，进一步优选化学发光物质与抗体的摩尔比为3：1。试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％BSA，pH6.0。
优选的是：所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL HAV抗原，试剂缓冲液为100mmol/LPB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、0.1％～2％BSA、及0.1％～1％的浓度为10％的酪蛋白，pH6.0。进一步优选的是，R3试剂包括0.5μg/mL HAV抗原，试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％BSA，0.5％酪蛋白(10％)，pH6.0。
优选的是：所述校准品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L；所述质控品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L。
本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、R1试剂的制备
步骤1.1磁颗粒溶液的洗涤
取磁颗粒溶液，加入包被缓冲液稀释，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入包被缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；
步骤1.2磁颗粒的活化过程
取洗涤好的磁颗粒，分次加入含EDC的活化缓冲液中，边加边混匀，加完后，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；在活化好的磁颗粒沉淀中加入包被缓冲液；
步骤1.3甲型肝炎病毒抗体的包被
取活化好的磁颗粒，加入甲型肝炎病毒抗体，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行包被；
步骤1.4封闭
向上述包被物中，加入封闭缓冲液，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行封闭；将封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀；再加入包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒，再加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放；
步骤1.5R1试剂的制备
取上述步骤1.4制备的固相中间品和试剂缓冲液，配制成磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R1试剂；
步骤2、R2试剂的制备
步骤2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体的制备：
取甲型肝炎病毒抗体，超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心，然后加入化学发光物质原液，混匀后进行标记；标记反应结束后，加入封闭缓冲液，进行封闭；封闭后超滤离心，除去未偶联的化学发光物质，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制；
步骤2.2、R2试剂的制备
取上述步骤2.1中制备的中间品和试剂缓冲液，配制成化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R2试剂；
步骤3、R3试剂的制备
取HAV抗原母液，使用缓冲液配置配制成R3试剂；
步骤4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备
配制高、低浓度的校准品，及高、低浓度的质控品。
优选的是：R1试剂的制备中：采用pH 6.5的20mM磷酸缓冲液为活化缓冲液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；pH 7.0的磷酸缓冲液为包被缓冲液，包被温度25℃，包被时间12h；pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液，封闭温度25℃，封闭时间2h。
优选的是：R2试剂的制备中：标记的温度为37℃，时间为4h；封闭的时间为1h。
本发明的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒用于HAV总抗体检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对甲型肝炎病毒总抗体主校准品进行检测，绘制主校准曲线，内置于射频卡；接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准；接着测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为试剂质控合格。测试样本，根据样本发光值计算样本浓度。
本发明的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成HAV总抗体的检测。
此外，本发明的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒还具有以下优点：
1.使用过量HAV抗原的中和法解决了非特异性抗体吸附的问题。
2.采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。
3.通过采用中和HAV抗原，可以同时检测HAV IgG和IgM，准确的识别HAV总抗体。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附表和具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例一
甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备：
1、R1试剂的制备
磁珠平台已确定磁珠最佳包被工艺：采用20mM磷酸缓冲液(pH 6.5)为活化缓冲液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；磷酸缓冲液(pH 7.0)为包被缓冲液，包被温度25℃，包被时间12h；10％BSA缓冲液(pH 8.0)为封闭缓冲液，封闭温度25℃，封闭时间2h；磁珠包被量为1％；磁微粒的粒径为2.8μm。
1.1磁颗粒溶液的洗涤
取浓度为7.2％的磁颗粒溶液0.3mL(15mg)，加入0.9mL包被缓冲液稀释磁颗粒浓度至0.72％，充分混匀10min后，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒。在磁颗粒中加入1mL包被缓冲液将磁珠充分悬起。按上述方法再进行分离并重悬。
1.2磁颗粒的活化过程(整个温度控制在25±0.5℃)
取洗涤好的浓度为0.72％的磁颗粒3mL(15mg)，分次缓慢加入EDC浓度为10mg/mL的活化缓冲液26.25μL，边加边混匀，加完后，置于血液混匀仪上(25℃)，中速混匀60min。放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒。在活化好的磁颗粒沉淀中加入1.5mL的包被缓冲液。
1.3甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)的包被
取活化好的磁颗粒0.5mL(5mg)，加入0.05mg甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)，置于血液混匀仪上(25℃)，中速混匀，包被12h。
1.4封闭
向上述包被物中，分别加入0.1mL的封闭缓冲液，置于血液混匀仪上(25℃)，中速混匀，封闭2h。将封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀。再分别加入1mL的包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上(25℃)，中速混匀15min。放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒，加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放于2～8℃。
1.5R1试剂的制备
取上述1.4中制备的固相中间品适量和试剂缓冲液，配制成浓度0.072％的磁颗粒包被的甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)溶液，即R1试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，pH6.0。
2、R2试剂的制备
2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)的制备：
取0.5mg甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。原材料缓冲液为20mM PB pH 7.4，0.01％SDS；标记缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH6.0。
按照吖啶酯：抗体摩尔比为3：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH6.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。
2.2、R2试剂的制备：
取上述2.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成甲型肝炎病毒抗体(Anti-HAV)浓度为1.0μg/mL的R2试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％BSA，pH6.0。
3、R3试剂的制备：
称取HAV抗原0.5mg，加入缓冲液配成5μg/mL的抗原母液；R3试剂由抗原母液和缓冲液组成，配成0.5μg/mL的R3试剂。试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％BSA，0.5％酪蛋白(10％)，pH6.0。
4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备
取赋值结果为20.00IU/mL的甲型肝炎病毒抗体阳性血清，用校准品基质稀释成25.0IU/L，作为高浓度校准品。
取校准品基质赋值结果为5.00IU/L，作为低浓度校准品。
取赋值结果为20.00IU/mL的甲型肝炎病毒抗体阳性血清，用质控品基质稀释成25.00IU/L，作为高浓度质控品。
取质控品基质赋值结果为5.00IU/L，作为低浓度质控品。
实施例二
主校准品的配制及溯源：
取98IU/mL的国际标准物质依次稀释成浓度为60.00IU/L、30.00IU/L、15.00IU/L、7.50IU/L、3.25IU/L的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0.00IU/L浓度的点。
取20IU/mL的甲型肝炎病毒抗体原液1mL，加入到99mL校准品基质缓冲液中，稀释成200IU/L的校准品母液。再将校准品母液依次稀释成浓度为70.00IU/L、30.00IU/L、15.00IU/L、7.50IU/L、3.25IU/L的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0.00IU/L浓度的点。
表1 国际标准物质迪瑞测值
Figure BDA0002497978000000121
用标准物质给主校准品赋值，再用主校准品给产品校准品和产品质控品赋值。
表2 国际标准物质迪瑞测值
Figure BDA0002497978000000122
实施例三
甲型肝炎病毒IgG抗体企业参考品的制备：
本参考品从全国供血员和肝炎病人中选出，经过国外几家甲型肝炎病毒IgG抗体试剂筛选，全部样品均为血清。
阴性参考品：
由20份正常人血清组成，甲型肝炎病毒IgG抗体为阴性。选用HAV IgG抗体阴性的正常人血清，以0.2μm滤膜过滤后，置2℃～8℃保存。-20℃保存时，有效期两年。
阳性参考品：
用于控制诊断试剂对甲型肝炎病毒IgG抗体样品的检出能力。由10份强、中、弱阳性血清组成。选用HAV IgG抗体阳性血清，经60℃高温处理1h后，以0.2μm滤膜过滤后，置2℃～8℃保存。-20℃保存时，有效期两年。
最低检出限参考品：
用于控制诊断试剂的灵敏度。由阴性血清稀释的甲型肝炎病毒IgG抗体阳性血清样本组成。
精密度参考品：
用于控制诊断试剂的重复性。由1份中等偏弱阳的甲型肝炎病毒IgG抗体阳性血清组成。
1、用途
本品系用HAV IgG抗体阴性和阳性血清组成，经过罗氏公司的试剂盒测试的参考品。本参考品用于自配甲型肝炎病毒IgG抗体诊断试剂的质量检定。
2、组成
2.1阴性参考品20份，编号为N1～N20，0.5mL/支
2.2阳性参考品10份，编号为P1～P10，0.5mL/支
2.3最低检出限参考品，1份血清系列稀释组成，共3支，编号为L1～L3，0.5mL/支。稀释比例分别为1：10、1：20、1：40。
2.4精密度参考品1份，编号为J，1.0mL/支
3、检测标准
3.1阴性参考品符合率：20份阴性参考品检测符合率(-/-)为20/20。
3.2阳性参考品符合率：10份阳性参考品检测符合率(+/+)为10/10。
3.3最低检出限：至少1∶20稀释后检测仍为阳性。
3.4精密度：平行检测精密度样本10次，要求CV≤15％。
4、注意事项
4.1本参考品应在-20℃以下保存，避免反复冻溶。
4.2使用时应待样本完全融化摇匀。
实施例四
甲型肝炎病毒IgM抗体企业参考品的制备：
本参考品从全国供血员和肝炎病人中选出，经过国外几家甲型肝炎病毒IgM抗体试剂筛选，全部样品均为血清。
阴性参考品：
由20份正常人血清组成，甲型肝炎病毒IgM抗体均为阴性。选用HAV IgM抗体为阴性的正常人血清，以0.2μm滤膜过滤后，置2℃～8℃保存。-20℃保存时，有效期两年。
阳性参考品：
用于控制诊断试剂对甲型肝炎病毒IgM抗体样品的检出能力。选用HAV IgM抗体阳性血清，经60℃高温处理1h后，以0.2μm滤膜过滤后，置2℃～8℃保存。-20℃保存时，有效期两年。
最低检出限参考品：
用于控制诊断试剂的灵敏度，由阴性血清稀释的甲型肝炎病毒IgM抗体阳性血清样本组成。
精密度参考品：
用于控制诊断试剂的重复性。由1份中等偏弱阳的血清组成。
1、用途
本品系用HAV IgM抗体阴性和阳性血清组成，经过雅培测试的参考品。本参考品用于自配甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂的质量检定。
2、组成
2.1阴性参考品20份，编号为N1～N20，0.5mL/支
2.2阳性参考品10份，编号为P1～P10，0.5mL/支
2.3最低检出限参考品，1份血清系列稀释组成，共3支，编号为L1～L3，0.5mL/支。稀释比例分别为1：10、1：20、1：40。
2.4精密度参考品1份，编号为J，1.0mL/支。
3、检测标准
3.1阴性参考品符合率：20份阴性参考品检测符合率(-/-)为20/20。
3.2阳性参考品符合率：10份阳性参考品检测符合率(+/+)为10/10。
3.3最低检出限：至少1∶20稀释后检测仍为阳性。
3.4精密度：平行检测精密度样本10次，要求CV≤15％。
4、注意事项
4.1本参考品应在-20℃以下保存，避免反复冻溶。
4.2使用时应待样本完全融化摇匀。
实施例五
本发明的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒性能评估：
1、甲型肝炎病毒IgG抗体企业参考品测试
(1)阴性参考品符合率
用实施例一制备的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgG抗体企业阴性参考品，结果如表3：
表3 甲型肝炎病毒IgG抗体企业阴性参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000161
(2)阳性参考品符合率
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgG抗体企业阳性参考品，结果如表4：
表4 甲型肝炎病毒IgG抗体企业阳性参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000171
(3)最低检出限
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgG抗体企业最低检出限参考品，结果如表5：
表5 甲型肝炎病毒IgG抗体最低检出限参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000172
(4)精密度
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgG抗体精密度参考品，重复检测10次，计算10次测量结果的平均值
Figure BDA0002497978000000173
和标准差SD，根据公式(1)计算变异系数(CV)。
Figure BDA0002497978000000174
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
Figure BDA0002497978000000181
—测量结果的平均值
表6 甲型肝炎病毒IgG抗体精密度参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000182
2、甲型肝炎病毒IgM抗体企业参考品测试
(1)阴性参考品符合率
用实施例一制备的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgM抗体企业阴性参考品，结果如表7：
表7 甲型肝炎病毒IgM抗体企业阴性参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000183
Figure BDA0002497978000000191
(2)阳性参考品符合率
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgM抗体企业阳性参考品，结果如表8：
表8 甲型肝炎病毒IgM抗体企业阳性参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000192
Figure BDA0002497978000000201
(3)最低检出限
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgM抗体企业最低检出限参考品，结果如表9：
表9 甲型肝炎病毒IgM抗体最低检出限参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000202
(4)精密度
用实施例一配制的试剂盒检测甲型肝炎病毒IgM抗体精密度参考品，重复检测10次，计算10次测量结果的平均值
Figure BDA0002497978000000206
和标准差SD，根据公式(1)计算变异系数(CV)。
Figure BDA0002497978000000203
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
Figure BDA0002497978000000204
—测量结果的平均值
表10 甲型肝炎病毒IgM抗体精密度参考品检测结果
Figure BDA0002497978000000205
Figure BDA0002497978000000211
实施例六
甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒检测方法：
以全自动化学发光免疫分析仪(CM-180)为检测工具，方法学模式为中和法，样本量50μL，R1试剂量40μL，R2试剂量50μL，R3试剂量50μL。反应杯中加入样本50μL，再加入R3试剂50μL孵育10min；分别加入R1试剂40μL和R2试剂50μL孵育10min，洗涤。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光激发液A液(HNO3+H2O2溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应，最后记录相对发光强度(RLU)。根据仪器内射频卡内的主曲线将检测出的相对发光强度(RLU)带入计算浓度值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；
所述R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；
所述R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，其中化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；
所述R3试剂为HAV抗原溶液。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂包括0.01％～0.1％磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体，粒径为1～3μm磁微粒，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、和0.01％～0.2％proclin-300，pH6.0。
3.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包括0.3μg/mL～2μg/mL化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体，试剂缓冲液为100mmol/LPB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、及0.1％～2％BSA，pH6.0。
4.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体中化学发光物质与抗体标记的摩尔比例为1：1～20：1。
5.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL HAV抗原，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/LNaCl、0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、0.1％～2％BSA、及0.1％～1％的浓度为10％的酪蛋白，pH6.0。
6.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，其特征在于，所述校准品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L；所述质控品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L。
7.一种权利要求1-6任意一项所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、R1试剂的制备
步骤1.1磁颗粒溶液的洗涤
取磁颗粒溶液，加入包被缓冲液稀释，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入包被缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；
步骤1.2磁颗粒的活化过程
取洗涤好的磁颗粒，分次加入含EDC的活化缓冲液中，边加边混匀，加完后，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；在活化好的磁颗粒沉淀中加入包被缓冲液；
步骤1.3甲型肝炎病毒抗体的包被
取活化好的磁颗粒，加入甲型肝炎病毒抗体，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行包被；
步骤1.4封闭
向上述包被物中，加入封闭缓冲液，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行封闭；将封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀；再加入包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒，再加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放；
步骤1.5R1试剂的制备
取上述步骤1.4制备的固相中间品和试剂缓冲液，配制成磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R1试剂；
步骤2、R2试剂的制备
步骤2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体的制备：
取甲型肝炎病毒抗体，超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心，然后加入化学发光物质原液，混匀后进行标记；标记反应结束后，加入封闭缓冲液，进行封闭；封闭后超滤离心，除去未偶联的化学发光物质，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制；
步骤2.2、R2试剂的制备
取上述步骤2.1中制备的中间品和试剂缓冲液，配制成化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，即为R2试剂；
步骤3、R3试剂的制备
取HAV抗原母液，使用缓冲液配置配制成R3试剂；
步骤4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备
配制高、低浓度的校准品，及高、低浓度的质控品。
8.根据权利要求7所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，R1试剂的制备中：采用pH 6.5的20mM磷酸缓冲液为活化缓冲液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；pH 7.0的磷酸缓冲液为包被缓冲液，包被温度25℃，包被时间12h；pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液，封闭温度25℃，封闭时间2h。
9.根据权利要求7所述的甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，R2试剂的制备中：标记的温度为37℃，时间为4h；封闭的时间为1h。
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