CN113075402A - 一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，属于化学发光体外诊断技术领域。本发明的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，包括：R1试剂为链酶亲和素磁微粒，R2试剂为化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD、化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物，R3试剂为生物素标记的ACE2，校准品和质控品。本发明的试剂盒采用竞争法检测新型冠状病毒中和抗体，通过RBD蛋白‑hACE2蛋白相互作用模拟病毒与宿主的相互作用，检测结果完全可以代表新型冠状病毒中和抗体结果。本发明的试剂盒采用直接化学发光法进行检测，成本较低，且无放射性污染，试剂种类少方便运输，操作简单，检测速度快，可满足实现医院大规模临床样本检测需求。

Description

一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒
技术领域
本发明属于化学发光体外诊断技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒属于冠状病毒β属，是单链RNA病毒，可引起急性呼吸道疾病(coronavirus disease-2019，COVID-19)。2019-nCoV具有多种结构蛋白，包括棘突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。在这些蛋白质中，棘突蛋白和核衣壳蛋白是主要的免疫原。S蛋白是一种主要的保护性抗原，能诱导产生高效的中和抗体(NAbs)，在病毒的附着、融合、进入和传播中起着重要作用。S蛋白包含负责病毒与受体结合的N末端S1亚单位和负责病毒与细胞膜融合的C末端S2亚单位。S1亚单位又分为N末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)。S1的RBD直接与宿主受体相互作用，人血管紧张素转化酶2(hACE2)是2019-nCoV进入宿主受体细胞的关键受体。感染2019-nCoV引发免疫反应产生抗体，并非所有抗体都能阻断2019-nCoV侵入宿主细胞并进行复制。能阻断病毒细胞浸入和复制的抗体亚群称为NAbs。S1亚单位内的RBD是2019-nCoV-NAbs最关键的靶点。因此，人血中的2019-nCoV-NAbs水平与从2019-nCoV感染中恢复的个体的保护性免疫应答相关，也反映了人群群体免疫水平，为过去或正在进行的COVID-19感染患者的临床管理提供信息。然而，中和抗体的产生需要多长时间，以及它们是否总是在2019-nCoV感染后产生，目前尚不清楚。目前中国专利202010919164.X提供一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒，ELISA检测方法需要封闭、显色和终止等操作步骤和相关试剂，检测时间较长，人工操作步骤复杂，试剂种类多不利于运输。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，本发明的试剂盒采用直接化学发光法进行检测，成本较低，且无放射性污染，试剂种类少方便运输，操作简单，检测速度快，可满足实现医院大规模临床样本检测需求。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；
所述R1试剂为链酶亲和素磁微粒；
所述R2试剂为化学发光物质标记的新型冠状病毒S(棘突)蛋白RBD(受体结合结构域)；所述化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；
所述R3试剂为生物素标记的ACE2(血管紧张素转化酶2)。
在上述技术方案中，优选的是：所述R1试剂的链酶亲和素磁微粒，粒径为1～3μm，试剂缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5。
在上述技术方案中，进一步优选的是：所述R1试剂的浓度为0.072％。
在上述技术方案中，优选的是：所述R2试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD；试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.01％～0.2％NaCl，0.01％～1％Tween-20，0.1％～0.3％proclin-300，0.01％～0.2％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％～2％BGG，0.1％～5％BSA，0.1％～2％酪蛋白，pH6.0。
在上述技术方案中，优选的是：所述R2试剂中化学发光物质与新型冠状病毒S蛋白RBD的标记摩尔比例为1：1～10：1。
在上述技术方案中，进一步优选的是：所述R2试剂为化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD，浓度为1.0μg/mL，化学发光物质为吖啶酯，化学发光物质与新型冠状病毒S蛋白RBD的摩尔比为3：1；试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.2％proclin-300，0.1％NaN3，2mmol/LEDTA*2Na，1％BGG，2％BSA，0.5％酪蛋白，pH6.0。
在上述技术方案中，优选的是：所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL生物素标记的ACE2；试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.01％～0.2％NaCl，0.01％～1％Tween-20，0.01％～0.3％proclin-300，0.01％～0.2％NaN3，1～5mmol/LZnCl2，0.05～0.2μg/mLACE2抑制剂，0.1％～2％BGG，0.1％～5％BSA，pH7.4。
在上述技术方案中，进一步优选的是：所述R3试剂浓度为0.7μg/mL，生物素：ACE2摩尔比为5：1；试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，2mmol/L ZnCl2，0.1μg/mLACE2抑制剂，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
在上述技术方案中，优选的是：所述R3试剂中的ACE2抑制剂，包括(1)含有巯基(SH)的巯甲丙脯酸，(2)含有羧基(COO-)的苯酯丙脯氨酸、雷米普利、培哚普利、贝那普利，(3)含有膦酸基(POO-)的福辛普利；所述ACE2抑制剂为以上ACE2抑制剂的一种或多种。其中，优选巯甲丙脯酸和/或苯酯丙脯氨酸。
本发明的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒用于新型冠状病毒中和抗体检测时，先测试产品校准品，校准合格后再测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为试剂质控合格。质控合格后开始测试样本，根据样本发光值计算样本浓度。
这种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成新型冠状病毒中和抗体的检测。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒使用链酶亲和素磁微粒—生物素—吖啶酯体系，竞争法检测血清、血浆中新型冠状病毒中和抗体。本发明的试剂盒旨在通过直接RBD蛋白-hACE2蛋白相互作用模拟病毒与宿主的相互作用。这种高度特异性的相互作用，与传统的病毒中和试验(VNT)相同。本发明不应用于诊断急性2019-nCoV感染。具体优点如下：
1、本发明采用竞争法检测新型冠状病毒中和抗体，通过RBD蛋白-hACE2蛋白相互作用模拟病毒与宿主的相互作用，检测结果完全可以代表新型冠状病毒中和抗体结果。
2、本发明通过在R3试剂中添加稳定剂，稳定了ACE2的结构，有效地改善了试剂盒的稳定性。所述的稳定剂为ACE2抑制剂和Zn2+，既稳定了ACE2的结构，又不影响ACE2与RBD结合，在确保试剂性能的同时，提高了检测试剂的稳定性。
3、与新型冠状病毒中和抗体免疫层析检测试剂相比，具有更高的灵敏度，检出率更高。
4、本发明采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。
5、本发明的试剂盒可直接用于全自动化学法光免疫分析仪上，无需大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附表和具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例一
新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒的制备及稳定性评估：
1、R1试剂的制备
取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入TBST溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用磁珠稀释缓冲液稀释后得到链霉亲和素磁微粒溶液，浓度为0.072％。
2、R2试剂的制备
2.1化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD的制备：
取0.5mg新型冠状病毒S蛋白RBD，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。原材料缓冲液为20mMPB pH 7.4，0.01％SDS；标记缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/LNaCl，pH6.0。
按照吖啶酯：新型冠状病毒S蛋白RBD摩尔比为3：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH6.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。
2.2、R2试剂的配制：
取上述2.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成新型冠状病毒S蛋白RBD浓度为1.0μg/mL的R2试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20、0.2％proclin-300，0.1％NaN3、2mmol/L EDTA*2Na，1％BGG、2％BSA、0.5％酪蛋白，pH6.0。
3、R3试剂的制备：
3.1生物素标记的ACE2的制备
取0.5mgACE2，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。标记缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，pH8.0。
按照生物素：ACE2摩尔比为5：1，加入生物素原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。
封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制。
3.2、R3试剂的配制：
取上述3.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成ACE2浓度为0.7μg/mL的R3试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
4、试剂盒高温稳定性评估
将配制好的3盒新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，规格100测/盒，分别用于零时间测试、7天2-8℃测试和7天高温测试。零时间测试是指配好试剂盒以后，直接进行主校准品测试；7天2-8℃测试是指将配好的试剂盒置于2-8℃保存7天后进行主校准品测试；7天高温测试是指将配好的试剂盒置于37℃条件下进行高温7天加速试验后进行主校准品测试。将7天高温测试的光量子数分别与零时间测试光量子数、7天2-8℃测试光量子数比较，计算衰减率。结果如下表所示：
7d高温总结
Figure BDA0002983715120000071
由上表可知，当R3试剂中未添加2mmol/L ZnCl2和0.1μg/mL巯甲丙脯酸时，进行高温加速试验(37℃条件下放置7天相当于2～8℃储存一年)，试剂光量子数衰减约为60％，不符合标准(衰减＜15％)要求。
实施例二
新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒的制备及稳定性评估：
1、R1试剂的制备
取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入TBST溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用磁珠稀释缓冲液稀释后得到链霉亲和素磁微粒溶液，浓度为0.072％。
2、R2试剂的制备
2.1化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD的制备：
取0.5mg新型冠状病毒S蛋白RBD，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。原材料缓冲液为20mMPB pH 7.4，0.01％SDS；标记缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/LNaCl，pH6.0。
按照吖啶酯：新型冠状病毒S蛋白RBD摩尔比为3：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH6.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。
2.2、R2试剂的制备：
取上述2.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成新型冠状病毒S蛋白RBD浓度为1.0μg/mL的R2试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.2％proclin-300，0.1％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，1％BGG，2％BSA，0.5％酪蛋白，pH6.0。
3、R3试剂的制备：
3.1生物素标记的ACE2的制备
取0.5mgACE2，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。标记缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，pH8.0。
按照生物素：ACE2摩尔比为5：1，加入生物素原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。
封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制。
3.2、R3试剂的制备：
取上述3.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成ACE2浓度为0.7μg/mL的R3试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，2mmol/L ZnCl2，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
4、试剂盒高温稳定性评估
将配制好的3盒新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，规格100测/盒，分别用于零时间测试、7天2-8℃测试和7天高温测试。将7天高温测试的光量子数分别与零时间测试光量子数、7天2-8℃测试光量子数比较，计算衰减率。结果如下表所示：
7d高温总结
Figure BDA0002983715120000091
由上表可知，当R3试剂中添加2mmol/L ZnCl2而不添加0.1μg/mL巯甲丙脯酸时，进行高温加速试验，试剂光量子数衰减约为60％，不符合标准要求。
实施例三
新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒的制备及稳定性评估：
1、R1试剂的制备
取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入TBST溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用磁珠稀释缓冲液稀释后得到链霉亲和素磁微粒溶液，浓度为0.072％。
2、R2试剂的制备
2.1化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD的制备：
取0.5mg新型冠状病毒S蛋白RBD，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。原材料缓冲液为20mMPB pH 7.4，0.01％SDS；标记缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/LNaCl，pH6.0。
按照吖啶酯：新型冠状病毒S蛋白RBD摩尔比为3：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH6.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。
2.2、R2试剂的配制：
取上述2.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成新型冠状病毒S蛋白RBD浓度为1.0μg/mL的R2试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.2％proclin-300，0.1％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，1％BGG，2％BSA，0.5％酪蛋白，pH6.0。
3、R3试剂的制备：
3.1生物素标记的ACE2的制备
取0.5mgACE2，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。标记缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，pH8.0。
按照生物素：ACE2摩尔比为5：1，加入生物素原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。
封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制。
3.2、R3试剂的制备：
取上述3.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成ACE2浓度为0.7μg/mL的R3试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，0.1μg/mL巯甲丙脯酸，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
4、试剂盒高温稳定性评估
将配制好的3盒新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，规格100测/盒，分别用于零时间测试、7天2-8℃测试和7天高温测试。将7天高温测试的光量子数分别与零时间测试光量子数、7天2-8℃测试光量子数比较，计算衰减率。结果如下表所示：
7d高温总结
Figure BDA0002983715120000111
Figure BDA0002983715120000121
由上表可知，当R3试剂中不添加2mmol/L ZnCl2而添加0.1μg/mL巯甲丙脯酸时，进行高温加速试验，试剂光量子数衰减约为25％，不符合标准要求。
实施例四
新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒的制备及稳定性评估：
1、R1试剂的制备
取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入TBST溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用磁珠稀释缓冲液稀释后得到链霉亲和素磁微粒溶液，浓度为0.072％。
2、R2试剂的制备
2.1化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD的制备：
取0.5mg新型冠状病毒S蛋白RBD，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。原材料缓冲液为20mMPB pH 7.4，0.01％SDS；标记缓冲液为100mmol/L PB，150mmol/LNaCl，pH6.0。
按照吖啶酯：新型冠状病毒S蛋白RBD摩尔比为3：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH6.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。
2.2、R2试剂的配制：
取上述2.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成新型冠状病毒S蛋白RBD浓度为1.0μg/mL的R2试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.2％proclin-300，0.1％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，1％BGG，2％BSA，0.5％酪蛋白，pH6.0。
3、R3试剂的制备：
3.1生物素标记的ACE2的制备
取0.5mgACE2，用10KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min。标记缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，pH8.0。
按照生物素：ACE2摩尔比为5：1，加入生物素原液，混匀，37℃，标记4h。
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h。
封闭缓冲液为100mmol/LPB，150mmol/LNaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用10KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制。
3.2、R3试剂的配制：
取上述3.1中制备的中间品适量和试剂缓冲液，配制成ACE2浓度为0.7μg/mL的R3试剂。所述试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，2mmol/L ZnCl2，0.1μg/mL巯甲丙脯酸，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
4、试剂盒高温稳定性评估
将配制好的3盒新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，规格100测/盒，分别用于零时间测试、7天2-8℃测试和7天高温测试。将7天高温测试的光量子数分别与零时间测试光量子数、7天2-8℃测试光量子数比较，计算衰减率。结果如下表所示：
7d高温总结
Figure BDA0002983715120000141
由上表可知，当R3试剂中添加2mmol/L ZnCl2和0.1μg/mL巯甲丙脯酸时，进行高温加速试验，试剂光量子数衰减＜5％，符合标准要求。
实施例五
新型冠状病毒中和抗体校准品、质控品的制备：
取新型冠状病毒中和抗体，用校准品基质稀释成150AU/mL，作为高值校准品。
取校准品基质赋值结果为0AU/mL，作为低值校准品。
取新型冠状病毒中和抗体，用质控品基质稀释成8AU/mL，作为阳性质控品。
取质控品基质赋值结果为0AU/mL，作为阴性质控品。
实施例六
新型冠状病毒中和抗体企业参考品的制备：
1.设计依据
新型冠状病毒中和抗体企业参考品设计方案是根据新型冠状病毒IgG抗体检测试剂(酶免法)国家参考品、新型冠状病毒IgG抗体检测试剂国家参考品、新型冠状病毒IgM抗体检测试剂(酶免法)国家参考品、新型冠状病毒IgM抗体检测试剂国家参考品、2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点(试行)为依据设计的。
2.设计目的
本品由新型冠状病毒中和抗体阴性参考品和阳性参考品组成，适用于迪瑞新型冠状病毒中和抗体诊断试剂(化学发光免疫分析法)的质量评价。
3.设计内容
3.1阴性参考品：用于控制诊断试剂的特异性。由25支阴性样本组成，其中纳入冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒(Yamagata、Victoria)抗体、副流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体、腺病毒抗体、EB病毒抗体、麻疹病毒抗体、人巨细胞病毒抗体、腮腺炎病毒抗体、水痘-带状疱疹病毒抗体、肺炎支原体抗体、肺炎衣原体抗体、风疹病毒抗体、弓形虫抗体、单纯疱疹病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、丙肝病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、获得性免疫缺陷病毒抗体、抗核抗体、HAMA样本。以上干扰及特异性样本需经相应检测试剂盒进行确认后使用，每种样本一份。
3.2阳性参考品：用于控制诊断试剂对新型冠状病毒中和抗体的检出能力。由10支强、中、弱阳性样本组成，以新型冠状病毒中和抗体试剂浓度范围进行设定，见下表。
表1新型冠状病毒中和抗体企业阳性参考品浓度范围
编号 测值范围(AU/mL) 编号 测值范围(AU/mL)
P1 3.1～10 P6 10～100
P2 3.1～10 P7 100～300
P3 3.1～10 P8 100～300
P4 10～100 P9 300～600
P5 10～100 P10 300～600
3.3最低检测限参考品：用于控制诊断试剂的最低检测量，由10份样本组成，设置L1浓度为128±10％AU/mL，进行2倍稀释，依次共完成10个稀释系列，将10个稀释梯度的样本依次标记为L1～L10，其中包含检测限水平(0.45～0.55AU/mL)。
3.4精密性参考品：用于控制诊断试剂的精密性。由3支样本组成，其中包含阴性、弱阳性(5～10AU/mL)、及中等阳性(10～50AU/mL)样本，依次标记为J1、J2、J3。
3.5参考品规格：
(1)阴性参考品25支，0.5mL/支；
(2)阳性参考品10支，0.5mL/支；
(3)最低检测限参考品10支：0.5mL/支；
(4)精密性参考品3支，1mL/支；
注：配制前，需将样本进行灭活处理，灭活条件60℃水浴1小时。
4.检测标准
4.1阴性参考品符合率25支阴性参考品检测符合率(-/-)为25/25。
4.2阳性参考品符合率10支阳性参考品检测符合率(+/+)为10/10。
4.3最低检测限:≤0.5AU/mL。
4.4精密性参考品(J1、J2、J3)，分别平行检测10次，其中J1结果应均为阴性，J2、J3结果为阳性，浓度值的变异系数(CV)应均不大于10％。
5储藏条件
置于-70℃或以下条件下保存。
6注意事项
6.1本参考品应按有传染性物品处理，应根据我国针对新型冠状病毒相关生物安全性的法律法规、指南、标准等进行操作和处理。
6.2根据验证结果，判定企业参考品稳定性。
实施例七
实施例4制备的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒性能评估：
新型冠状病毒中和抗体企业参考品测试
(1)阴性参考品符合率
用制备的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体企业阴性参考品，结果如表3：
表3新型冠状病毒中和抗体企业阴性参考品检测结果
Figure BDA0002983715120000171
Figure BDA0002983715120000181
(2)阳性参考品符合率
用配制的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体企业阳性参考品，结果如表4：
表4新型冠状病毒中和抗体企业阳性参考品检测结果
Figure BDA0002983715120000182
(3)最低检测限
用配制的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体企业最低检测限参考品，结果如表5：
表5新型冠状病毒中和抗体最低检测限参考品检测结果
Figure BDA0002983715120000191
(4)精密度
用配制的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体精密度参考品，重复检测10次，计算10次测量结果的平均值
Figure BDA0002983715120000192
和标准差SD，根据公式(1)计算变异系数(CV)。
Figure BDA0002983715120000193
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
Figure BDA0002983715120000194
—测量结果的平均值
表6新型冠状病毒中和抗体精密度参考品检测结果
Figure BDA0002983715120000195
Figure BDA0002983715120000201
实施例八
实施例4制备的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒检测方法：
以全自动化学发光免疫分析仪(型号：CM-180、CM-320、CM-320i)或模块化生化免疫分析系统(型号：CSM-8000)为检测工具，方法学模式为竞争法，样本量50μL，R1试剂量40μL，R2试剂量50μL，R3试剂量50μL。反应杯中加入样本50μL，再加入R2试剂50μL，孵育10min；加入R1试剂40μL和R3试剂50μL，孵育10min，洗涤。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光激发液A液(HNO3+H2O2溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应，最后记录相对发光强度(RLU)。根据仪器内射频卡内的公式将检测出的相对发光强度(RLU)带入计算浓度值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；
所述R1试剂为链酶亲和素磁微粒；
所述R2试剂为化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD；所述化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物；
所述R3试剂为生物素标记的ACE2。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的链酶亲和素磁微粒，粒径为1～3μm，试剂缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的浓度为0.072％。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL化学发光物质标记的新型冠状病毒S蛋白RBD；试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.01％～0.2％NaCl，0.01％～1％Tween-20，0.1％～0.3％proclin-300，0.01％～0.2％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％～2％BGG，0.1％～5％BSA，0.1％～2％酪蛋白，pH6.0。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中化学发光物质与新型冠状病毒S蛋白RBD的标记摩尔比例为1：1～10：1。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的浓度为1.0μg/mL，化学发光物质为吖啶酯，化学发光物质与新型冠状病毒S蛋白RBD的摩尔比为3：1；试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.2％proclin-300，0.1％NaN3，2mmol/L EDTA*2Na，1％BGG，2％BSA，0.5％酪蛋白，pH6.0。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL生物素标记的ACE2；试剂缓冲液为100mmol/L PB，0.01％～0.2％NaCl，0.01％～1％Tween-20，0.01％～0.3％proclin-300，0.01％～0.2％NaN3，1～5mmol/LZnCl2，0.05～0.2μg/mLACE2抑制剂，0.1％～2％BGG，0.1％～5％BSA，pH7.4。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，R3试剂浓度为0.7μg/mL，生物素：ACE2摩尔比为5：1；试剂缓冲液为100mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，0.05％proclin-300，0.02％NaN3，2mmol/L ZnCl2，0.1μg/mLACE2抑制剂，0.1％BGG，0.1％BSA，pH7.4。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R3试剂中ACE2为巯甲丙脯酸、苯酯丙脯氨酸、雷米普利、培哚普利、贝那普利和福辛普利中的一种或者多种。
10.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R3试剂中ACE2为巯甲丙脯酸和/或苯酯丙脯氨酸。
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