CN111595984B - 一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蚁酸检测技术领域，提供了一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法，通过选用异丙醇作为提取剂及反应剂进行酯化反应，使反应充分，且各物质间几乎无干扰，从而提高测试方法的准确性；同时用浓硫酸和对甲基苯磺酸共同作为酯化反应的催化剂，避免了单一选用浓硫酸作为催化剂时，因反应剧烈而导致磺化、碳化或聚合等副反应发生；解决了单一选用对甲基苯磺酸时甲酸异丙酯选择性差，反应速率过慢的问题，通过二者配合使用，反应速率适中，同时提高了产物甲酸异丙酯的转化率，进一步提升了测试结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及蚁酸检测技术领域，尤其涉及一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法。
背景技术
蚂蚁中富含蚁酸(又称作甲酸，分子式为HCOOH)，蚁酸具有靶向性抗风湿因子，对风湿性、类风湿性关节炎有确切的疗效，所以将蚂蚁作为重要原料制成的多种单方或复方制剂的中药或者保健食品，深受广大消费者的喜爱。针对蚂蚁的广泛应用，其蚁酸的含有量也成为衡量蚂蚁制品质量的重要指标之一。
目前对蚁酸检测的方法主要有：蒸馏法、离子色谱法和气相色谱法。但是蒸馏法制备过程复杂，实验耗时长；离子色谱测试的仪器造价高昂；虽然气相色谱法，相比蒸馏法耗时短，相比离子色谱法仪器便宜，但是存在以下问题：其所用衍生剂为乙醇，其中乙醇分子量小，沸点低，导致其出峰时间早，很容易被干扰，不易于分离检测，对结果的准确性影响比较大。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法。本发明提供的方法准确性高、检出限低。
本发明提供了一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)将蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸混合，得到混合溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的混合溶液进行酯化衍生后进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量；
所述步骤(2)中的酯化衍生和气相色谱分析均在气相色谱仪中进行。
优选地，所述步骤(1)中蚂蚁制品为固体时，所述蚂蚁制品的粒度为 40目以上。
优选地，所述步骤(1)中蚂蚁制品的质量和异丙醇的体积的比值为 (0.002～0.04)g/mL。
优选地，所述步骤(1)中异丙醇和浓硫酸的体积比为(15～20):1。
优选地，所述步骤(1)中对甲基苯磺酸的质量和异丙醇的体积比为 (0.8～1.2)mg/mL。
优选地，所述步骤(2)中酯化衍生的温度为70～100℃，酯化衍生的时间为20～40min。
优选地，所述步骤(2)中酯化衍生的温度为80～90℃，酯化衍生的时间为25～35min。
优选地，所述步骤(2)中气相色谱分析的条件包括：色谱柱为 HP-INNOWAX毛细柱或等效柱；升温方式为程序升温；载气为氮气，流速为0.8～2.0mL/min，尾吹流速为15～30mL/min；氢气流速为30～40mL/min；空气流速为300～400mL/min；进样口温度为200～220℃，检测器温度250℃；进样方式：分流进样。
优选地，所述程序升温具体为：初始温度50℃，保持4min，以20℃/min 的速率升至180℃，保持5min。
优选地，所述分流进样的分流比为(5～50)：1，进样量为0.1～1mL。
本发明提供了一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法，首先将蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸混合，得到混合溶液；然后将得到的混合溶液进行酯化衍生后进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量；所述的酯化衍生和气相色谱分析均在气相色谱仪中进行。本发明通过选用异丙醇作为提取剂及反应剂进行酯化反应，使反应充分，且各物质间几乎无干扰，从而提高测试方法的准确性；同时将浓硫酸和对甲基苯磺酸共同作为酯化反应的催化剂，避免了单一选用硫酸作为催化剂时，因反应剧烈而导致磺化、碳化或聚合等副反应发生；解决了单一选用对甲基苯磺酸时甲酸异丙酯选择性差，反应速率过慢的问题，通过二者配合使用，反应速率适中，同时提高了产物甲酸异丙酯的转化率，进一步提升了测试结果的准确性。实验结果表明，利用本发明提供的方法对蚂蚁制品中蚁酸进行测试，准确性：低浓度：95.9％，RSD：3.1％；中浓度：94.1％，RSD：3.2％；高浓度：91.5％，RSD：2.2％；检出限为：0.0070 mg/kg。
附图说明
图1为本发明实施例1中对照品进行线性测试时，甲酸异丙酯信号值和对照品测试量关系的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)将蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸混合，得到混合溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的混合溶液进行酯化衍生后进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量；
所述步骤(2)中的酯化衍生和气相色谱分析均在气相色谱仪中进行。
在本发明中，若无特殊说明，所采用的原料均为本领域常规市售产品。
本发明提供的检测方法适用于本领域技术人员熟知的各种蚂蚁制品，包括但不限于将蚂蚁作为重要原料制成的中药或者保健食品。当所述蚂蚁制品为固体时，本发明优选将所述蚂蚁制品研磨成粒度为40目以上。本发明将固体蚂蚁制品进行研磨，主要是为了溶剂和蚂蚁制品中的蚁酸进行充分接触进行反应。当蚂蚁制品为液体时，无需特殊处理，直接测试即可。
本发明将蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸混合，得到混合溶液。在本发明中，所述浓硫酸的浓度达到本领域技术人员熟知的浓硫酸的标准即可，即硫酸溶液中硫酸的质量浓度≧70％。在本发明实施例中优选几乎无水存在的浓硫酸，因所用浓硫酸中无水，提高实验过程中的安全性。
本发明对每次检测使用的蚂蚁制品的用量没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测样品的用量即可。在本发明中，所述蚂蚁制品的用量优选为0.02～0.2g。
在本发明中，所述蚂蚁制品的质量和异丙醇的体积的比优选为 (0.02～0.04)g/mL，更优选为(0.02～0.03)g/mL。在本发明中，所述异丙醇和浓硫酸的体积比优选为(15～20):1，更优选为(16.7～18):1。在本发明中，所述对甲基苯磺酸的质量和异丙醇的体积比优选为(0.8～1.2)mg/mL，更优选为(1.0～1.1)mg/mL。在本发明中，采用上述物料关系，可以实现蚂蚁制品中蚁酸的充分反应，提高测试结果的准确性。
本发明对所述蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸混合的操作没有特殊规定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中，所述蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸的混合优选在顶空瓶中进行。
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液进行酯化衍生后进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量。在本发明中，所述酯化衍生和气相色谱分析均在气相色谱仪中进行。本发明优选将装有所述混合溶液的顶空瓶转移至气相色谱的顶空箱中进行酯化衍生，酯化衍生完成后，待顶空瓶中达到气液相平衡时，顶空进样，进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量。本发明待酯化衍生完成后，顶空瓶中达到气液相平衡时，顶空进样，进行气相色谱分析，使酯化衍生和气相顶空平衡相结合，可以缩短反应时间，提高反应速率。
在本发明中，所述酯化衍生的温度优选为70～100℃，更优选为80～90℃。在本发明中，所述酯化衍生的时间优选为20～40min，更优选为25～35min。本发明采用上述酯化衍生条件，可以进一步提高蚁酸的转化率，提高测试结果的准确性。
在本发明中，所述气相色谱分析优选包括内标法或外标法，更优选为外标法。本发明选用外标法，可以避免气相色谱分析使用的对照品和待测样品同时反应，降低其对测试结果准确性的影响。
本发明对所述对照品的配制方法没有特殊规定，采用本领域技术人员熟知的气相色谱测试时，对照品配制的技术方案即可。本发明对所述蚁酸照品的浓度没有特殊规定，采用本领域技术人员熟知的对照品浓度即可，在本发明实施例中，所述蚁酸对照品的浓度优选为1mg/mL。本发明对所述对照品的选取量没有特殊规定，采用本领域技术人员熟知的对照品选用量即可，在本发明实施例中，所述对照品的选用量优选为0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5和0.6mL。
在本发明中，所述气相色谱分析的条件优选包括：色谱柱为 HP-INNOWAX毛细柱或等效柱，更优选为HP-INNOWAX毛细柱；在本发明中，所述HP-INNOWAX毛细柱的规格优选为60m×0.250mm×0.5μm。本发明选用上述规格的毛细柱分离效果最佳。升温方式为程序升温；载气为氮气，流速为0.8～2.0mL/min，更优选为1.0～1.5mL/min；尾吹流速为15～30mL/min，更优选为20～25mL/min；氢气流速为30～40mL/min，更优选为 32～35mL/min；空气流速为300～400mL/min，更优选为320～370mL/min；进样口温度为200～220℃，更优选为210～215℃；检测器温度250℃；进样方式为分流进样。
在本发明中，所述程序升温优选为：初始温度50℃，保持4min，以20℃/min的速率升至180℃，保持5min。在本发明中，所述分流进样的分流比优选为(5～50)：1，更优选为(10～15)：1；在本发明中，所述分流进样的进样量优选为0.1～1mL，更优选为0.5～0.8mL。本发明采用上述气相色谱分析的条件进行测试，得到的测试结果更加准确。
本发明在选用气相色谱对蚂蚁制品中的蚁酸进行测试时，通过选用异丙醇作为提取剂及反应剂进行酯化反应，使反应充分，且各物质间几乎无干扰，从而提高测试方法的准确性；同时将浓硫酸和对甲基苯磺酸共同作为酯化反应的催化剂，反应速率适中，同时提高了产物甲酸异丙酯的转化率，进一步提升了测试结果的准确性。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
原料：
蚂蚁粉(山西昇力元生物科技有限公司批号分别为LY-03-18-04，事先对其进行过40目筛处理)，甲酸(色谱纯)，异丙醇(色谱纯)，浓硫酸(几乎无水存在)，对甲基苯磺酸(分析纯)。
主要仪器：
气相色谱质谱仪(带氢火焰检测器，简称FID)。
测试步骤如下：
对照品溶液的配制：
称取甲酸(又名蚁酸)对照品10mg，用异丙醇作为溶剂，配制成1mg/mL 的对照品溶液，作为对照品储备溶液。
气相色谱条件为：色谱柱：HP-INNOWAX(60m×0.250mm×0.5μm)；程序升温：初始温度50℃，保持4min，以20℃/min的速率升至180℃，保持 5min；载气：氦气(纯度≥99.99％)，流速1.0mL/min，尾吹15mL/min；氢气40mL/min；空气400mL/min；进样口温度：215℃；检测器250℃；进样方式：分流进样，分流比10：1，进样量0.5mL。
对照品测试：分别精密量取对照品储备溶液0、0.02、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6mL，分别置于20mL的顶空瓶中，再向顶空瓶中分别对应依次加入异丙醇5mL，浓硫酸0.3mL，对甲基苯磺酸5mg，分别将装有待测物的顶空瓶置于气相色谱仪顶空箱中，将气相色谱仪顶空箱的温度设置为 85℃，振荡平衡30min，进行测试。
待测样品测试：称取待测样品约0.1g置于20mL的顶空瓶中，再向顶空瓶中依次加入异丙醇5mL，浓硫酸0.3mL，对甲基苯磺酸5mg，其中蚂蚁制品的质量和异丙醇的体积的比值为0.02mg/mL，异丙醇和浓硫酸的体积比为 50:3，对甲基苯磺酸的质量和异丙醇的体积比为1mg/mL；将装有待测物的顶空瓶置于气相色谱仪顶空箱中，将气相色谱仪顶空箱的温度设置为85℃，振荡平衡30min，进行测试。
分析方法：外标法。
对本发明提供的测试方法进行专属性、精密度、线性相关性、重复性、准确性(3个浓度的梯度回收实验)、定量限及检出限进行验证。
(1)专属性测试
顶空瓶中不加样品，精密加入5mL异丙醇、0.3mL浓硫酸和5mg对甲基苯磺酸，采用实施例1提供的测试条件进行测试，色谱结果显示在与甲酸异丙酯相同保留时间处无吸收峰。说明本申请提供的技术方案可以对蚂蚁制品中的蚁酸利用异丙醇衍生法进行专项测试。
(2)线性相关性测试
精密称取甲酸(又名蚁酸)对照品1mg(实际称量结果为1.0016mg)，用异丙醇作为溶剂，配制成1.0016mg/mL的对照品溶液，分别精密量取对照品储备溶液0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，采用实施例提供的测试条件进行测试。测试结果见表1，绘制成的标准曲线见图1。
表1线性相关性测试数据
从表1可以看出线性相关系数R＝0.9992，说明本发明提供异丙醇衍生方法线性相关性较好。
(3)精密度测试
称取待测样品约0.1g置于20mL的顶空瓶中，按照实施例1提供的方法进行测试，测试结果见表2。
表2精密度测试数据
从表2可以看出利用本发明提供的测试方法对蚁酸含量进行测试时，标准偏差只有2％，说明本发明提供测试方法精密度较高。
(4)重复性测试
精密称取约0.1g蚂蚁粉6份，分别置于20mL的顶空瓶中，按照实施例 1提供的方法进行测试，测试结果见表3。
表3重复测试数据
从表3可以看出利用本发明提供的测试方法对蚁酸含量进行重复性测试时，均值为2.94mg/g，标准偏差只有2.9％，说明本发明提供测试方法重复性较好。
(5)准确性测试
精密称取蚂蚁粉18份(每份约0.05g)，分为3组，每组6份，分别置顶空瓶中，向每组顶空瓶的样品中分别对应的加入0.075、0.15、0.225mL的蚁酸(甲酸)对照品溶液(浓度为：1.0016mg/mL)，组成梯度回收溶液，按照实施例1提供的方法进行测试，测试结果见表4。
表4准确性测试数据
样品含量mg＝取样量*重复性均值；
加入蚁酸量mg＝加入体积*蚁酸对照品浓度；
回收率％＝(测得量-样品含量)/加入量*100％。
从表4可以看出，在对多组数据进行测试时，当加入蚁酸量为小于0.1mg 的低浓度时：回收率均值为95.9％，RSD为3.1％；当加入蚁酸量为大于0.1 小于0.2mg的中浓度时：回收率均值为94.1％，RSD为3.2％；当加入蚁酸量为大于0.2mg的高浓度时：回收率均值为91.5％，RSD为2.2％，说明利用本发明提供的测试方法可以实现对不同浓度蚁酸含量的进行准确测试。
(6)检出限和定量限测试
以对照品溶液稀释测定作为检出限及定量限：取甲酸对照品溶液(浓度为：1.0016mg/mL)，用异丙醇稀释为1.0016μg/mL对照品使用液，取0.7mL，依照实施例1提供的方法进行测试，作为检出限，以称样量0.1g计，检出限为0.0070mg/g；再取2.0mL依照实施例1提供的方法进行测试，作为定量限，以称样量0.1g计，定量限为0.020mg/g。说明本发明提供的测试方法可以实现0.0070mg/g以上浓度的蚁酸的蚁酸实现检出，对浓度高于0.020mg/g实现定量检测。
对(1)～(6)项目测试结果进行汇总，汇总结果见表6
(1)～(6)项目测试结果
上述结果均满足GB/T 27404-2008的相关要求。
将本发明提供的方法和测试结果较为准确的离子色谱法进行比较：
对比例1
称取山西昇力元生物科技有限公司批号为E-10206的蚂蚁粉(事先对其进行过40目筛处理)0.1g，按实施例1提供的方法进行蚁酸含量测试；
称取山西昇力元生物科技有限公司批号为E-10206的蚂蚁粉0.5g，按常规技术中提供的高效离子色谱法进行蚁酸含量测试，本发明中高效离子色谱法具体方法如下：
高效离子色谱法：
主要仪器：离子色谱仪-包括电导检测器配有抑制器高容量阴离子交换柱；
色谱柱：IonPacAS11-HC，4*250mm(带F IonPacAG11-HC，4*50mm 保护柱)；自动淋洗液发生器，OH-型；抑制器:阴离子抑制器；检测器:电导检测器。
测试条件：
淋洗液：,KOH溶液，其中OH-浓度为0.8mmol/L～50mmol/L，洗脱梯度为0.8mmol/L18min，50mmol/L 5min，0.8mmol/L.5min；流速：1.0mL/ min；抑制器电流:124mA；检测池温度为35℃；柱温:30℃；进样量：100μL。待测样品测试：
I、提取，取粉碎过的试样5g(精确至0.01g，试样已过40目筛)、置于 250mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，超声10min，经滤纸过滤，待净化。
II、净化，取I步骤中所获得的提取液10mL，依次通过0.22um水性滤膜、固相萃取柱(RP，1.0mL)及固相萃取柱(Ag/H柱1.0mL)弃去前面 6mL，收集后面洗脱液待测。
III、测定，分别吸取样品溶液和标准溶液各100μL参差进样，在上述色谱条件按下测定标准溶液和样品溶液的响应值(峰高或峰面积)，得到甲酸盐标准溶液和样品溶液离子色谱图。经过与甲酸盐标准溶液谱图比较响应值得到试样中甲酸盐的浓度。
对比例2
测试方法和对比例1相同，区别仅在于蚂蚁粉为山西昇力元生物科技有限公司提供的蚂蚁粉，其批号为E-10207。
对比例3
测试方法和对比例1相同，区别仅在于蚂蚁粉为山西昇力元生物科技有限公司提供的蚂蚁粉，其批号为E-10208。
选用的E-10206-10208三批蚂蚁粉样品，分别采用本方法及离子色谱法分别进行测试的比较结果见表7。
表7本发明和离子色谱法测试结果
通过两种测定方法结果比较表明，三批样品的结果标准偏差≤1％，说明两种不同测定方法的结果进行很好的佐证，但相比高效离子色谱法的实验条件、处理过程、专属性、普及率以及对色谱条件的苛刻要求，本方法有很大的优越性及可推广性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种蚂蚁制品中蚁酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)将蚂蚁制品、异丙醇、浓硫酸和对甲基苯磺酸在顶空瓶中混合，得到混合溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的装有混合溶液的顶空瓶置于气相色谱仪顶空箱中，进行酯化衍生后进行气相色谱分析，得到蚁酸的含量；
所述步骤(2)中的酯化衍生和气相色谱分析均在气相色谱仪中进行；
所述步骤(1)中蚂蚁制品的质量和异丙醇的体积的比值为0.004～0.04g/mL；
所述步骤(1)中异丙醇和浓硫酸的体积比为15～20:1；
所述步骤(1)中对甲基苯磺酸的质量和异丙醇的体积比为0.8～1.2mg/mL；
所述步骤(2)中酯化衍生的温度为80～90℃，酯化衍生的时间为25～35min；
所述步骤(2)中气相色谱分析的条件包括：色谱柱为HP-INNOWAX毛细柱；升温方式为程序升温；载气为氮气，流速0.8～2.0mL/min，尾吹流速为15～30mL/min；氢气流速为30～40mL/min；空气流速为300～400mL/min；进样口温度为200～220℃，检测器温度250℃；进样方式：分流进样；所述检测器为氢火焰检测器；
所述程序升温具体为：初始温度50℃，保持4min，以20℃/min的速率升至180℃，保持5min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中蚂蚁制品为固体时，所述蚂蚁制品的粒度为40目以上。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分流进样的分流比为5～50：1，进样量为0.1～1mL。
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